人源抗病毒基因工程抗体技术

人源抗病毒基因工程抗体技术 人源抗病毒基因工程抗体技术平台     随着抗体工程平台技术的逐渐完善，当今世界工程抗体的研究和开发趋向将逐渐从人源化基因工程抗体转向纯人源基因工程抗体。病毒病仍然是传染病死亡原因中的首要原因，至今无特异性治疗。人源抗病毒中和性基因工程抗体的产生无疑给各种病毒性传染病的特异性预防和治疗带来了新的希望，在抗病毒感染生物药领域逐渐形成了一类新的抗病毒药，即所谓的抗体药（ Antibody Drug）。     本实验室以预防和治疗用人源抗病毒基因工程抗体极其抗体制剂为研究目标，以人源噬菌体抗体库技术和高通量筛选技术，人源抗病毒基因工程抗体高效达载体系统、抗体生产、纯化和功能分析系统为技术支撑平台，对多种抗病毒基因工程抗体及其全抗体高效表达载体系统进行了研究，同时进行细胞内抗体，双抗体及多种其他基因工程抗体极其抗病毒免疫研究，先后研制成功了人源抗汉坦病毒、甲型肝炎病毒、乙肝病毒、戊肝病毒、狂犬病毒、流感病毒、AAV、CMV、SARS病毒等多种功能性基因工程抗体，并通过国际合作，发展了拥有自己知识产权的重组杆状病毒IgG表达载体系统及CHO细胞抗体生产系统，重组杆状病毒IgG表达载体系统目前获得较大的国际影响，已被国际上多家实验室应用，并已成为商业用载体；CHO细胞抗体生产系统已获得我国发明专利。同时研究成功了功能性抗甲肝病毒植物抗体和抗汉坦病毒转基因鼠人源全抗体。通过多年研究，已初步完成具有独立知识产权的抗体工程平台技术以及建立于该平台技术上的多种抗病毒基因工程抗体。研究成果对我国治疗用抗病毒工程抗体生物制剂的开发研究和我国主要传染病的预防和控制工作具有实际意义和良好的应用前景，建立的抗体工程平台技术也适用于其他病原微生物抗体等研究和应用。 人源抗病毒基因工程抗体技术平台技术主要包括以下几大方面： 1、人源大容量噬菌体抗体库和高通量筛选技术筛选     目前，大容量（>109）甚至超大容量非免疫人抗体库（>1011）已经成为制备人源性抗体的重要资源库，最常用抗体库技术基于噬菌体表面呈现技术（如图所示）。   1）人源抗病毒性免疫噬菌体抗体库的构建和功能抗体的获得     我们先后采集了多种病毒相关疾病恢复期病人或疫苗免疫后人外周血淋巴细胞，利用噬菌体表面呈现技术，先后建立了抗汉坦病毒、甲型肝炎病毒、乙肝病毒、戊肝病毒、狂犬病毒、流感病毒、AAV、CMV、SARS病毒、禽流感病毒等大容量人源免疫Fab噬菌体抗体库，库容在106到107数量级之间，并用特异性病毒抗原对相应抗体库进行了大量或高通量晒选，获得上述多种病原特异性的人源基因工程功能抗体，尤其是获得人源抗抗汉坦病毒（7株）、甲型肝炎病毒（2株）、狂犬病毒（3株）、SARS病毒（20株）和禽流感病毒（2株）等高亲和力并针对不同位点的中和抗体，目前多数抗体的功能鉴定等工作已完成，对我国治疗用抗病毒工程抗体生物制剂的开发研究和我国主要传染病的预防和控制工作具有实际意义和良好的应用前景。   2）大容量天然人源噬菌体抗体库的构建与筛选     为了构建大容量天然噬菌体抗体库，我们对噬菌体抗体库技术和Cre-Loxp定位重组系统进行了研究。结果表明抗体基因在定位重组载体系统内确实能够重组，表达的抗体具有其亲本Fab活性并且具有与特定抗原反应的能力。获得含有9×1010克隆的大容量噬菌体抗体库，鉴定插入率为87.5％。经序列分析表明该抗体库具有较高的多样性。为更多功能性抗体的筛选提供了保证。用纯化的埃博拉病毒核蛋白、肿瘤坏死因子、干扰素等对这一通用型抗体库进行了富集筛选，获得了107株具有Fab活性的抗体克隆，初步获得1株抗埃博拉病毒核蛋白人源抗体和3株特异性的针对肿瘤坏死因子的抗体。 3）高效辅助噬菌体与高效高通量筛选 高效噬菌体是一类pⅢ基因进行缺失突变但仍保留野生型pⅢ表型的辅助噬菌体，由感染带有完整pⅢ基因的工程菌产生。由于高效噬菌体缺乏有功能的pIII基因，这意味由噬粒提供的pIII-抗体融合蛋白是在高效噬菌体装配过程中pIII唯一的来源。这种方法显著增加噬菌体表面的抗体数量，抗原结合活性提高了近400倍。     我们通过国际合作， 获得了上述高效噬菌体筛选系统并进行了优化，利用高效噬菌体筛选系统和病毒病所中心实验室提供的自动化高通量移液工作站，进行了大容量抗体库的高通量筛选工作，初步建立了高通量筛选方法，尤其是在SARS和禽流感抗体库筛选中起到了高效快速的作用，为抗体工程技术的研究提供了高通量、多层次、高内涵的功能研究平台， 同时也极大拓展了抗体工程技术平台的研发能力。   2、重组杆状病毒/昆虫细胞人源IgG抗体快速表达载体系列     重组杆状病毒/昆虫细胞人源IgG抗体快速表达载体系列是专为来源于噬菌体抗体库的ScFv或Fab抗体转换为全抗体的一组通用型IgG抗体表达盒载体。该载体系统为我们原始创新成果，具有独立自主知识产权，已申报我国专利。利用该载体系统，我们已经成功地表达了抗汉坦病毒、甲型肝炎病毒、乙肝病毒、戊肝病毒、狂犬病毒、流感病毒、AAV、CMV、SARS病毒、禽流感病毒、RSV等10余种30余株抗病毒基因工程全抗体，并完成上述抗体的功能分析。论文在国际免疫学方法杂志发表后，引起国内外较大反响，曾被我国军事医学科学院、 德国海德堡大学、美国马省大学医学院、澳大利亚昆士兰大学，美国NIH，美国加州大学，加那大Waterloo大学等20几个实验室试用，目前已被商业化。该载体系统为创新性载体系统，可被用来快速克隆和鉴定来源于噬菌体抗体库的Fab或scFv抗体，并由于其高效表达性能，有望被用来作为临床治疗用人源抗体的表达载体。 3、一组生产用哺乳类细胞人源抗体高效表达载体（专利授权号：ZL01102214.0）      人源或人源化抗体研制最主要的目的是作为一种新型治疗性生物工程药物制剂而用于临床抗肿瘤和抗病毒感染。 一组生产用哺乳类细胞人源抗体高效表达载体，包括12种由不同元件定向组合而成的载体 （详见表1）其主要特征由真核细胞表达元件包括强启动子EF－1α或CMV、来源于人类基因组DNA或信使RNA的抗体分子轻、重链恒定区基因、内在核糖体识别位点及二氢叶酸还原酶基因的不同形式的定向组合而成，可被用来克隆抗体可变区或Fab基因，导入中华地鼠卵巢（CHO）细胞后获得不同来源抗体基因的永久性高效表达。其用途在于可被用来持续规模生产全人源IgG抗体或人源化抗体制剂而用于临床治疗，为抗体药物提供抗体生产载体平台系统。 该载体系统已用于多种人源抗病毒基因工程抗体生产细胞系的建立，其中抗甲肝病毒基因工程抗体已技术转让，目前正处于中试研究和报批阶段。CHO细胞表达的两株抗体仍保持很好的抗原结合活性及与中和性鼠抗甲肝病毒单克隆抗体的竞争抑制能力，为两株抗甲肝病毒不同抗原位点的抗体，并能与甲肝病人恢复期血清进行竞争抑制反应；同时在体外培养细胞中也证实了其对甲肝病毒的体外中和活性。恒河猴感染实验表明，重组抗体具有体内中和甲肝病毒的活性，有可能在甲肝的预防与控制中发挥作用。 表1  一组生产用哺乳类细胞人源抗体高效表达载体   重链表达载体                        主要元件及排列顺序 VH-dhfr1                 EF-1a-先导分泌肽-VH 可隆位点 (BssHII+BstEII) CH1-内含子                                 -CH2-内含子-CH3-BGHpolyA-SV40ori-DHFR-SV40polyA VH-dhfr2                 EF-1a-先导分泌肽-VH可隆位点(Xho+NheI)- CH1-                                 CH2-CH3-BGHpolyA-SV40ori-DHFR-SV40polyA VH-dhfr3                 EF-1a-先导分泌肽r-VH可隆位点(Xho+SpeI)- Fc-BGHpolyA                                 -SV40ori-DHFR-SV40 polyA VH- IRES -dhfr1     EF-1a-先导分泌肽r-VH可隆位点(BssHII+BstEII)- CH1                                 -intron-CH2-intron-CH3-intron-IRES-DHFR-SV40 polyA VH- IRES- dhfr2     EF-1a-先导分泌肽-VH可隆位点(XhoI+NheI)-CH1-CH2-CH3-intron                                 -IRES-DHFR-SV40 polyA          VH- IRES-dhfr3      EF-1a-先导分泌肽-VH可隆位点(XhoI+SpeI)- Fc-intron-IRES-DHFR-SV40 polyA __________________________________________________________________ 轻链表达载体                               主要元件及排列顺序 VK-dhfr1                 EF-1a-先导分泌肽-VK orVL可隆位点(EcoRV+XhoI)-CK-intron-                                 CK polyA-SV40ori-DHFR- SV40 polyA VK-dhfr2                 EF-1a-先导分泌肽-VK可隆位点 (EcoRV+HindIII)-                                 CK-CK polyA-SV40ori-DHFR-SV40 polyA VL-dhfr3                  EF-1a-先导分泌肽-VL可隆位点 (EcoRV+HindIII)-                                 CL-CK polyA-SV40ori-DHFR-SV40 polyA VK-IRES-dhfr1       EF-1a-先导分泌肽-VK orVL可隆位点(EcoRV+XhoI)-                                 CK-intron -IRES-DHFR-SV40 polyA VK-IRES- dhfr2      EF-1a-先导分泌肽-VK可隆位点                                 （EcoRV + HindIII）-CK-IRES-DHFR-SV40 polyA VL-IRES -dhfr3      EF-1a-先导分泌肽-VL可(EcoRV+HindIII)-CL-IRES-DHFR-SV40 polyA ………………………………………………………………………………………… 4、植物中表达人源抗病毒基因工程抗体 植物表达系统因其具有真核基因表达调控及转录翻译加工的成套系统，并且可以大规模生产、成本低廉；可最大程度地降低影响人类健康的病原微生物或有毒物质的污染，在其中大量表达重组蛋白是一种吸引人的经济可行的选择。 我们证明scFv-Fc 抗体(在种子储存蛋白特异性起动子控制下，N-端含有信号肽序列，C-端含有KDEL内质网定位序列) 可以以双价IgG样的抗体分子在转基因Arabidopsis thaliana（拟楠芥）种子中聚集到很高的水平，并且证明由此获得的抗甲肝病毒(HAV) scFv-Fc抗体与相应的全长IgG抗体相比，具有类似的抗原结合活性及体外中和甲肝病毒的能力。表达的抗体蛋白与内质网分子陪伴Calreticulin及BiP蛋白，以及内源种子储存蛋白Cruciferin共同在细胞周质腔的异常定位表明，重组抗体蛋白的过量表达打破了常规的抗体分泌途径中内质网滞留及蛋白定位机制。 同时我们在Arabidopsis thaliana 种子中还表达并纯化了人源抗病毒IgG抗体，表达量与不同的抗体序列密切相关；在Arabidopsis thaliana 悬浮培养细胞及叶子中(在花椰菜嵌纹病毒35SRNA基因起动子P35S控制下)表达并纯化了抗甲肝病毒IgG抗体，并且证明表达的抗体与相应的全长IgG抗体相比，具有类似的抗原结合活性及体外中和甲肝病毒的能力。以上结果证明了植物表达系统表达人源抗病毒抗体的可行性，进一步完善了抗体工程平台，为新型基因工程抗体药物的生产和制备提供了实验基础。   5、在转基因鼠中表达人源抗汉坦病毒G2蛋白中和性基因工程抗体 与中国农业大学李宁教授实验室合作，将人源抗汉坦病毒G2糖蛋白中和抗体轻重链基因分别克隆入小鼠乳腺表达载体，等比例混合后共同注射受精卵雄原核制备转基因小鼠，获得6只抗体轻重链均整合的转基因阳性小鼠，成功地在转基因小鼠乳腺中获得人源抗汉坦病毒G2糖蛋白中和抗体的高效表达，在F0代和F1代多个转基因小鼠乳汁中检测到重组抗体，也在转基因雌鼠乳汁喂养的幼鼠血清中检测到重组抗体，其最高表达量可达6.6 mg/ml。所有在转基因雌鼠乳汁中及转基因雌鼠乳汁喂养的幼鼠血清中检测到的重组抗体都保持了对汉坦病毒的抗原结合活性及体外中和活性。转基因雌鼠乳汁喂养的幼鼠血清中得到的重组抗体轻链被N-端糖基化所修饰（故在Western-blot中在N-glycosidase处理前后转基因雌鼠乳汁喂养的幼鼠血清中重组轻链抗体的迁移大小不同），重链的迁移变化是由于其它蛋白影响或抗体不纯引起的。这些转基因鼠可以被用来探索生产具有治疗作用的重组人源基因工程抗体的可能性。  6、抗汉坦病毒抗体在细胞内定位表达（细胞内抗体） 细胞内抗体在细胞内合成定位于特定的细胞结构，是通过异位表达重组抗体方法在哺乳动物细胞内进行表型敲除的新策略，能够抑制特定基因的表达，提供较精确的方法分析和操作微生物的和细胞的生存代谢方式。 我们成功地在细胞内质网和细胞浆中表达了功能性ScFv抗体并建立其相应的传代细胞系,并对上述不同的细胞内抗体作了抗原抗体相互作用和功能分析。在国际上首次发现和证实汉坦病毒核蛋白进入内质网。我们的研究结果向传统的汉坦病毒成熟包装病毒观念提出了挑战，我们认为，汉坦病毒的核蛋白至少在cis-Golgi阶段进入高尔基体，并且可以在没有病毒糖蛋白存在的情况下进入膜结构。病毒装配也可能在这个阶段或更早发生，在膜内运输的过程中逐渐成熟最后出芽，或者核衣壳在膜内运输到在反式高尔基体再与糖蛋白结合开始病毒装配、成熟、出芽。但是，汉坦病毒N 蛋白没有被发现进入细胞内质网所需的先导肽， 汉坦病毒N 蛋白如何进入内质网极其进入后的作用仍然是个谜。利用细胞内抗体研究手段，可以对病毒成熟包装机制等进行研究。（Presentations on Nagative Straid Virology Meeting 2003, ASV 2007）。