花色苷是人们最熟悉的水溶性天然食用色素

花色苷是人们最熟悉的水溶性天然食用色素，在自然界中广泛分布，构成了植物王国中绝大多数品种的蓝色、红色、紫色和黄色等 姓名:肖柳青 学号:2007111107240508 专业:生化与分子生物学 花色素研究进展 花色苷是人们最熟悉的水溶性天然食用色素，在自然界中广泛分布，构成了植物王国中绝大多数品种的蓝色、红色、紫色和黄色等。花色苷作为一种天然食用色素，安全、无毒、资源丰富，而且具有一定营养和药理作用，在食品、化妆品、医药领域有着巨大应用潜力。 图1　天然花色素结构图 Fig.1　The structural of natural anthocyanidin 1　花色苷的结构和化学性质 由于花色苷象其它天然黄酮类化合物一样，具有特征性很强的C6C３C6碳骨架和相同的生化合成来源，因此，人们也将花色苷视为黄酮类化合物。但花色苷因强烈吸收可见光而区别于其它天然黄酮类化合物。现已查明，天然花色苷糖苷配基的基本结构为3，5，7一三羟基一2一苯基苯并吡喃，结构式为：                 花色苷的配基为花色素（图1），后者与各种糖结合形成不同的配糖体。由于花色素不稳定，在植物中主要以花色苷（配糖体）存在。花色苷的颜色与连接在母体C6C３C6核上的取代基和环境有关。 花色素是具有类黄酮典型的结构2-苯基苯并吡喃阳离子结构的衍生物（又称花钅羊盐）。已知有20种花色素，但在食品中重要的仅6种，分别是天竺葵色素（pelargonidin）、矢车菊色素（cyanidin）、飞燕草色素（delphinidin）、芍药色素（peonidin）、牵牛花色素（petunidin）和锦葵色素（malvidin）（图2）。与花色素成苷的糖主要有葡萄糖、半乳糖，阿拉伯糖、木糖、鼠李糖和由这些单糖构成的均匀或不均匀二糖和三糖，其中，3-单糖苷、5-双糖苷、3，5-二糖苷和3，7-二糖苷是最常见的。花色素及其糖苷也存在甲氧基化形式，甲氧基化的位置多数位于C-3′和C-5′。花色苷也经常以酰化的形式存在，引起酰化的主要有机酸有咖啡酸、对香豆酸、芥子酸、对羟基苯甲酸、阿魏酸、丙二酸、苹果酸、琥珀酸和乙酸，最常见的酰化形式是酰化取代基与C-3位的糖键合，或与C-6位的羟基酯化。  2　影响花色苷颜色和稳定性的因素 图2　食品中常见的六种花色素及它们红色和蓝色增加的次序 Fig.2　The common six anthocyanidins in food and their increase sequence of red and blue 2.1​ 结构  我们知道，各种花色苷的区别主要在于分子中羟基的数目，羟基甲基化的程度，糖结合的数目和位置，结合于糖残基上芳香酸或脂肪酸的数目和性质。这些基团的位置和种类对花色苷的稳定性有很大影响。     C3上的羟基尤其重要，它可将花色素的颜色由黄一橙色变为红色。大多数C 羟基花色素为红色，而C3脱氧花色素 则为黄色。但是C 3羟基可使分子变得不稳定， 一脱氧花色素要稳定得多。 碳5上有羟基或碳4发生取代都可使颜色趋于稳定，因为阻止了导致无色化合物形成的水合反应。     糖苷的形成也影响花色素的稳定性，典型的花色苷——3一芸香糖矢车菊花色苷的半衰期(室温，0．01mo]／L柠檬酸，pH 2．8)大约为65天，而相应的花色素的半衰期只有l2小时(Iaeobucci Sweeny 1983)，芍药花色素和锦葵花色素稳定性也比相应的花色苷低得多(Ohm等1980)，在酸性条件下，3—0一糖的缓慢水解可能与这些花色素的稳定性有关。    随后叉从千里光属，番薯属、半边莲属、吊竹梅属和紫露草属植物中陆续提取出并鉴定为酰化的花色苷。它们在广泛的pH值范围现出极强的颜色稳定性。以后的试验证明．只有当花色苷糖残基上带有2个或2个以上的酰基时才表现出稳定作用，这是因为酰基使花色苷分子立体构型发生变化从而保护了活化中心不受水分子攻击的缘故。   在酸性条件下，非酰化和单酰化的花色苷的颜色在很大程度上取决于连在糖苷配基B-环上的取代基。羟基越多，颜色越向紫移，而甲氧基化却导致红移。花色苷的糖基化和酰基化一般都具有紫移效应。 一般来说，随着糖苷配基羟基化程度的增强，花色苷的稳定性呈下降趋势；而甲氧基化程度的增强则使花色苷的稳定性呈上升趋势，游离羟基的糖苷化也将增加花色苷的稳定性。此外，复杂的多酰化的花色苷可形成“夹心”的结构形式，能提供较好的分子内助色作用，因为这种结构可阻止水中亲核试剂的攻击，防止色素变色。 2.2　pH 在溶液介质中，花色苷会随pH有几种结构的变换。对于一个给定的pH值，在花色苷的4种结构之间存在着平衡：蓝色的醌式（脱水）碱(A)、红色的花钅羊正离子(AH+)、无色的甲醇假碱（B）和查尔酮（C）（如图3）。非酰化和单酰化的花色苷在pH值很低时，其溶液呈现最强的红色。随着pH值的增大，花色苷的颜色将褪至无色，最后在高pH值时变成紫色或蓝色。但是，具有两个或两个以上酰基的花色苷在整个pH范围内都表现出了相当好的颜色稳定性。另外，酰化部分的性质对花色苷的稳定性也有影响。 图3　花色苷的结构转换 2.3　温度 花色苷无论是在天然体系还是在模拟体系，其稳定性都会明显的受到温度的影响。花色苷的热稳定性与其结构、pH、氧以及体系中其它化合物的反应有关。糖苷配基的羟基化使花色苷稳定性降低，而甲基化、糖基化和酰基化能增强其稳定性。 当花色苷溶液加热时，平衡向着无色的查耳酮(C)的方向进行．同时引起有色型化合物(AH +A)的降低。当冷却和酸化时．醌型碱(A)和假碱(B)迅速变成阳离子(AH )。但是查耳酮(C)的变化相当慢。在25 度下(温度越低需时越长)3．5—2葡糖苷的查耳酮型和3一葡糖苷的查耳酮型达到与其相应的黄镡盐的平衡分别需要12小时和6～7小时。这4种类型化合物的可逆反应和花色苷无色型和有色型(黄锌盐阳离子和醌型碱)的互变很有意义，而且应当在果汁生产中加以利用。 2.4　酶 在花色苷降解过程中，涉及到的酶有糖苷酶和多酚氧化酶这两大类。糖苷酶可水解花色苷得到游离的糖和花色素，花色素很不稳定，可自发转换成无色的物质。多酚氧化酶作用于存在邻-二酚羟基的花色苷，产生的中间产物－邻醌能通过化学氧化作用使花色苷转化为氧化的花色苷及降解产物。 在加工储藏和包装之前，初步蒸气漂白对果品蔬菜中的花色素酶可起到破坏和抑制作用。葡萄糖、葡萄酸和葡萄糖-δ-内酯是糖苷酶的竞争性抑制剂。多酚氧化酶的活性可有效的被SO2、亚硫酸盐、苯肼、半胱氨酸和单宁所抑制。 2.5　光线 光线对花色苷有两种作用，一是有利于花色苷的生物合成，二是能引起花色苷的降解。在光照下，酰基化的二糖苷比非酰化的二糖苷稳定，二糖苷又比单糖苷稳定。花色苷自身缩合或与其它有机物缩合后，根据环境条件的不同，可能提高或降低花色苷的稳定性。多羟基黄酮、异黄酮等对花色苷的光降解有抗性，因为带负电荷的磺酸基荷带正电荷的花钅羊离子相互吸引，使这些分子与花色苷形成了复合物。 2.6　氧和抗坏血酸 分子氧对花色苷的危害作用早有报道,可引起花色苷的降解，产生无色的或褐色的物质。 很早以前Beattie和Pedersoon但等就观察到在储存的果汁中氧和抗坏血酸的量同时减少。这是因为抗坏血酸被氧化后能产生H2O2，H2O2能引起花色苷的降解。另外，在有铜离子存在的条件下，能加速抗坏血酸和花色苷的降解。温度较低时，抗坏血酸对花色苷起稳定作用，温度较高时，抗坏血酸对花色苷结构的破坏作用加速。 2.7　糖及其降解产物 　在高浓度的糖存在下，由于水分活度降低，花色苷生成假碱式结构的速度减慢，所以花色苷的颜色得到了保护；在低浓度的糖存在下，花色苷的降解或变色却加速。果糖、阿拉伯糖、乳糖和山梨糖的这种作用比葡萄糖、蔗糖和麦芽糖更强。花色苷的降解速率和糖本身降解时生成糖醛类化合物的速率有关。温度和氧能加快这种作用。 2.8　二氧化硫 　二氧化硫是食品工业中常用的防腐剂和漂白剂。二氧化硫对花色苷的漂白可能可逆或不可逆。当二氧化硫用量在500～2000 μg/g时，这种漂白是可逆的，在后续的加工中，通过大量水洗脱后，颜色可部分恢复。对不可逆漂白的反应研究较多，认为二氧化硫在果汁的酸作用下形成亚硫酸氢根，它对花色苷4-位碳亲核攻击生成了无色的花色苷亚硫酸盐复合物。 2.9　金属离子 　花色苷与钙、铁、铜、铝、锡或其它金属离子的络合对颜色也能起稳定性作用。但是，只有那些在B-环上含有邻位羟基的花色苷才能与金属离子络合。因此，可以通过向花色苷添加某种金属离子，再观察其最大吸收波长是否移动，来区别具有这种特定结构的花色苷和其它的花色苷。例如通过加三氯化铝的醇溶液来判断所分离的花色苷是否B-环上含有邻位二羟基。 　虽然金属离子对花色苷具有稳定和保护作用，但其效应也不是有益无害的，因为在增色的同时形成的金属－单宁络合物可导致褪色。 2.10　辅助成色 　如果只考虑pH值时，普通的花色苷似乎不会产生很深的颜色，因为在一个很大的pH值范围内都以无色的形式存在。但在自然界中，花色苷有时有很强的着色能力，这意味着它的有色结构受到了某些理化因素的稳定。这些因素之一就是辅色素（copigment）的辅助成色作用。这些辅色素多数是黄酮类、氨基酸和核苷酸。花色苷本身也可以作为其它花色苷的辅色素，但是在一般情况下，花色苷自身作为辅色素对于染色并无多大意义。 　对于绝大多数的天然花色苷来说，辅助成色作用主要是在适当条件下，使花色苷的最大吸收波长红移，使在可见波段的吸收增加。辅助成色受到若干因素的影响，其中，pH值是一项重要因素。已经证明，辅助成色作用从pH值接近1到中性时才发生。其它的影响因素还有花色苷的类别和浓度、辅色素的浓度、温度和金属离子的种类。 2.11　亲核试剂 　非酰化和单酰化的花色苷对C-2位和C-4位的亲核进攻特别敏感。对于氨基酸核碳亲核试剂，进攻往往都发生在亲电的C-4位上。这些生成物的活性都很高，根据C-4位取代基的性质还会发生进一步反应。它们最终都使色素褪色。C-4位被甲基或苯基取代的花钅羊盐对亲核进攻具有抵御作用，这表明C-4位被取代是使花色苷稳定化的有效措施。 3　提取和纯化 3.1　提取 　花色苷的提取国内外许多学者都做了大量的研究。花色苷提取方法的选择决定于提取的目的和花色苷本身的组成。如果提取出来的色素还要进行定性或定量，那么应该选择一种使色素经可能处于天然状态的提取方法。如果提取出来的色素要用于食物着色，那么就更应关注色素的最大产率、着色力和稳定性。 　花色苷在中性和弱碱性溶液中不太稳定，因此，提取过程通常要采用酸性溶剂。对于提取溶剂，甲醇是最佳选择，因为甲醇提取效率比乙醇高20%，比水高73%。酸性溶剂在破坏植物细胞膜的同时溶解水溶性色素。最常用的提取溶剂是1%的盐酸甲醇溶液,但是用于食品着色时，考虑到甲醇的毒性，可以选择1%的盐酸乙醇溶液。 　用盐酸酸化可以保持低pH值，但能改变色素的原始状态。因此，为了获得更接近于天然状态的花色苷，建议采用中性溶剂做初步提取，可采用的中性溶剂有60%甲醇、正丁醇、乙二醇、丙二醇、冷丙酮、丙酮/甲醇/水混合物和水。另外，也可使用弱有机酸，如甲酸、乙酸、柠檬酸和酒石酸等。如果既要考虑色素的产量，又要尽量保持色素的原始状态，可以选择有机酸和甲醇提取花色苷，其中，柠檬酸是最好的，其次是酒石酸、甲酸、乙酸和丙酸。 　经初步浸提和过滤的花色苷提取物通常很稀，因此在纯化之前或用于食品着色之前需要浓缩。为了减少色素的降解，浓缩最好采用真空浓缩，温度不要超过30℃。 3.2　纯化 如果工业化生产纯化花色苷，利用吸附树脂纯化比较经济。国内许多学者利用大孔吸附树脂对花色苷的纯化进行了研究。为分析目的纯化花色苷时，花色苷纯化的传统方法是纸色谱，薄板色谱和柱色谱也用于花色苷的纯化。Zapsalis and Francis曾用乙酸铅沉淀法和离子交换树脂法纯化花色苷，Francis and Andersen曾用微滴逆流色谱（DCCC）纯化花色苷。目前，国外许多学者利用SepPak cartridge C18柱、反相高效液相色谱（RP-HPLC）和半制备高效液相色谱对花色苷成功的进行了纯化。 4　定性分析 　花色苷结构最早由Bate Smith引入纸色谱方法进行鉴定，后来，Harborne系统的总结了花色苷利用纸色谱定性的方法，并提供了大量有价值的数据。完整的结构表征一般包括：糖苷配基的鉴定、糖和酰化基团（如果有的话）的鉴定以及糖和酰化基团的连接位置的确定。 4.1　光谱法 4.1.1　紫外—可见光谱法　 紫外－可见光谱很早就被人们应用于花色苷的结构鉴定，该法主要有如下几点：①花色苷最大吸收波长一个在可见光区的500～540nm附近，另一个在紫外275nm附近，通过测定色素的最大吸收波长即可判断是否为花色苷类色素。②如果向花色苷的0.01％盐酸甲醇溶液中滴加3～5滴AICI3甲醇或乙醇溶液，出现蓝移，即最大吸收波长增加，说明B－环有邻位酚羟基，即可区分B－环无邻位酚羟基的天竺葵色素、芍药色素、锦葵色素和 B－环有邻位酚羟基的矢车菊色素、牵牛花色素、飞燕草色素。③根据花色苷最大吸收波长处的吸光度和440nm处的吸光度的比值A440/Amax，参考文献后，可以判断糖苷的位置。④根据花色苷在300～330nm间有无吸收峰可判断该色素分子是否有酰基，如果有吸收峰，表明该色素有酰基存在。⑤根据花色苷在440nm处是否有肩峰，可以判断该色素5号位的羟基是否被取代。如果5号位的羟基没有被取代，则该色素在440nm处有肩峰。⑥根据花色苷在紫外光下是否有荧光，可判断该色素是否在5号位有取代基，如果有荧光则表明该色素在5号位有取代基。 4.1.2　红外吸收光谱法　 目前，红外吸收光谱应用于花色苷的结构鉴定不太广泛。花色苷的红外光谱主要有苯环、含氧杂环、糖和羟基和甲氧基四部分。李景琳、吴信子曾用红外吸收光谱对蓝靛果花色苷进行研究。 4.2　色谱法 　利用色谱法进行花色苷的结构鉴定需要对花色苷进行酸水解、碱降解和过氧化物降解等处理，使花色苷中的糖苷配基、糖和有机酸游离出来，再通过标准的糖苷配基、糖和有机酸作对照或参考文献数据，进行色谱分析。传统的色谱方法是纸色谱，薄层色谱、GC、HPLC、RP－HPLC应用于花色苷结构鉴定也逐渐多了起来。 4.3　其它方法 　目前，随着分析技术的进步，越来越多的方法应用于花色苷结构鉴定。如气相色谱/质谱联用(GC/MS)分析花色苷与氯代三甲基硅烷反应后的产物，快速原子轰击质谱（FAB-MS）可以精确测定花色苷的分子量，H-NMR和C-NMR适用于丙二酸酰基化的花色苷结构鉴定。Gao 和Mazza利用HPLC和GLC发现了快速测定花色苷结构的方法, Hong 和Wrolstad介绍了RP-HJPLC/光二极管阵列检测器（Photodiode Array Detection）鉴定花色苷结构的方法。 5　定量分析 　根据待分析花色苷的特性和分析需要，定量方法可分为三类。 5.1　含有很少或者不含有干扰物质的体系中花色苷总量的测定 花色苷的最大吸收区在500～550nm范围内，而离这一范围最近的类黄酮的最大吸收范围在350～380nm。在新鲜的植物提取物中，因为很少含有在花色苷的最大吸收区发生吸收的干扰物质，花色苷总量可以利用比耳定量通过适当波长处的吸光度来测定。 　该方法测定花色苷总量需要在一个恒定的pH介质中进行。除了需要在定性的基础上确定花色苷的种类，还需要测定单个花色苷的最大吸收波长下的摩尔消光系数ε或比消光度E。又因为单个花色苷的差别很小，而且单个花色苷组成的比率未知，所以一般用平均比消光度av E 来测定花色苷总量，误差小于0.2％。但是，单个花色苷的比消光度E是很难得到的，所以我们可以参考文献提供的数据。Fuleki和Francis利用该方法对红莓子中花色苷总量进行了测定。 5.2　含有干扰物质的体系中花色苷总量的测定 　在食品加工或储藏过程中，会产生褐色降解物，这些降解物和花色苷具有相同的能量吸收范围。这类花色苷总量的测定，通常有两种方法测定。 5.2.1　pH示差法　该法依据之一是花色苷发色团的结构转换是pH的函数，依据之二是超干扰作用的褐色降解物的特性不随pH而变化。通过实验，确定两个对花色苷吸光度差别最大但是对花色苷稳定的pH值，根据Fuleki的公式可以计算出花色苷总量。 5.2.2　差减法　差减法就是先测定样品在可见光区最大吸光度，经二氧化硫或亚硫酸盐漂白或过氧化氢氧化后，再测定一次吸光度，二者的差值就是花色苷的吸光度。参考用标准花色苷绘制的工作曲线，将吸光度换算成浓度。但是，差减法因所使用的漂白剂也能降低某些干扰组分的吸光度而使总花色苷浓度偏高。 5.3　单个花色苷的定量 　在新鲜的植物提取物中含有其它的类黄酮色素、花白素、糖等杂质，在加工或储藏的食品中除了含有上述杂质外，还含有褐色降解物，我们可以利用重复洗脱和色谱出去这些杂质，但是每一步操作都会产生误差。所以理想的纯化方法是先除去花色苷的干扰物质得到花色苷的浓缩液，然后再进一步分离定量。 　对于单个花色苷的定量分析，其分离纯化是关键的。早期单个花色苷纯化的方法有乙酸铅法、聚酰胺法、聚乙烯吡咯烷酮法和离子交换树脂法，以离子交换树脂法最佳。Amberlite CG-50离子交换树脂比较常用。Fuleki曾用In Situ方法对红莓子单个花色苷进行了定量分析。Manley和Shubiak在1975年首次将HPLC应用于单个花色苷分离，也有学者利用TLC和GLC方法用于单个花色苷的分离。目前，HPLC方法广泛的应用于总花色苷和单个花色苷的定量分析。 6​ 展望 　 所有这些研究表明．赋予植物不同色彩的花色苷：一般是不稳定的，并受多种因素的影响．因而限制了它作为食品着色荆在食品加工业中的应用。但是天然稳定性花色苷(酰化的花色苷)的发现和天然辅色剂对于不稳定花色苷的稳定化作用开辟了应用天然花色苷作为着色剂的可能性,那就是从不同植物中筛选出稳定的花色苷和寻找适宜条件下的适宜的辅色物质。  花色苷作为一种天然色素，安全、无毒，并且具有较好的着色力，在食品、保健品等方面都得到广泛应用，具有很好的市场前景。随着人们消费观念的转变，崇尚自然，追求绿色，也必将推动花色苷的发展。目前，对花色苷除了继续寻找品质较高的品种外，已经开始对花色苷进行结构改性和通过植物组织培养的研究。