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一个新的重组酶系统在转基因植物外源基因删除中的应用6

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一个新的重组酶系统在转基因植物外源基因删除中的应用6罗克明等:一个新的重组酶系统在转基因植物外源基因删除中的应用 一 个新的重组酶系统在转基因植物外源基因删除中的应用① 罗克明② “ 赵德刚““ Li Yi“ 裴 炎③ ( 西南大学生物技术中心 重庆 400716) (“贵州大学农业生物技术重点实验室 贵阳 55(xy25) (⋯ 康涅狄格州立大学植物学系,cr06269,USA) 摘 要 为了解决转基因植物可能带来的生物安全性问题,设计了一个新的位点特异性 重组酶系统pLFHFGN,该系统中重组酶 FI 基因由热激蛋 白Hspl8.2基因的启动子控制, 所有外...
一个新的重组酶系统在转基因植物外源基因删除中的应用6
罗克明等:一个新的重组酶系统在转基因植物外源基因删除中的应用 一 个新的重组酶系统在转基因植物外源基因删除中的应用① 罗克明② “ 赵德刚““ Li Yi“ 裴 炎③ ( 西南大学生物技术中心 重庆 400716) (“贵州大学农业生物技术重点实验室 贵阳 55(xy25) (⋯ 康涅狄格州立大学植物学系,cr06269,USA) 摘 要 为了解决转基因植物可能带来的生物安全性问了一个新的位点特异性 重组酶系统pLFHFGN,该系统中重组酶 FI 基因由热激蛋 白Hspl8.2基因的启动子控制, 所有外源基因(包括重组酶基因n 、GUS基因和 NVI'II筛选标记基因)都置于两个融 合识别位点 职 之间。将上述重组酶系统通过根癌农杆菌(Agrobaeterium tumefaciens) 介导转化烟草,获得的再生植株分别通过 GUS组织染色和 PCR分析等方法进行鉴定。然 后在 37℃下热激处理转基因植株,利用 GUS组织染色重组酶系统在转基因植株 Tl 代幼苗中删除外源基因的效率,结果显示,该系统删除效率达到了48.2%一84.9%,说明 通过重组酶系统 pLFHFGN能够有效地删除转基因植物中的外源基因,这为解决转基因植 物潜在的安全性问题提供了一条新的途径。 关键词 热激蛋白Hspl8.2,位点特异性重组酶系统,基因删除,转基因植物 0 引 言 尽管转基因植物已经给人类带来了巨大的利 益,但 目前仍有很多人对转基因技术的安全性心存 担忧,他们担心转基因植物可能对生态环境构成威 胁,转基因食品也可能对人类健康造成危害。因此, 为了消除人们的这种担忧,如何将转基因植物中已 经完成了预期功能的外源基因在特定阶段彻底删 除,已经成为近年来植物转基因研究 中的一个热 点[。。 目前,在解决转基因植物可能存在的安全性问 题中,人们首先考虑删除的外源基因是选择标记基 因(如 NVI'I基因或 Bar基因等)。因为在植物遗传 转化过程中,选择标记基因通常作为筛选阳性转化 子的工具与目的基因一起导入,然而一旦获得转基 因植株,这些基因就失去了其功能意义,对转基因植 物来说也就成为多余,而且这些标记基因的存在还 可能带来生物安全性问题。另外,由于选择标记基 因数量有限,这些基因的存在也给转基因植物的再 次转化带来了不便。因此近年来一些删除选择标记 基因的技术先后发展起来,其中主要包括转座子方 法[ 、共转化技术[ J和重组酶系统[ J等等。这些技 术中,重组酶系统是应用较广泛、删除效率相对较高 的一类技术。但该技术也存在明显不足:由于获得 完整的重组酶系统往往需要通过杂交或二次转化等 方式 J,故删除标记基因的过程漫长。 为解决上述问题,一些科学家试图通过瞬间表 达【 J或化学诱导【 J等方式来调控重组酶基因的表 达,以缩短删除标记基因的时间,但这些方法的可操 作性较差,重复性也不好。另外,现有这些技术主要 关心的是删除转基因植物中的筛选标记基因,而对 于改良作物品质、增加作物产量以及提高作物抗性 等外源基因,在完成其功能后并没有从转基因植物 中删除,这些基因仍然可能逃逸到自然界中,对生态 环境和人类健康构成威胁,公众对转基因植物安全 性的担忧仍将存在⋯。 本研究中,我们采用来 自于拟南芥的热激蛋白 Hspl8.2基因启动子L8 J控制重组酶基因 FLP的表 达,同时以GUS基因作为报告基因,抗生素抗性基 因(NlYI'I)作为筛选标记基因,将所有外源基因置于 位点特异性重组酶系统的两个识别位点之间。该删 除系统通过根癌农杆菌的介导转化烟草,获得转基 因植株后,对其进行热激处理,希望将包括选择标记 ① 国家自然科学基金(303O0225)资助项目。 ② 男,1974年生,博士,讲师;研究方向:植物分子生物学。E-mail:luokeming@hotmail.COII ③ 联系人,E.mail:peiyan@8Wal1.edu.cn (收稿日期:2004-10-20) 一 61 — 维普资讯 http://www.cqvip.com 高技术通讯 2005年 7月 第 l5卷 第7期 基因在内的所有外源基因在特定时期内全部删除, 获得无外源基因的转基因植株。 1 材料和方法 1.1 材料 烟草(Nicotiana.tabacuIn cv.Xanthi)、拟南芥(Ara— bidopsis.thanlian CV.Columbia)、大肠杆菌菌株 DI-ISa 和根癌农杆菌 LAB4404均由本实验室保存。pBFLP (pBluescript I KS含有 35S一兀JP—Nos片断)由 Dr.Ge— ofrey M.wahl(Salk Institute,San Diago,CA.)提供。 35S—GUS:NPTI—Nos融合基因由本实验室构建。 1.2 热激蛋白Uspm.2基因上游序列的获得 为了从拟南芥中扩增热激蛋白Hspl8.2基因上 游的启 动 子 序列,合 成 引 物:P (5’>GGCG. GTACCATGGTCATYCTGGTYC<3’,含 KpnI)和 P2(5’ >C0 CI1I ['AG G1 ℃cr几℃C兀TrCGGC<3’,含 PstI),预期扩增出720 bp大小的片断。采用 CTAB 法[ ]提取拟南芥基因组 DNA,取 50 ng总 DNA在 25 l反应体系中进行扩增。反应条件为:95~C,预变性 A B 5’>Gc Ⅱ EcoRI TC1.AGAGAArAGG, 5 min。然后 94℃变性 1 min,58oC退火 1 min,72oC延 伸 1 min,40个循环。最后 72℃延伸 10 min。 1.3 植物表达载体的构建 植物表达载体 pLFHFGN是在载体 pBIN19的基 础上构建而成的。具体的构建过程如下:首先人工 合成含有两个同向融合识别位点 loxFRT和多克隆 位点 (Multiple Cloning Sites,MCS)的 loxFRT—MCS— loxFRT片断,该片断两端分别含有酶切位点 EcoRI 和 NheI。再用片断 loxFRT-MCS—loxFRT置换掉载体 pBIN19上 LB和RB之间的 RI一 I片断,将35S— GUS:NPHI—Nos融合基因通过 XhoI和 Sa/I酶切位 点插入到 MCS之间,得到载体 pLFGN。同时将 PCR 扩增获得的 Hspl8.2启动子片断通过 nI和 PstI 位点插入中间载体 pBFLP,再用 KpnI和 I将片断 Hspl8.2.兀JP—Nos切下,插入到载体 pLFGN的 GUS: NPTI融合基因前面的 nI和 I位点中,获得植 物表达载体 pLFHFGN,详细图谱见 图 1。将质粒 pLFGN和 pLFHFGN分别转化农杆菌 LBA4404并得 到阳性转化子。 Ⅱ lA — — — — _{ 鱼垒9A Xhol BamHl GAAG1TCC1=I AC11T 垒 G 鱼 鱼△鱼 GA 铆 H Sail SacI 1一rcGTI AGCArACA几-ArACGAAG1一 l1℃TGA /ox ————-1 Spacer 卫笙 GGC<3 Nhel Hsp18.2 FLP Nos 35S GUS:NPTII Nos IoxFRT IoxFRT35S GUS:NPTI Nos /oxFRT — 口H -__ 卜 A: 肌 .Mcs. 肌 (MCs)片断表达;B:载体 pIaCI-IFGN;C:删除后转基因植物 中残留的外源基因片断;D:被删除的基因片段;E:载体 pLFGN。 图 1 植物表达载体 pLFHFGN及其删除外源基因过程的示意图 1.4 烟草的遗传转化 烟草转化采用叶盘法[101。 一 62 — 1.5 转基因烟草的GUS组织染色检测 转基因烟草的 GUS,组织染色鉴定参见 Jefer- 辩 窨l一 ”, 一 维普资讯 http://www.cqvip.com 罗克明等:一个新的重组酶系统在转基因植物外源基因删除中的应用 son[⋯的方法。 1.6 转基因烟草的分子检测 PCR检测 GUS组织染色呈阳性的转基因烟草。 对于转基因 pLFGN植物,选取 GUS基因作为扩增对 象,弓l 为:Pl(5 >C ]rACGTCC1℃TAAAACCC< 3 );P2(5 >GT1TATFCITCATrGT1TGCC<3 )。而转 基因 pLFHFGN的植物,则根据重组酶 FIX'基因的序 列设计一对引物,序列为:Pl(5 >CAAGAGAGCCA— CAqT-CATGG<3 )和 P2(5 >GGAC )G,ITCAGAAT TCCTC<3 )。每个25 l的PCR反应体系中含50 ng 转基因植物基因组总 DNA。PCR反应程序为:95℃ 预变性 5 min。然 后 94cC变性 1 min;54cC退 火 l min;72oC延伸 l min,共 35个循环。最后 72℃延伸 10min。 1.7 转基因植株的热激处理 由于热激蛋 白Hspl8.2基因启动子在高于37℃ 时就会驱动其控制的基因表达,因此转基因植株在 进行热激处理前需在低于 37~C的条件下培养。当 需要对转基因植物进行热激处理时,直接将植物材 料置于 37℃下处理 6 h。为了保证热激处理充分, 通常重复上述处理 1~2次。 2 结 果 2.1 热激蛋 白 №;p18.2基因启动子的克隆及序列 分析 根据 Takahashi等 8的报道,选取 热激蛋 白 Hspl8.2基因的上游序列作为启动子,合成一对特 异引物,通过 PCR方法从拟南芥基因组中扩增得到 了一个片段约 720 bp。PCR扩增产物在琼脂糖凝胶 上电泳,结果见图2中所示。 ● M:DNA分子量标记 1阴性对照: 2Hspl8.2启动 图2 PCR扩增的 18.2启动子琼脂糖凝胶电脉结果 将 PCR扩增的目的片段从琼脂糖凝胶上回收 并克隆到 pGEM—T载体上,进行测序验证,测序结果 见图 3。 gtcattcttctggttcaagc atgaca tgaacaggca ataaataagt tgagattg atcacagtaa ctgat actg aatcgaatca magan【n】tiltlilit agttactg ttagtaaat atgtgtcta tgttgtcac aaaaacgtgg ctcagncn gtatatatgg agacaaaaaala)Ttccataaa agattgttga ca~ctcgga aattagtgc cactgta tgcgagaact tactatagt tccttggc gaaaagctaa taatcttaaa tctgattt gtcctct(t)A tctctgagna gattc~a aanccacn ccgacctat aagaaatggg cttgcaaa gaagatccgc~cactgagcccgtatctcg aagaggataa tacaacaaca aagcaaaacg gcacgtagt taatgtaa ccaaggatg cattcggtc tgttca acaaacgaaact tcctgaaatg ccaagaaaaa tctggtcat tcaccacagt gatcatgtg tatgtgtct aaag actcca agcgaagg~~agaaaaag gagcattc tanctanc aagaaactcg aagaaca~c tctctcatc ctcta acnc cctataaata tgtccttgc taatcagatc aaatcagcag gaaaatcaagaac caaaagt ctcccgaaaag !苎苎!璺苎苎!苎‘3。 []括号中的序列已缺失;()括号中的碱基突变为后面大写字母代表的碱基。 图 3 来源于拟南芥的 l l8.2启动子的测序结果 热激蛋白Hspl8.2基因的上游序列来源于拟南 芥基因组,通过 PCR扩增获得,图 3为Hspl8.2启动 子测序验证的结果。将其与在 Genbank中已经公布 的序列(登录号:X17295)进行相似性 比较,结果发 现,从PCR扩增得到的Hspl8.2启动子序列中,存在 2个碱基的缺失和 2个碱基的突变。造成这些变化 的原因可能是由于在 PCR反应中,作为扩增模板的 植物基因组总 DNA来源不一致,不同品种间基因组 DNA本身就存在一定的差异,尤其是在非编码区 域。将序列作相似性分析发现,扩增获得的启动子 序列与已发表的启动子相似性达 94.4%,相似性程 度非常高。因此认为得到了与预期一致的启动子序 列。 一 63 — 维普资讯 http://www.cqvip.com 高技术通讯 2005年 7月 第 15卷 第 7期 2.2 转基因烟草 GUS组织染色鉴定 将载体 pLFGN和 pLFHFGN转化烟草后,Tn代 分别得到48和37株再生植株,与野生型烟草相比, 转基因植株的形态没有明显的差异。由于载体中都 含有 GUS:NPTI融合基因,所以首先采用 GUS组织 染色的方法,初步检测这些再生植株是否为阳性转 基因植株。对 GUS组织染色后的转基因植株进行 统计,结果见表 1。表中结果显示,70%左右的转基 因植株 GUS组织染色后呈蓝色,说明各个表达载体 在烟草中的转化效率普遍较高。 表 1 转基因pLFGN和 pLFHFGN植物的 GUS组织染色检测结果 2.3 转基因烟草的PCR检测 为了进一步确证载体 pLFGN和 pLFHFGN的 T- DNA片段是否整合到转基因植株基因组中,分别对 GUS染色结果为阳性的部分转基因植株进行了PCR 检测。在 pLFGN和 pLFHFGN转基因植物的 PCR检 测中,GUS基因和 FLP基因分别作为扩增的靶基因。 PCR反应产物琼脂糖凝胶电泳的结果见图4所示。 A M M CK l 2 3 4 5 6 7 8 9 10 MM:DNA分子避标记:CK: {性对照: IO: 性对照:I一9:转螭 I p LJFGN植株 B MM CK J 2 3 4 5 6 7 8 9 10 MM:DNA分子量标记:CK:阴{,_=}对照:6:阳 性对照;I-5和 7-10:转基I列 pLFI-tFGN植株。 图 4 PCR检测 GUS组织染色结果呈阳性的转基因植株 根据图4的结果可知,在所有 GUS组织染色呈 阳性的转基因植株中,PCR检测结果均得到了阳性 信号,且扩增片段的大小与阳性对照(质粒)中获得 一 64 一 的片段大小一致,而阴性对照(野生型烟草)中未检 测到任何扩增信号,说明 GUS组织染色与 PCR检测 的结果一致,外源基因确实已经整合到了各个 GUS 染色结果呈阳性的转基因植株基因组中。 2.4 转基因植物热激处理后的GUS组织染色结果 在转基因 pLFHFGN植物 Tn代植株中,未做热 激处理时,转基因植株的叶片 GUS组织染色后能够 检测到 GUS基因的大量表达(见图 5一A—n)。但将叶 片进行 37~C热激处理,室温继续培养 2d后,GUS组 织染色,在各个转基因植株中都检测到 GUS蛋白不 同程度的减少,有的甚至观测不到 GUS蛋白的存在 (见图5一A—I)。将转基因pLFHFGN植物 T1代热激处 理前后的幼苗分别进行 GUS组织染色,发现在热激 处理后的幼苗中蓝色幼苗的数量显著减少(见图 5. C和 E)。以上结果表明,Hspl8.2启动子受热激诱 导后引导重组酶 FLP基因表达,可将 GUS等外源基 因从转基因植物中删除。而在转基因 pLFGN植物 中,尽管存在识别位点,但由于没有重组酶 FLP基 因,热激处理后,Tl代中蓝色幼苗的数量没有减少, 说明 GUS基因等外源基因没有被删除(见图5一B和 D中所示)。 豳 pLFGN 热激处理后热激处理前 热激处理前 热激处理后 图5 转基因烟草热激处理后 GUS组织染色的结果 2.5 转基因 pLFHFGN植物热激处理后删除效率 的分析 为了进一步搞清楚热激蛋白 Hspl8.2启动子控 制的重组酶系统在转基因植物中的删除效率,对各 个转基因植株中的删除效率做了定量分析。将转基 因 pLFHFGN植物进行了热激处理,统计了各个植株 中的蓝白幼苗数,具体结果见表 2。 从表 2中看 出,在没有热 激处理 的转 基因 pLFHFGN植物 Tl代幼苗中,GUS组织染色后蓝白幼 苗的统计结果显示,转基因 pLFHFGN植株 1、4、16 为拷贝插入,植株 3和植株 10为两个拷贝,植株 维普资讯 http://www.cqvip.com 罗克明等:一个新的重组酶系统在转基因植物外源基因删除中的应用 23和植株 8中,由于 GUS组织染色后,蓝白幼苗的 比例不符合盂德尔遗传分离比例,外源基因的拷贝 数无法确定。各个转基因植株删除效率的统计结果 显示,单拷贝植株的删除效率明显高于双拷贝转基 因植株。在转基因植株 8和 23中,由于外源基因的 拷贝数未知,故删除效率很难确定。 总的说来,在转基因烟草中,重组酶系统在热激 蛋白Hspl8.2启动子的控制下,经热激处理,删除外 源基因的效率比较高,在单拷贝转基因植株 l6中删 除效率达到 了 84.9%,但没有检测 到外 源基 因 100%地删除的转基因植株。 表2 热激处理后转基因植物中外源 基因删除效率的统计结果 ND表示该株系没有统计到删除效率。 3 讨 论 自位点特异性重组酶系统 Cre//ox在烟草中转 化成功以来,人们已经将重组酶系统分别导入到了 烟草、拟南芥、水稻、玉米和大麦等_4 J多种植物,但在 这些报道中,重组酶系统的删除效率普遍较低,无法 满足在大田生产中高效删除转基因作物中外源基因 的需要。在本研究中,我们构建了一个新的重组酶 删除系统,该系统采用 loxFRT融合识别位点代替传 统的单识别位点 或FRT,希望提高重组系统的删 除效率。同时所有外源基因置于重组酶系统的两个 识别点之间,当获得转基因植株后,采用热激处理的 方式启动重组酶基因的表达,迅速删除转基因植物 中所有外源基因。实验结果表明,在单拷贝的转基 因植株 l6中,外源基因的删除效率最高,达到了 84.9%。同时,我们也对转基 因植株 rl代中没有 GUS基因表达的后代进行了 PCR分子检测,结果没 有得到扩增产物(结果未显示),说明转基因植株中 的外源基因确实已经被删除掉。 在转基因植物中,如何控制重组酶系统的表达 仍然是个问题。近年来一些组织特性启动子如花粉 特异性启动子【l2]和化学诱导性启动子E6]应用到了 基因删除中以控制重组酶基因的表达,尽管这些重 组酶系统对转基因植物的生长没有负面影响,但其 删除效率不高,操作性也不好。物理诱导性启动子 是另一类在转基因植物中应用较多的启动子,其优 点是可以驱动外源基因在转基因植物生长的任意时 刻表达。Lyznik等【 J 1995年在玉米细胞中通过 I-sp 启动子控制 FLP基因表达,转基因植物细胞中的外 源基因得到了一定程度的删除。Kilby等_1 J采用来 自大豆的热激蛋白启动子 Glnhspl7.6L实现了对重 组酶 FLP基因表达的随时控制。本研究选取来 自拟 南芥的热激蛋白Hspl8.2基因的启动子控制重组酶 FLP基因的表达,在没有对转基因植物进行 37~C处 理前,能检测到 GUS基因的正常表达。热激处理 后,转基因 pLFHFGN植物中外源基因被不同程度 (48.2%~84.9%)地删除。从理论上说,通过热激 蛋白启动子驱动重组酶基因的表达,由于热激处理 转基因植物的时间和频率都能人为控制,因此可以 自由地控制转基因植物中外源基因的删除时刻和删 除效率。 但应该 看到,如果将 目前 的基 因删除系统 pLFHFGN应用于田间大规模种植的转基因作物中, 去解决转基因安全性等问题,仍然存在着明显的不 足。首先在大田生产中,热激蛋白启动子引导重组 酶系统的启动只能依赖于自然环境提供的高温条件 (≥37~C),这就大大局限了该系统在实际生产中的 应用。其次在大田条件下,即便能够保证 37~C的热 激处理,但对所有转基因植物而言,重组酶系统的删 除效率不够高仍然是个问题,很难彻底删除全部转 基因花粉或种子中的外源基因。因此,要真正消除 公众对转基因植物生物安全性的担忧,还必须对该 重组酶系统做进一步的改进,以提高其删除效率。 参考文献 [1]Hare P D,Chua N H.Excision of selectable marker genes from transgenic plants.Nat Biotechnol,2002,20:575 [2]Komari T,Hiei Y,Saito Y,et a1.Vectors~ 3rmstwo sepa一 一 65 — 维普资讯 http://www.cqvip.com 高技术通讯 2005年7月 第 15卷 第 7期 rate T.DNAs for eo-tmngornation of higher plants mediated by Agrobacterinm tumefaciens and segregation oftransfonnants free from selection markei~.P/ant J.1996.10:165 [3j NakagawaY,MachidaC,MachidaY,eta1.A systemtoin— duce the deletion of genomic sequences using R/RS site-spe— cifc recombination and the Ac transposon in transgenic rice plants.Theor却 Genet,2001,102:1136 [4]Ly k LA,Ryan RD,Ritchie SW,et a1.Stable co-trans— formation of maize protoplasts with gusA and neo genes. 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P/ant J.1995,8:637 The application 0f a novel recombination system for removing 0‘ ‘ n · ‘ 0 · toreign genes tr0m transgemc plants Luo Keming一 ,Zhao Degang ,Li Yi ,Pei Yan ( Biotechnology Research Center,Southwest University,Chongqing 400716) ( Key Laboratory of Agricultural Biotechnology,Guizhou University,Guizhou 550025) ( Department of Plant Science,University of Connecticut,CT 06269,USA) Abstract To addres the potential safety problem of geneticaly modifed(MG)plants,a novel system pLFHFGN based on site-specific recombinase兀 was constructed.AU foreign genes。including a nP recombinase gene driven by heat— shock promoter Hspl8.2(Hspl8.2-FLP-Nos)and a GUS:NFflI fusion gene under the control of CaMV 35S promoter, were flanked by two loxFRT recognition sites.The system was delivered into tobacco(Nicotiana.tabg~ulg cv.Xanthi) via the Agrobacterium—mediated transformation method .Transgenic tobacco plants were confirmed by histochemical stain— ing of GUS activity and PCR analysis after regeneration.To determine the excision eficiency of the pLFHFGN system, seedling progenies of trm~ enic tobacco Tl plants were heat-shocked under 37 o【=and then histochemical assay for GUS activity was perform ed .Th e results demonstrate that deletion eficiencies of the transgenes in trm~ enie plants are 48.2% ~ 84.9% .Th erefore.using the heat—shock promoter Hspl8.2 to control expression of reeombinase gene兀 ,the pLFHFGN system can delete eficiently all functional foreign genes from GM plants,which may provide a new tool to re— solve the possible safety problem of GM plants. Key words:heat-shocked protein Hspl8.2,site—specifc recombination system,gene excision,transgenic plants 一 66 — 维普资讯 http://www.cqvip.com
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