风疹病毒特异性IgM诊断试剂盒的研制和临床应用

风疹病毒特异性 IgM 诊断试剂盒的研制和临床应用 严银芳1 　陈 　晓1 　姚学军1 　李丛荣2 　刘汉燕1 　陈红斌1 　谷沅珉2 1 基础医学院病毒学研究所 ,武汉 430071 ;附一医院检验科 ,武汉 430060 摘要 　目的 :建立风疹病毒特异性 IgM诊断试剂的技术并应用于临床。方法 :对传统的间接 ELISA 方法进 行了改良 ,定性检测人血清中风疹病毒 IgM。结果及结论 :本法克服了类风湿因子 (RF) 和特异性 IgG对实验的干 扰 ;与 HSV21、HSV22 和 HCMV 抗原无交叉反应 ;具有快速、敏感、特异性强、重复性好等优点。在 165 例临床可疑风 疹病例中检出阳性 142 例 ,用进口风疹病毒捕获法试剂盒检出阳性 133 例 ,阴阳符合率为 84. 0 %。 主词 　风疹病毒感染/ 诊断 ;酶联免疫吸附测定 ;试剂盒 ,诊断 中图分类号 　R 392. 11 ;R 446. 61 　　风疹病毒是引起人类疾病的常见病原体之一。 早期诊断风疹病毒感染可以减少病毒引起的严重危 害。我们使用吸附剂对传统间接 ELISA 法进行了改 良 ,建立了风疹病毒特异性 IgM2ELISA ,并初步用于 临床检验 ,现如下。 1 　材料和方法 1. 1 　病毒与细胞 　RuV Gos 株引自中国药品生物制 品检定所。Vero 细胞购自武汉大学典型微生物保藏 中心。RuV Gos 株在 Vero 细胞和原代免婴肾细胞增 殖、培养。差速离心制备 RuV 抗原 , - 30 ℃保存备 用。 1. 2 　被检血清 　165 例临床可疑风疹病人血清 ,采 集于 1993 年春季武汉地区风疹大流行时期。病人 大多数为儿童和青少年。患者均出现皮疹 ,大部分 伴有颌下淋巴结肿大、咽红、发热。 105 例正常人血清采自近几周内无感冒、发热的 健康成人。 1. 3 　RuV 抗血清 　按文献[1 ]介绍的方法制备兔抗 RuV 血清 , - 30 ℃保存备用。 1. 4 　试剂 1. 4. 1 　羊抗人 IgG　卫生部上海生物制品研究所产 品 ,单向免疫扩散效价 1∶100。用 10 %小牛血清 PBS 配成 0. 5 %(V/ V)浓度用作试验中的标本稀释液。 1. 4. 2 　辣根过氧化物酶 (HRP)标记鼠抗人μ链单克 隆抗体 ,引自附一医院临床检验试剂中心 ,工作效价 1∶1 000。 1. 4. 3 　3 ,3’,5 ,5’2四甲基联苯胺 ( TMB2H2O2) ,购自 北京原平浩生物技术有限公司。 1. 4. 4 　RuV2IgM 捕获 ELISA 法试验盒 　美国 Maxim 公司产品。 1. 5 　RuV2IgM ELISA 测定法 　RuV 抗原经效价滴定 后 ,选择适宜浓度包被微孔板 ,每孔 100μl ,4 ℃包被 过夜 ,洗板 3 次 ,加 10 %小牛血清 ———PBS 150μl/ 孔 ,37 ℃封闭 1 h。弃封闭液洗 3 次 ,加含羊抗人 IgG稀释液稀释的待测血清 (1∶200) ,37 ℃1 h。洗板 3 次加 HRP2抗人μ链单抗 ,37 ℃,1 h。洗板 3 次。 加 TMB2H2O2 底物溶液显色。用 2 mol/ L H2SO4 终止 反应。目测或测 450 nm A 值判断结果。Cut off 值系 测定 105 例正常健康人血清 , P/ N 值 ≥x + 2 s 来确 定。 2 　结果 2. 1 　重复性 　2 份阳性血清分别重复测定 20 次 ,得 批内 CV = 6. 2 % ,3 份阳性标本在 3 周内分别重复测 定 15 次 ,批间 CV = 5. 2 %。 2. 2 　特异性 2. 2. 1 　经进口捕获 ———ELISA 试剂盒证实 10 份 RuV 阳性血清作 1∶25 ,1∶50 ,1∶100 ,1∶200 ,1∶400 稀 释可得良好的剂量依赖曲线。 2. 2. 2 　其它病毒与 RuV 抗血清的交叉反应 　用 HVS21、HSV22 和 HCMV 抗原包被聚苯乙烯微孔反应 板 ,测定 10 例 RuV 阳性标本 ,同时设 RuV 阳性抗原 和阴性抗原对照。结果明 :10 例 RuV 阳性标本与 第 21 卷 　第 4 期 湖北医科大学学报 Vol. 21 ,No. 4 　2000 年 10 月 Acta Academiae Medicinae Hubei Oct ,2000 © 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net HSV21、HSV22、HCMV 无交叉反应。 2. 2. 3 　阻断实验 　a. 阳性标本 1∶200 稀释与不同稀 释度的 RuV 兔抗血清等量混合 ,置 37 ℃,30 min ,测 其 RuV/ IgM ,当 RuV 抗血清 1∶50 稀释时 ,A 值下降 ≥75 %。b. RuV 阳性标本 1∶200 稀释后 ,与 10 倍包 被反应板稀释度的抗原等量混合 ,37 ℃,30 min。测 其 RuV/ IgM A 值下降大于 80 %。 2. 3 　本法与进口 RuV/ IgM 捕获法试剂盒的符合率 　 我们分别用进口 RuV/ IgM 捕获法试剂盒和本实验室 建立的 RuV/ IgM2ELISA 测定 1993 年春季风疹大流 行期间收集的 165 例可疑风疹病人血清。结果表 明 :进口试剂盒测得 133 例阳性 ,本试剂盒检出阳性 142 例。两者符合数 (阳性符合数 + 阴性符合数) 为 138 例 ,符合率 = 符合数样品总数 = 84. 0 %。 2. 4 　风疹出疹后不同天数抗 RuV/ IgM 检出情况 　 从表 1 可见 ,血清中 RuV/ IgM 检出率与采样时间密 切相关 ,出疹 5～14 d 检出率最高。经统计学处理 , 出疹 3～14 d 后 RuV/ IgM 检出率明显高于出诊 29 d 后 RuV/ IgM 检出率。 表 1 　风疹出疹后不同天数 IgM检出率 出疹后天数 标本检测数 阳性数 ( %) 0～ 25 16 (64. 0) 3～ 61 56 (91. 8) 5～ 52 52 (100) 15～ 19 15 (78. 9) 29～60 8 3 (37. 5) 合计 165 142(86. 1) 3 　讨论 风疹是一种常见的传播广泛的急性病毒性传染 病[2 ,3 ,4 ] ,由于它有很强的致流产、死产和致畸胎作 用[4 ] , 日益为人们 所 重 视。我 们 参 考 有 关 文 献[5 ,6 ,7 ] ,以差速离心制备 RuV 抗原 ,建立了 RuV/ IgM2ELISA 检测方法。多次试验表明 :本法具有方法 简便、快速、重复性好、特异性强等优点。在 105 例 正常人血清中只发现 1 例 RuV/ IgM 阳性 ,经进口捕 获法试剂盒证实亦为阳性 ,说明本方法无非特异性。 为了减少传统间接 ELISA 测定 RuV/ IgM 中 RuV/ IgM 和类风湿因子的干扰 ,我们在样品稀释液 中加入高效价的羊抗人 IgG,克服了传统间接 ELISA 法中易出现的假阴性和假阳性。如果样品稀释后 37 ℃放置 30 min 效果更好。 我们按文献[8 ]抽提 RuV 血凝素作为 ELISA 包被 抗原 ,发现 RuV 经吐温 802乙醚处理后 ,包被效价下 降 10 倍以上。这一点在制备 RuV 抗原时应值得注 意。 1993 年春季 ,武汉市发生了大规模风疹流行。 从 2 月 1 日起出现散在风疹病人 ,4 月份达到高峰 ,7 月份基本结束。病人大多数为儿童和青少年。最小 者 1 岁半 ,最大者 25 岁。在 165 例已检可疑风疹病 人血清中 , RuV/ IgM 检出 142 例 , 阳性检出率为 86. 1 %。RuV/ IgM 检出率与病人出疹后的时间密切 相关 ,出疹后 5～14 d RuV/ IgM检出率达 100 % ,出疹 55 d 以后 ,RuV/ IgM基本消失。 参考文献 1 　曹茂开 ,赵新如. 风疹病毒特异性 IgM 酶联捕获法研究. 中华医学检验杂志 ,1990 ,13 :351 2 　戴斌 ,常慧兰 ,韩秀娟 ,等. 我国正常人群风疹免疫状况的 研究. 中华微生物学和免疫学杂志 ,1981 ,1(6) :411 3 　Waxham MN. Immunochemical identification of rubella virus hemagglutinin. Virology ,1983 ,126 :194 4 　Ho M. Laboratory diagnosis of congenital and perinatal infection in Ed. New York :Plenum Medical Book Company ,1982 ,172 5 　Iacona A. Enzyme linked immunosorbent assay ( ELISA) in the serodiagnosis of hydatid disease. Am J Trop Med Hyg ,1980 ,29 (1) :95 6 　Partanen P. Selective reactivity of antibodies to human im2 munoglbulins G,M and A with Rubella virus proteins. J Clin Mi2 crobiol ,1985 ,21 :800 7 　Castellano GA. Evaluation of commercially available diagnostic fest kits for Rubella. J Infect Dis ,1981 ,143 :578 8 　中国医学科学院流行病防治研究所. 常见病毒病实验技 术. 北京 :科学出版社 ,1978 ,249～256 (1999210220 收稿) (下转第 279 页) 962第 4 期 严银芳 ,等. 风疹病毒特异性 IgM诊断试剂盒的研制和临床应用 © 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net SCC Ag in bronchoalveolar lavage (BAL) and serum of patients with lung carcinoma. Neoplasm ,1992 ,39(5) :283 9 　Moriya H ,Snzuki S ,Aizumi J ,et al. A clinical study on CA1523 , CEA ,SCC Ag in patients with squamous cell carcinoma of the lung. Rinsho Hoshasen ,1989 ,34(1) :63 10 　Body JJ ,Sculier JP ,Raymakers ,et al. Evaluation of SCC antigen as a new marker for lung calcer. Cancer ,1990 ,65(7) :1 552 (1999211221 收稿) A Study on the Change of Squamous Cell Carcinoma Antigen of Model Rats with Lung Squamous Cell Carcinoma Hu Xuefeng ,Yang Fei , Chen Deji , et al Department of Pathology ,Basic Medical College ,Hubei Medical University ,Wuhan 430071 ,China Abstract Objective :To evaluate the significance of squamous cell cercinoma antigen (SCC Ag) in early diagnosis of squamous cell carcinoma of the lung. Methods : The squamous cell carcinoma of the lung was induced with methylcholanthrene (MCA) in iodized oil in Wistar rats. 91 rats were used for this experiment ,and the rats were sacrificed on the 20th ,40th , 50th ,60th ,70th and 80th days respectively. The stage of cancer development including atypical hyperplasia ,carcinoma in situ ,early invasive carcinoma and infiltrating cancer was diagnosed histopathologically. SCC Ag ,CEA and CA1523 in the serum of different stage rats were measured by MEIA technique. Results :The level of SCC Ag increased distinctly ( P < 0. 01) at the early invasive carcinoma ,but the other two markers had no change. Conclusion : It appears that SCC Ag level in serum may be of considerable importance in early diagnosis of squamous cell carcinoma of the lung. MeSH　squamous cell carcinoma ;lung neoplasms ;antigen ;methylcholanthrene (上接第 269 页) Studies And Applications of RuV/ IgM2ELISA Reagent Yan Yinfang , Chen Xiao , Yao Xuejun ,et al Virological Institute ,Basic Medical College ,Hubei Medical University ,Wuhan 430071 ,China Abstract Objective :To create a rapid ELISA method for the detection of RuV/ IgM and apply it to clinical practice. Methods : A reformed ELISA Reagent was developed and specific IgM antibodies to RuV in human sera were assayed. Results and Conclusion :This method did not intercross with HSV21 ,HSV22 and HCMV and this assay is considered as a technique of rapid and high sensitivity ,good specificity and simplicity. 142 samples were detected as positive in 165 samples of RuV dubious infections. These samples of RuV dubious infections were determined by our ELISA method of RuV/ IgM and American captured2IgM ELISA reagent ,and the results were highly comparative. The positive and negative coincidence rate was 84. 0 %. MeSH　rubivirus infections/ DI ;enzyme2linked immunosorbent assay ;reagent kits ,diagnostic 972第 4 期 胡雪峰 ,等. 鳞癌相关抗原在诱发性肺鳞癌癌变过程中动态监测的研究 © 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net