3基因工程制药

null第三章 基因工程制药第三章 基因工程制药第一节 概述第一节 概述 意义：自20世界70年代基因工程诞生以来，最先应用基因工程技术且目前最为活跃的研究领域便是医药科学。基因工程技术的迅猛发展使人们已能够十分方便有效地生产许多以往难以大量获得的生物活性物质，甚至可以创造出自然界中不存在的全新物质。1982年第一个基因重组产品——人胰岛素在美国问世，吸引和激励了大批科学家利用基因工程技术研制新药品，迄今累计已有近30种基因工程药物投入市场，产生了巨大的社会效益和经济效益。 null基因工程技术可生产的药物和制剂包括： （1）免疫性蛋白，如各种抗原和单克隆抗体； （2）细胞因子，如各种干扰素、白细胞介素、集落刺激生长因子、皮生长因子、凝血因子； （3）激素，如胰岛素、生长激素、心素纳； （4）酶类，如尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤维蛋白溶酶原激活剂、超氧化物歧化酶。null我国基因工程药物研究和开发：起步较晚，基础较差。α1b 型基因工程干扰素是由我国自行研制开发的具有国际先进水平的生物高科技成果，于1997年 通过Ⅲ 期临床，并获得国家一类新药证书，成为“863”生物技术领域第一个实现产业化的基因工程药物。目前我国已批准12种基因工程药物和疫苗上市，在研究开发中的也有10余种。 第二节 基因工程药物生产的基本过程第二节 基因工程药物生产的基本过程定义：基因工程技术是指将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌（或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因再工程菌内进行复制和表达。 基因工程技术最成功的成就:用于新型生物技术药物的研制 null传统制药存在的问题： A、材料来源困难或制造技术问题而无法付诸应用； B、从动物脏器中提取出来，也因造价太高，或因来源困难而供不应求； C、由于免疫抗原等缘故，使它们在使用上受到限制。 基因工程技术的特点：就是能够十分方便有效地生 产许多以往难以大量获取的生物活性物质，甚至可 以创造出自然界中不存在的全新物质。基因工程技术的应用特点基因工程技术的应用特点 A、为癌症、病毒性疾病、心血管疾病和内分泌疾病的预防、治疗和诊断提供新型疫苗、新型药物和新型诊断试剂。 B、基因工程技术的最大好处在于它能从极端复杂的机体细胞内取出所需要的基因，将其在体外进行剪切拼接、重新组合，然后转入适当的细胞进行表达，从而生产出比原来多数百、数千倍的相应的蛋白质。 基因工程技术生产药品的优点基因工程技术生产药品的优点 a. 可大量生产过去难以获得的生理活性多肽和蛋白质，为 临床使用提供有效的保障； b. 可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理生化 和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围； c. 利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性 物质； d. 内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处， 可以通过基因工程和蛋白质工程进行改造； e. 利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来 源。null基因工程的诞生与及其相关学科的关系null“863”高技术计划在生物技术领域研究的三个主题之一是：新型药物、疫苗和基因治疗，重点是利用现代生物技术手段，开发化学合成法难以生产的药品。“十五”期间，863计划选择了信息技术、生物和现代农业技术、新材料、先进制造与自动化技术、能源技术、资源环境技术等6个高技术领域 。null基因工程药物的生产分为上游和下游两个阶段： 上游阶段：主要是分离目的基因、构建工程菌(细胞)。目的基因获得后，最主要的就是目的基因的表达。选择基因表达系统主要考虑的是保证表达的蛋白质的功能，其次是表达的量和分离纯化的难易。 此阶段的工作主要在实验室内完成。 下游阶段：从工程菌的大量培养一直到产品的分离纯化和质量控制。此阶段是将实验室的成果产业化、商品化，主要包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发，分离纯化的优化控制，高纯度产品的制备技术，生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计算机的优化控制等。 基因工程药物生产的基本过程null基因工程的主要操作技术 一、聚合酶链反应基因工程的主要操作技术 一、聚合酶链反应聚合酶链反应即PCR技术，1983 年由美国Mullis 发明，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA 序列的方法，该技术的发明对分子生物学发展起到极大的推动作用，发明者获得了1993 年度诺贝尔化学奖。 PCR 技术的特点是：①能够指导特定DNA 的序列合成；②使特定DNA片段获得迅速大量扩增。 PCR反应主要分为3 个部分进行变性、退火、延伸。 二、 DNA的序列测定二、 DNA的序列测定现在测定DNA 序列主要有两类方法，Sanger 等提出的酶法和Maxam 及Gilber 提出的化学降解法。两种方法尽管大相径庭，但结果却是一致的。 DNA 测序技术的若干进展: （1）PCR 测序 （2）热循环测序 （3）DNA自动测序 三、基因文库的构建三、基因文库的构建基因组文库是包含有某物种全部基因随机片段的重组DNA克隆的集合体。构建时需首先提取细胞（真核或原核）染色体DNA ，经特定限制性内切酶酶切后，成为具有一定大小范围的片段，与选择的适当载体连接后，经体外包装并转染细菌，得到含不同DNA片段的重组噬菌体颗粒，由于其包括了所需基因组的全部基因片段，因此构成了基因组文库。 另外，基因工程中最基本的技术方法如核酸凝胶电泳、分子杂交及细菌转化等，实际上它们对基因工程的发展也有十分重要的作用。 第三节 目的基因的获得第三节 目的基因的获得问题：来源于真核细胞的产生基因工程药物的目的基因，为什么不能进行直接分离？ 目的基因的获取途径： 一、逆转录法 逆转录法是先分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成cDNA，然后进行cDNA的克隆表达。 1、mRNA的纯化 mRNA的特点：3’末端含有一多聚腺苷酸组成的末端。 方法：亲和层析法null纤维素柱纯化Poly(A)mRNA 流程图null2、cDNA第一链的合成 一般 mRNA都带有3’－polyA，所以可以用寡聚dT作为引物，在逆转录酶的催化下，开始cDNA链的合成。 用放射性探针法检测。 3、cDNA第二链的合成 以cDNA第一链为模板合成第二链。 4、cDNA克隆 用于cDNA克隆的载体有两类：质粒DNA和噬菌体。又将其分为表达型载体和非表达型载体。选用表达型载体可以增加目的基因的筛选方法，有利于目的基因的筛选。 cDNA片段与载体的连接通常采用下面方法： 加同聚尾连接：在载体和cDNA的3’末端加上互补的同型多聚体序列。 人工接头连接：所谓人工接头是指用人工合成的、连接在目的基因两端的含有某些限制酶切点的寡核苷酸片断。null5、将重组体导入宿主细胞 6、 cDNA文库的鉴定 7、目的cDNA克隆的分离和鉴定 （1）核酸探针杂交法 （2）免疫反应鉴定法 逆转录－聚合酶反应法。该方法是mRNA经逆转录合成cDNA第一链，不需再合成第二链，而是在特异引物的协助下，用PCR法进行扩增，特异地合成目的cDNA链，用于重组，克隆。 null二、化学合成法 较小的蛋白质和多肽的编码基因可以用人工化学合成法获得。 化学合成法有个先决条件是：必须知道目的基因的核苷酸排列顺序，或知道目的蛋白质的氨基酸顺序，再按相应的密码子推导出DNA的碱基系列。 方法：合成目的基因DNA不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两端形成粘性末端的DNA双链片段，然后将这些双链片段按正确的次序进行退火连接成较长的DNA片段，再用连接酶连接成完整的基因。null人工化学合成基因的限制： a. 不能合成太长的基因。最长50-60bp.只适用于克隆小分子肽的基因。 b. 人工合成基因时，遗传密码的简并会为选择密码子带来很大困难， 如用氨基酸顺序推测核苷酸序列，得到的结果可能与天然基因不完 全一致，易造成中性突变。 c. 费用太高。null目的基因的用途目的基因的用途 （1） 研究该基因的全貌和内涵，如详细基因的结构、功能及调控； （2) 用正常的目的基因与异常基因分析对比，寻找其异常点，进而探索疾病发生的分子生物学机制及治疗策略； （3) 研究生物种系进化与相关同源性； （4) 采用基因重组技术，使目的基因在体外获得高效表达，生产所需要的生物活性蛋白及多肽（如干扰素、胰岛素等药物）； （5） 通过基因突变、缺失或拼接改造某种目的基因，以改良品种，生产新型的生物活性 物质，促进经济发展； （6) 建立基因治疗，如选用和克隆某种正常基因，引入患者细胞内，以对某些遗传病、肿瘤等疑难疾病进行基因治疗。 null 第二节 基因表达 克隆蛋白质药物基因的一个主要目的使为了高效的表达该基因，从而大量地市场原本难以获得的药物。 基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下一个外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得既有原生物活性又可高产的表达产物。 进行基因表达研究的主要问题是目的基因的表达产量、表达产物的稳定性、产物的生物学活性和表达产物的分离纯化。因此，建立最佳的基因表达体系，是基因表达设计的关键。null 以Fusion Protein的形式表达药物基因 许多蛋白质药物与原核生物的蛋白质融合后，能保留原有的免疫原性。一些免疫原性弱的多肽制成融合蛋白，其免疫原性能得到加强。用这种融合蛋白免疫动物所制备的抗体，能够用于检测原来的多肽药物，也可用于药代动力学研究，药物受体研究以及药物产品的检测。 有些情况下，采用融合蛋白的形式表达外源基因是不得以而为之。一些多肽药物在原核细胞中不稳定，难以获得高表达。这些蛋白与菌体蛋白融合后得到稳定，但融合蛋白需经过后处理才能释放出有活性的外源多肽。 多肽药物的纯化通常较为困难，但与特定的原核蛋白融合后，不仅能稳定所表达的产物，还能用识别蛋白的配体进行亲和层析纯化。如GST（(蛋白标签单克隆抗体)-融合基因，所产生的融合蛋白可用谷胱甘肽亲和柱一次性纯化。null一、宿主细胞的选择 宿主细胞的基本要求： ① 容易获得较高浓度的细胞； ② 能利用易得廉价原料； ③ 不致病、不产生内毒素； ④ 发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态； ⑤ 容易进行代谢调控； ⑥ 容易进行DNA技术操作； ⑦ 产物的产量、产率高，且易提取纯化。null宿主细胞的 分类： ① 原核细胞，常用的有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链 霉菌等； ② 真核细胞，常用的有酵母、丝状真菌、哺乳动物细 胞。 1、原核细胞 （1）大肠杆菌：表达产物的形式：细胞内不溶性表达（包含体）、胞内可溶性表达、细胞周质表达，极少还可分泌到胞外表达。不同的表达形式具有不同的表达水平，且会带来完全不同的杂质。null特点: A、大肠杆菌中的表达不存在信号肽，故产品多为胞内 产物，提 取时需破碎细胞，此时细胞质内其他蛋白 也释放出来，因而造成提取困难。 B、由于分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的 包含体(inclusion body)，表达产物必须在下游处理 过程中经过变性和复姓处理才能恢复其生物活性。null C、在大肠杆菌中表达不存在翻译后修饰作用，故对蛋白质产物不能糖基化，因此，只适于表达不经糖基化等翻译后修饰仍具有生物功能的真核蛋白质，在应用上受到一定的限制。 由于翻译常从甲硫氨酸的AUG密码子开始，故目的蛋白质的N端常多余一个甲硫氨酸残基，容易引起免疫反应。大肠杆菌会产生很难除去的内毒素，还会产生蛋白酶而破坏目的蛋白质。 null （2）枯草芽孢杆菌：分泌能力强，可将蛋白质产物直接分泌到培养液中，不形成包含体。该菌也不能使蛋白质糖基化，另外由于它有很强的胞外蛋白酶，会对产物进行不同程度的降解，因此，它的应用也受到限制。 （3）链霉菌：重要的工业微生物。特点是不致病、使用安全，分泌能力强，可将表达产物直接分泌到培养液中，具有糖基化能力，可做理想的受体菌。null2、真核细胞 （1）酵母：繁殖迅速，可廉价的大规模培养，而且没有毒性，基因工程操作与原核生物相似，表达产物直接分泌到细胞外，简化了分离纯化工艺。表达产物能糖基化。特别是某些在细菌系统中表达不良的真核基因，在酵母中表达良好。目前以酿酒酵母应用最多。干扰素和乙肝表面抗原已获成功。 （2）丝状真菌：很强的分泌能力；能正确进行翻译后加工，包括肽剪切和糖基化；而且糖基化方式与高等真核生物相似；丝状真菌（如曲霉）被确认是安全菌珠，有成熟的发酵和后处理工艺. null（3）哺乳动物细胞：由于外源基因的表达产物可由重组转化的细胞分泌到培养液中，培养液成分完全由人控制，从而是产物纯化变得容易。产物是糖基化的，接近或 类似于天然产物。 但动物细胞生产慢，生产率低，而且培养条件苛刻，费用高，培养液浓度较稀。 虽然从理论上讲，各种微生物都可以用于基因表达，但由于克隆载体、DNA导入方法以及遗传背景等方面的限制，目前使用最广泛的宿主菌仍然是大肠杆菌和酿酒酵母。null二、大肠杆菌中的基因表达 1、载体：表达载体必须具备的条件 （1）载体能够独立的复制； （2）具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记。且克隆位点应在启动子序列后， 以使克隆的外源基因得以表达； （3）具有很强的Promoter，能为大肠杆菌的RNA聚合酶所识别； （4）具有Repressor，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录； null （5）具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因， 而不转录无关的基因。 （6）所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号，即起始密码AUG和SD序列， 以便转录后能顺利翻译。 实例：pBV220系统 中国预防医学科学院病毒学研究所构建。已成功的用于表达 IL-2/3/4/6/8、 TFNα、TNFγ、TNF、 G-CSF、 GM-CSF等细胞因子。 问题:阻遏子repressor的阻遏作用对host cell有何影响？对foreign gene的表达有无影响？null2、影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素 外源基因的表达产量----单位体积产量------细胞浓度和每个细胞平均表达产量呈正相关。细胞浓度与生长速率、外源基因拷贝数和表达产物产量之间存在着一个动态平衡，只有保持最佳的动态平衡才能获得最高产量；单个细胞的产量又与外源基因的拷贝数、基因表达效率、表达产物的稳定性和细胞代谢负荷等因素有关。因此必须从以下因素入手，寻找提高外源基因表达效率的有效途径： null （1）外源基因的拷贝数：与载体在宿主中的拷贝数直接 相关。 （2）外源基因的表达效率：启动子的强弱，SD序列和 启始密码的间距等。 A、启动子的强弱：目的基因插入表达载体启动子的 下游，可增加基因的表达。lac、trp、 tac、 bla。 B、核糖体结合位点的有效性 C、SD与启始密码的间距：影响非融合蛋白的合成水平 D、密码子组成：设计引物或合成基因时选择大肠杆 菌“偏爱”的密码子； null（3）表达产物的稳定性：组建融合蛋白；利用信号肽； 位点特异突变，改变二硫键位置；宿主蛋白酶缺陷 （4）细胞的代谢负荷：抑制外源基因的表达；宿主细胞 的生长与重组质粒的复制分开； （5）工程菌的培养条件：host---Vector ---cloning genenull3、真核基因在大肠杆菌中的表达方式 （1）以融合蛋白的形式表达药物基因：融合蛋白氨基端是原核序列，羧基端是真核序列。优点：操作简便，蛋白质在菌体内比较稳定；易高效表达；但只能做抗原。?? 一般不做人体注射用药。 （2）以非融合蛋白的形式表达药物基因：易被蛋白酶破坏；N端有甲硫氨酸，易引起免疫反应。 （3）分泌型表达蛋白药物基因：外源基因融合到原核蛋白信号肽序列的下游。null三、酵母中的基因表达 1、载体 酵母载体是可以携带外源基因在酵母细胞内保存和复制，并随酵母分裂传递到子代细胞的 DNA或RNA。 A) Yep类（Yeast episomal plasmid） B) YRp 类(Yeast replication plasmid) C) YC p 类(yeast centromeric plasmid)：复制序列为ARS，并含有酵母染色体中心粒、端粒成分，稳定性好，但拷贝数只有一个，转化频率103~104/μg DNA。 D) YI p(yeast integrative plasmid):含有可与酵母染色体重组的序列，可以完全整合到染色体中。因此它依靠酵母染色体进行复制，具有很好的稳定性。拷贝数只一个，转化频率1~100 / μg DNA。null（2）克隆载体 向酵母载体中引入大肠杆菌质粒pBR322的ori 部分和Ampr 或Tetr 部分，这样构成的载体同时带有细菌和酵母的复制原点和选择标记。 （3）表达载体 将酵母菌的启动子和终止子等有关控制序列引入载体的适当位点后，就构成了酵母菌的表达载体。分普通表达载体和精确表达载体。null2、影响目的基因在酵母菌中表达的因素 （1）外源基因的拷贝数：高度稳定、高拷贝---高表达 （2）外源基因的表达效率：启动子 （3）外源蛋白的糖基化：酵母分泌的异源蛋白糖基化产物与天然产物完全相同。 （4）宿主菌珠的影响：菌体生长力强；菌体内源蛋白酶要弱；菌株性能稳定；分泌能力强。null四、动物细胞中的基因表达 外源基因的表达产物可由重组转化的动物细胞分泌到培养液中，培养液成分完全由人工控制，从而使产物纯化变得容易。基因产物是糖基化的，接近或类似于天然产物。 但动物细胞生长慢，单位体积的生产率低，培养条件苛刻，费用高。目前用于表达外源基因的细胞均为传代细胞。 三类主要基因工程表达体系的比较 表达体系 产 物 产生部位 培养方式 提纯 产物活性 浅在危险 大肠杆菌 多肽、蛋白 菌体内 容易 一般 对原核好 不大 融合蛋白 部分可高产 酵 母 多肽、蛋白 菌体内 容易 菌体内 真核接近 不大 糖基化蛋白 分泌出细胞 可高产 复杂 天然 动物细胞 完整 分泌出细胞 较难 简单 几乎可为 可能有 糖基化蛋白 成本高 天然产物 致癌因 可高产 素 null第三节 基因工程菌的稳定性（stability） 一、质粒不稳定产生的原因 分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。(常见) 结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。 工程菌的质粒不稳定因素： 一 是含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率； 二是这两种菌的比生长速率差异的大小。null 对同一工程菌，通过控制不同的比生长速率可以改变质粒的拷贝数：含低拷贝质粒的工程菌产生不含质粒子代菌的频率较大，增加质粒拷贝数能提高质粒的稳定性； 含高拷贝质粒的工程菌产生不含质粒子代菌的频率较低，但是大量外源质粒的存在使含质粒菌的工程菌的比生长速率明显低于不含质粒菌，而不含质粒菌一旦产生，能较快地取代含质粒菌而成为优势菌，对质粒的稳定性不利。 质粒稳定性的分析方法： 样品稀释----涂板----10-12h----挑选100个菌落----接种抗性标记的平版---10-12h---统计菌落数—计算%null二、提高质粒稳定性的方法 1、两阶段培养法：第一阶段使菌体生长至一定密度，第二阶段诱导外源基因的表达。在培养基中加入选择性压力如抗生素等，以抑制质粒丢 失菌的生长。 2、通过控制环境参数（温度、pH、培养基组分和溶解氧浓度），调节比 生长速率，使工程菌生长具有优势。有些含质粒的菌对发酵环境的改变 比不含质粒的菌反应慢，因而间歇改变培养条件以改变这两种菌的比 生长速率，可以改善质粒的稳定性。第六节 基因工程菌生长代谢的特点第六节 基因工程菌生长代谢的特点对菌体生长的调控主要有两种观点：一种认为能量的供应决定了菌体的最大比生长速率；另一种认为是小分子前体和催化组分等等的限制决定了菌体的最大比生长速率。 一、菌体生长与能量的关系 当菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢所能提供的能量时，菌体往往会产生代谢副产物乙酸。产生乙酸的机制还不完全清楚，一般认为是由于呼吸链或三羧酸循环的供能不足，使部分乙酰辅酶A通过转化为乙酸来供能。高浓度的乙酸能明显抑制菌体的生长。null分批培养中选用不同的碳源、补料培养中控制补料速度、连续培养中控制稀释速率等培养方法，都能在一定范围内控制菌体的生长，从而控制乙酸的产生，减少它的抑制作用，以实现工程菌的高密度培养和提高重组产物的表达水平。 实质：控制菌体的糖酵解速度，使之低于三羧酸循环和呼吸链的最大代谢能力，从而避免乙酰辅酶A的积累和乙酸的产生，以降低供能速度或前体供应速度来降低蛋白合成和菌体生长速度。 二、菌体生长与前体供应的关系 由于菌体中小分子前体量和催化结构是有限的，因而生物大分子和合成处于亚饱和状态，限制了菌体的比生长速率。基因表达在各个水平的竞争又是各个基因互相竞争共同的前体和催化结构的结果。由于基因工程菌质粒的复制和外源基因的转录和翻译需要与宿主null细胞竞争共同的前体和催化结构，从而加剧了这些成分的不足，因而在同样的培养基中，工程菌的比生长速率往往低于其宿主细胞，特别是工程菌诱导后，由于外源基因的大量表达，引起菌体比生长速率下降，甚至生长停滞。 “严紧反应”：当氨酰tRNA不足时，核糖体在密码子上停留，合并称为“魔点”的ppGpp的结果。严紧反应严紧反应当细菌发现它们自己生长在饥饿的条件下，缺乏维持蛋白质合成的氨基酸时，它们将大部分活性区域都关闭掉。此就称为严紧反应(strigent response)，这是它们抵御不良条件，保存自己的一种机制。细菌通过仅仅维持最低量的活性来节约其资源，直到条件改善时，它们又恢复活动，所有代谢区域也都活跃起来。 严紧反应导致rRNA和tRNA合成大量减少（10-20倍），使RNA的总量下降到正常水平的5-10%，部分种类的mRNA的减少，导致mRNA总合成量减少约3倍。而蛋白质除解的速度增加,很多代谢进行调整，显然核苷酸，碳水化合物，肽类等的合成都随之减少。 严紧反应导致两种特殊核苷酸积聚：(1)ppGpp—四磷酸鸟苷（在G的5'和3'位点各附着两个磷酸）;(2) pppGpp—五磷酸鸟苷（鸟苷5'一三磷酸-3'二磷酸）。 第七节 基因工程菌发酵第七节 基因工程菌发酵基因工程菌的培养过程主要包括： （1）通过摇瓶操作了解工程菌生长的基础条件，如温度、pH、培养基各种组分以及碳氮比，分拆表达产物的合成、积累对受体细胞的影响； （2）通过培养罐操作确定培养参数和控制的方案以及顺序。 一、基因过程菌的培养方式 常用的有：补料分批培养、连续培养、透析培养、固定化培养。 1、补料分批培养 将种子接入发酵反应器中进行培养，经过一段时间后，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方式。 null2、连续培养 将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至一定浓度后，开动进料和出料的蠕动泵，以控制一定稀释率进行不间断的培养。 3、透析培养 利用膜的半透性原理使代谢产物和培养基分离，通过去除培养液中的代谢产物来解除其生产菌的不利影响。 4、固定化培养 二、基因工程菌的发酵工艺 基因工程菌的发酵工艺与传统的微生物发酵工艺的区别：（1）生物材料方面（2）生产目的方面 1、培养基的影响 常用碳源有葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。null常用的氮源有酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解产物、玉米浆和氨水、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵等。 另外还要加一些无机盐、微量元素、维生素、生物素等。对营养缺陷型菌株还要补加相应的营养物质。 2、接种量的影响 接种量是指移入的种子液体和培养液体积的比例。接种量小，不利于外源基因的表达，大接种量有利于对基质的利用，缩短生长延迟期，并使生产菌能迅速占领整个培养环境，减少污染机会，但接种量过高又会抑制后期菌体的生长。所以接种量大小取决于生产菌种在发酵中的生长繁殖速度。 3、温度的影响 温度对基因表达的调控作用可发生在复制、转录、翻译或小分子调节分子的合成水平上。 null在复制水平上，可通过调控复制，改变基因拷贝数，影响基因表达；在转录水平上，可通过影响RNA聚合酶的作用或修饰RNA聚合酶，来调控基因表达；温度也可在mRNA讲解和翻译水平上影响基因表达，温度还可能通过细胞内小分子调节分子的量而影响基因表达，也可通过影响细胞内ppGpp量调控一系列基因表。 温度还影响蛋白质的活性和包含体的形成。 4、溶解氧的影响 溶解氧是工程菌发酵培养过程中影响菌体代谢的一个重要参数，对菌体的生长和产物的生成影响很大。 外源基因的高效表达和翻译需要维持较高水平的DO2值。 通常采用调节搅拌转速的方法，可以改善培养过程中的氧供给，提高活菌产量。null5、诱导时机的影响 一般在对数生长期或对数生长后期升温诱导表达。 6、pH的影响 pH对细胞的正常生长和外源蛋白的高效表达都有影响，所以应根据工程菌的生长和代谢情况，对pH进行适当的调节。 总之，工程菌发酵工艺的优化对异源蛋白的表达关系重大，必须建立最佳化工艺。 三、基因工程菌的培养设备 发酵罐的组成部分有：发酵罐体、保证高传质作用的搅拌器、精细的温度控制和灭菌系统、空气无菌过滤装置、残留气体处理装置、参数测量与控制系统以及培养液配置及连续操作装置等。第八节 基因工程药物的分离纯化第八节 基因工程药物的分离纯化许多医药生物技术产品都是活性肽或蛋白质。这些产品的制得具有下列特点： （1）目的产物在初始物料中含量较低（2）含目的产物得初始物料组成复杂，且影响较大（3）目的产物得稳定性差（4）种类繁多（5）应用面广，对其质量、纯度要求高，甚至要求无菌、无热原等。 因此，为了获得合格得目的产物，必须建立与上述特点相适应的医药生物技术产品的分离纯化工艺。null一、建立分离纯化工艺的依据 1、含目的产物的起始物料的特点：包括（1）菌种类型及其代谢特性（2）原材料和培养基的来源及其质量（3）生产工艺和条件（4）初始物料的物理、化学和生物学特性。 2、物料中杂质的种类和性质 3、目的产物特性 4、产品质量的要求 二、分离纯化的基本过程 分离纯化是基因工程药物生产中极其重要的一环。一般不应超过4～5个步骤，包括细胞破碎、固液分离、浓缩与初步纯化、高度纯化直至得到纯品以及成品加工。流程如图所示。null 基因工程药物分离纯化的一般流程发酵液细胞分离胞内产物胞外产物细胞破碎固液分离包含体细胞碎片分离变 性复 性浓 缩初步分离高度纯化制 剂产 品null三、分离纯化的技术 分离纯化技术应满足下列要求：（1）技术条件要温和（2）选择性要好（3）收率要高（4）两个技术之间要能直接衔接（5）整个分离纯化过程要快 1、细胞破碎与固液分离：有细胞收集、细胞破碎和细胞碎片分离等步骤。 （1）细胞收集：细胞收集常用的是离心分离的方法，膜过滤法液逐步得到广泛应用。 （2）细胞破碎：有机械破碎法和非机械破碎法。 机械破碎法：高压匀浆法、超声破碎法、高速珠磨法、高压挤压法 非机械破碎法：酶溶法、化学渗透法、热处理法、渗透压冲击法等。null（3）固液分离：离心沉淀是固液分离的主要手段，包括高速离心和超速离心。常用的膜过滤技术有微滤、超滤和反渗透等。 2、目的产物的分离纯化 主要依赖色谱分离方法。色谱技术分为离子交换色谱、疏水色谱、反相色谱。亲和色谱、凝胶色谱、高压液相色谱等。 蛋白质纯化方法的设计通常根据产物分子的物理、化学参数和生物学特性，他们对分离纯化的影响见表。 选择纯化方法应根据目的蛋白质和杂蛋白的物理、化学和生物学方面性质的差异，尤其重要的是表面性质的差异。 null（1）离子交换色谱（ion exchange chromatography,IEC）基本原理是通过带电的溶质分分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换，从而达到分离的目的。 蛋白质的等电点和表面电荷的分布主要影响其离子交换的性能，影响蛋白质离子交换色谱保留的其他因素，还有交换基团和交换介质的种类、吸附和洗脱的条件等。 （2）反相色谱（reversed phase chromatography,RPC）和疏水色谱（hydrophobic interaction chromatography,HIC） 反相色谱和疏水色谱是根据蛋白质疏水性的差异来分离纯化的。 （3）亲和色谱（ affinity chromatography,AC） 亲和色谱是利用固定化配基与目的蛋白质之间特异的生物亲和力进行吸附的 。亲和色谱的过程大致分为3步：第一步配基固定化;第二步吸附目的产物；第三步样品解吸。null（4）凝胶过滤色谱 凝胶过滤是以具有空隙大小一定的多孔性凝胶作为分离介质，小分子能进入孔内，在柱中缓慢移动，而大分子不能进入孔内，快速移动，利用这种移动差别可使大分子与小分子分开。 3、非蛋白质类杂质的去除 非蛋白质类杂质不应忽视，在纯化过程中，需特别注意3种可能存在的非蛋白类杂质，它们是DNA、热原质和病毒，常用的分离纯化方法见表3—4。 （1）DNA的去除 （2）热原质的去除 （3）病毒的去除null 表 产物的主要特性及在分离纯化中的作用 产 物 特 性 作 用 等电点 决定离子交换的种类及条件 相对分子质量 选择不同孔径及分级分离范围的介质 疏水性 与疏水、反相介质结合的程度 特殊反应性 产物的氧化、还原及部分催化性能的抑制 聚合性 是否采用预防聚合、解聚及分离去除聚合体 生物特异性 决定亲和配基 溶解性 决定分离体系及蛋白浓度 稳定性 决定工艺采用的温度及流程时间 微不均一性 影响产物的回收null 表 基因工程药物生产中常用的分离纯化方法 方 法 目 的 离心/过滤 去除细胞、细胞碎片、颗粒性杂质 阴离子交换层析 去除杂志蛋白、脂质、DNA、病毒 40nm微孔滤膜过滤 进一步去除病毒 阳离子交换层析 去除牛血清蛋白或转铁蛋白等 超 滤 去除沉淀物及病毒 疏水层析 去除残余的杂蛋白 凝胶过滤 与多聚体分离 0.22μm微孔滤膜过滤 除 菌五、分离纯化工艺应遵循的原则五、分离纯化工艺应遵循的原则 1）具有良好的稳定性和重复性； 2）尽可能减少组成工艺的步骤； 3）组成工艺的各技术或步骤之间要能相互适应和协调， 工艺和设备相适 应。 4）在工艺过程中尽可能少用试剂，以免增加分离纯化步 骤，或干扰产品质量； 5）分离纯化工艺所用的时间尽可能短，尤其是对稳定性 差的产物； 6）工艺和技术必须高效，收率高，易操作，对设备条件 要求低，能耗低； 7）具有较高的安全性。 null六、选择分离纯化方法的依据 1、根据产物表达形式来选择 2、根据分离单元之间的衔接选择 3、根据分离纯化工艺的要求来选择 null第九节 基因工程药物的质量控制一、原材料的质量控制 确保编码药品的DNA序列的正确性，重组微生物来自单一克隆，所用质粒纯而稳定，以保证产品质量的安全性和一致性。 （1）明确目的基因的来源、克隆经过，并以限制性内切酶图谱和核苷酸序列等予以确证； （2）提供表达载体的名称、结构、遗传特性及其各组成部分（如启动子、复制子）的来源与功能，构建中所用位点的酶切图谱，抗生素抗性标志物； null（3）提供宿主细胞的名称、来源、传代历史、检定结果 及其生物学特性； （4）阐明载体引入宿主细胞的方法及载体在宿主细胞内 的状态，如是否整合 到染色体内及在其中的拷贝 数，并证明宿主细胞与载体结合后的遗传稳 定性； （5）提供插入基因与表达载体两侧端控制区的核苷酸序 列，详细叙述在生产过程中，启动与控制克隆基因 在宿主细胞中表达的方法及水平等。null二、培养过程的质量控制 在工程菌菌种贮存中，要求种子克隆纯而稳定；在培养 过程中，要求工程菌所含的质粒稳定，始终无突变；在重复 生产发酵中，工程菌表达稳定；始终能排除外源微生物污 染。 （1）生产基因工程产品应有种子批系统，并证明种子批不含致癌因子，无细菌、病毒、真菌和支原体等污染，并由原始种子批建立生产用工作细胞库； （2）原始种子批须确证克隆基因DNA序列，详细叙述种子批来源、方式、保存及预计使用期，保存与复苏时宿主载体表达系统的稳定性； null（3）对生产种子，应详细叙述细胞生长与产品生成的方 法和材料，并控制微生物污染； （4）提供培养生产浓度与产量恒定性数据，依据宿主细 胞-载体系统稳定性，确定最高允许传种代数； （5）培养过程中，应测定被表达基因分子的完整性及宿 主细胞长期培养后的基因型特征；以宿主细胞-载体 稳定性与产品恒定性，规定持续培养时间，并定期 评价细胞系统和产品； （6）培养周期结束时，应检测宿主宿主细胞载体系统的 特性，如质粒拷贝数、宿主细胞中表达载体存留程 度，含插入基因载体的酶切图谱等。null三、纯化工艺中的质量控制 1、产品要有足够的生理和生物学试验数据，确证提纯物分子批间保持一致性；外源蛋白质、DNA与热原质都控制在规定限度以下。 2、在精制过程中能清除宿主细胞蛋白质、核算、糖类、病毒、培养基成分及精制工序本身引入的化学物质，并有检测方法。 四、目标产品的质量控制 1、产品的鉴别 表4-3 重组蛋白质药物产品常用的鉴别方法 电泳方法： SDS-PAGE,等电聚焦， 免疫电泳 免疫学方法：RIA , RID ELISA , Immunoblotting 受体结合实验（ Receptor Binding） 各种高效液相分析法（HPLC） 肽图分析法 Edman N 末端序列分析法 圆二色谱（CD） NMR null （1）肽图分析法 （2）氨基酸成分分析 （3）部分氨基酸序列分析：N-端15个氨基酸 （4）重组蛋白质的浓度测定和相对分子质量测定 （5）蛋白质二硫键分析 2、纯度分析 （1）目的蛋白质含量测定 （2）杂质：分蛋白类杂质和非蛋白类杂质。见表4-4 3、生物化学测定 4、稳定性考察 5、产品一致性的保证 null 表4-4 基因工程产物中常见杂质和污辱物及其检测方法 杂质和污染物 检 测 方 法 内毒素 鲎试剂、家兔热源法 宿主细胞蛋白 免疫分析、SD-PAGE、CE 其他打败杂质（如培养基） SDS-PAGE、HPLC、CE、免疫分析 残余DNA DNA杂交、紫外光谱、蛋白结合 蛋白变异 肽谱、HPLC、IEF、CE 甲酰基甲硫氨酸 肽谱、HPLC、IEF、CE 甲硫氨酸氧化 肽谱、氨基酸分析、HPLC、质谱、Edman分析 产物变性或聚合脱氨基 SDS-PAGE、凝胶排阻色谱、IEF、HPLC、CE Edman分析、CE 单克隆抗体（亲和配基脱落） SDS-PAGE、免疫分析 氨基酸取代 氨基酸分析、肽谱、CE、Edman分析、质谱 微生物（细菌、酵母、真菌） 微生物学检查 支原体 微生物学检查 病 毒 微生物学检查null五、产品的保存 1、液态保存 （1）低温保存：液态蛋白质样品在-10~-20°C以下冰冻保存。 （2）在稳定pH条件下保存：蛋白质较稳定的pH一般在等电点，且多数蛋白质只有在很窄的pH 范围内才稳定。因此对保存液态蛋白质样品时小心调到其稳定的PH 范围内。 （3）高浓度保存：一般蛋白质在高浓度时比较稳定，因为液态蛋白质容易受水化作用的影响，浓度太低易引起亚基解离和表面变性。 （4）加保护剂保存：多元醇、有机溶剂、巯基乙醇、二硫苏糖醇等。null 2、固态保存 一般蛋白质含水量超过10%时容易失活。含水量降到5%时，在室稳或冰箱中保存均比较稳定，但在37 °C保存时活性明显下降。长期保存蛋白质的最好方法是制成干粉或 结晶。冻干粉或结晶都具有强抗热性和稳定性，放在干燥器中在4 °C可保存相当长的时间。null公司以专利技术生产重组类人胶原蛋白，采用瑞士比欧生物工程公司的发酵灌成套设备，严格按GMP生产，年产100公斤医用级类人胶原蛋白纯品，100吨化妆品级胶原蛋白水溶液（1%），产品可供医药和医疗器械诸如可注射产品、创伤等药物以及化妆美容产品、保健食品大量之需。 工艺流程：                                                                                                                                                                                                                                                                 null