血清γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定

目的要求  1．了解蛋白质分离提纯的总体思路。  2．掌握盐析法、分子筛层析法、离子交换层析等实验原理及操作技术。   实验原理     血清中蛋白质按电泳法一般可分为五类：清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白，其中γ-球蛋白含量约占16％，100ml血清中约含1.2g左右。     首先利用清蛋白和球蛋白在高浓度中性盐溶液中(常用硫酸铵)溶解度的差异而进行沉淀分离，此为盐析法。半饱和硫酸铵溶液可使球蛋白沉淀析出，清蛋白则仍溶解在溶液中，经离心分离,沉淀部分即为含有γ-球蛋白的粗制品。     用盐析法分离而得的蛋白质中含有大量的中性盐，会妨碍蛋白质进一步纯化，因此首先必须去除。常用的方法有透析法、凝胶层析法等。本实验采用凝胶层析法，其目的是利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。当溶液通过SephadexG--25凝胶柱时，溶液中分子直径大的蛋白质不能进入凝胶颗粒的网孔，而分子直径小的无机盐能进入凝胶颗粒的网孔之中．因此在洗脱过程中，小分子的盐会被阻滞而后洗脱出来，从而可达到去盐的目的。 脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白，利用它们等电点的不同可进行分离。α－球蛋白、β-球蛋白的PI<6.0；γ－球蛋白的PI为7.2左右。因此在PH6.3的缓冲溶液中，各类球蛋白所带电荷不同。经DEAE(二乙基氨基乙基)纤维素阴离子交换层析柱进行层析时，带负电荷的α－球蛋白和β-球蛋白能与DEAE纤维素进行阴离子交换而被结合；带正电荷的γ－球蛋白则不能与DEAE纤维素进行交换结合而直接从层析柱流出。因此随洗脱液流出的只有γ－球蛋白，从而使γ－球蛋白粗制品被纯化。其反应式如下： 用上述方法分离得到γ－球蛋白是否纯净，单一？可将纯化前后的γ－球蛋白进行电泳比较而鉴定之。 试剂和器材 1．试剂 （1）饱和硫酸铵溶液：称固体硫酸铵(纯)850g，置于1000ml蒸馏水中，在70一80℃水温中搅拌溶解。将酸度调节至pH7.2，室温中放置过夜，瓶底析出白色结晶，上清液即为饱和硫酸铵溶液。 （2）葡聚糖凝胶G一25的处理：按每100ml凝胶床体积需要葡聚糖凝胶G一25干胶 25g。称取所需量置于锥形瓶中。每克干胶加入蒸馏水约30ml，用玻璃棒轻轻混匀，置于90～100℃水温中时时搅动，使气泡逸出。1h后取出，稍静置，倾去上清液细粒。也可于室温中浸泡24h，搅拌后稍静置，倾去上清液细粒，用蒸馏水洗涤2～3次，然后加0.017mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.3)平衡，备用。 （3）DEAE一32(二乙基氨基乙基一32)纤维素的处理：按100ml柱床体积需DEAE纤维素14g称取，每克加0.5mol／L盐酸溶液15ml，搅拌。放置30min(盐酸处理时间不可太长，否则DEAE纤维素变质)。加约l0倍量的蒸馏水搅拌，放置片刻，待纤维素下沉后，倾弃含细微悬浮物的上层液。如此反复数次。静置30min，虹吸去除上清液(也可用布氏漏斗抽干)，直至上清液pH>4为止。加等体积lmol/L氢氧化钠溶液，使最终浓度约为0.5mol/L氢氧化钠，搅拌后放置30min，以虹吸除去上层液体。同上用蒸馏水反复洗至pH<7为止。虹吸去除上层液体，然后加入0.0175mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.3)平衡，备用。 （4）0.0175mol／L磷酸盐缓冲液(pH6.3)  A液：称取磷酸二氢钠(NaH2PO4.2H20)2.730g溶于蒸馏水中，加蒸馏水稀释至1000ml。  B液：称取磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H20)6.269g，溶于蒸馏水中，加蒸馏水稀释至 1000mL。  取A液77.5ml，加于B液22.5ml，混匀后即成。 （5）20%磺基水杨酸溶液 （6）奈氏(Nessler)试剂应用液    贮存液；称取碘化钾(KI)7.58g于250ml三角烧瓶中，用蒸馏水5ml溶解，再加入碘（I2） 5.5g溶解，加7～7.5gHg用力振摇10min(此时产生高热，须冷却)，直至棕红色的碘转变成带绿色的碘化汞钾液为止，过滤上清液倾入100ml容量瓶，洗涤沉淀，洗涤液一并倒入容量瓶内，用蒸馏水稀释至100ml。    应用液：取贮存液75ml加10％NaOH 350ml，加水至500mL。 （7）0.9％氯化钠溶液 （8）乙酸纤维素薄膜电泳有关试剂(见实验29) 2．器材 （1）人血清。 （2）层析柱。 （3）长滴管。 （4）醋酸纤维素薄膜。 操作方法 1．盐析――中性盐沉淀 取正常人血清2.0ml于小试管中，加0.9％氯化钠溶液2.0ml，边搅拌混匀边缓慢滴加饱和硫酸铵溶液乙4.0ml，混匀后于室温中放置10min，3000r／min离心10min。小心倾去含有清蛋白的上清液，重复洗涤一次，于沉淀中加入0.0175mol／L磷酸盐缓冲液(pH6.3)0.5～1.Oml使之溶解。此液即为粗提的γ－球蛋白溶液。 2．脱盐――凝胶柱层析 （1）装柱：洗净的层析柱保持垂直位置，关闭出口，柱内留下约2.0ml洗脱液。一次性将疑胶从塑料接口加入层析柱内，打开柱底部出口，调节流速0.3ml/min。凝腔随柱内溶液慢慢流下而均匀沉降到层析柱底部，最后使凝胶床达20厘米高，床面上保持有洗脱液，操作过程中注意不能让凝胶床面露出液面并防止层析床内出现“纹路”。在凝胶表面可盖一园形滤纸，以免加入液体时冲起胶粒。 （2）上样与洗脱：可以在凝胶表面上加圆形尼龙滤布或滤纸使表面平整，小心控制凝胶柱下端活塞，使柱上的缓冲液面刚好下降至凝胶床表面，关紧下端出口，用长滴管吸取盐析球蛋白溶液，小心缓慢加到凝胶床表面。打开下端出口，将流速控制在0.25ml/min使样品进入凝胶床内。关闭出口，小心加入少量0.0175mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.3)洗柱内壁。打开下端出口，待缓冲液进入凝胶床后再加少量缓冲液。如此重复三次，以洗净内壁上的样品溶液。然后可加入适量缓冲液开始洗脱。 加样开始应立即收集洗脱液。洗脱时接通蠕动泵，流速为0.5ml/min,用部分收集器收集，每管1ml。 （3）洗脱液中NH4+与蛋白质的检查：取比色板两个(其中一个为黑色背底)，按洗脱液的顺序每管取一滴，分别滴入比色板中，前者加20％磺基水杨酸溶液2滴，出现白色混浊或沉淀即示有蛋白质析出，由此可估计蛋白质在洗脱各管中的分布及浓度；于另一比色板中，加人奈氏试剂应用液l滴，以观察NH4+出现的情况。     合并球蛋白含量高的各管，混匀。除留少量作电泳鉴定外，其余用DEAE纤维素阴离子交换柱进一步纯化。 3．纯化――DEAE纤维素阴离子交换层析 用DEAE纤维素装柱约8-10cm高度，并用0.0175mol／L磷酸盐缓冲液(pH6.3)平衡，然后将脱盐后的球蛋白溶液缓慢加于DEAE纤维素阴离子交换柱上，用同一缓冲液洗脱、分管收集。用20％磺基水杨酸溶液检查蛋白质分布情况。(装柱、上样、洗脱，收集及蛋白质检查等操作步骤同凝胶层析)。 4．浓缩 经DEAE纤维素阴离于交换柱纯化的γ－球蛋白液往往浓度较低。为便于鉴定，常需浓缩。收集较浓的纯化的γ－球蛋白溶液2m1，按每ml加0.2～ 0.25gSephadex G一25干胶，摇动2～3min， 3000r／min 离心5min。上清液即为浓缩的γ-球蛋白溶液。  5．鉴定――乙酸纤维素薄膜电泳 取乙酸纤维素薄膜2条，分别将血清、脱盐后的球蛋白、DEAE纤维素阴离子交换柱纯化的γ-球蛋白液等样品点上。然后参阅实验二十九：乙酸纤维薄膜电泳法进行电泳分离、染色。比较电泳结果。 注意事项 1．凝胶及DEAE纤维处理期间，必须小心用倾泻法除去细小颗粒。这样可使凝胶及纤维素颗粒大小均匀，流速稳定，分离效果好。 2．装柱是层析操作中最重要的一步。为使柱床装得均匀，务必做到凝胶悬液或DEAE纤维素混悬液不稀不厚，一般浓度为l：l，进样及洗脱时切勿使床面暴露在空气中，不然柱床会出现气泡或分层现象；加样时必须均匀，切勿搅动床面，否则均会影响分离效果。 3．本法是利用γ-球蛋白的等电点与α-、β-球蛋白不同，用离子交换层析法进行分离的。因此层析过程中用的缓冲液pH要求精确。 4．电泳注意事项见实验二十九。 5．凝胶贮存：凝胶使用后如短期不用，为防止凝胶发霉可加防腐剂如0.02％叠氮钠。保存于4℃冰箱内。若长期不用，应脱水干燥保存。脱水方法：将膨胀凝胶用水洗净。用多孔漏斗抽干后，逐次更换由稀到浓的乙醇溶液浸泡若干时间，最后一次用95％乙醇溶液浸泡脱水，然后用多孔漏斗抽干后，于60～80℃烘干贮存。 6．离子交换剂的再生和保存；离子交换剂的价格较贵，每次用后只需再生处理便能反复使用多次。处理方法是：交替用酸、碱处理，最后用水洗至接近中性。阳离子交换剂最后为Na型，阴离子以Cl型是最稳定型，故阴离子交换剂处理顺序为碱一水一酸一水。由于上述交换剂都是糖链结构。容易水解破坏，因此须避免强酸、强碱长时间浸泡和高温处理，一般纤维素浸泡时间为3-4h。        离子交换剂容易长霉引起变质，不用时，需洗涤干净，加防腐剂置冰箱内保存。常用0.02％叠氮钠防腐。叠氮钠遇酸放出有毒气体，也是剧毒与易爆的危险品。使用时要加倍小心。     除用凝胶层析法去除无机盐类外，最常用的去盐法就是透析。细的透析袋效率高，所需时间短。将透析袋一端折叠，用橡皮筋结扎，试验是否逸漏，然后倒入待透析的蛋白质溶液。勿装太满，将袋的上端也结扎好，即可进行透析。开始可用流动的自来水，待大部分盐被透析出后，再改为生理盐水、缓冲液或蒸馏水。透析最好在较低的温度下，并在磁力搅拌器上进行。此法简单，易操作，仪器及试剂要求不高，但不如凝胶层析法效率高。     浓缩γ-球蛋白粗提液除上述方法外还可用透析袋浓缩。将待浓缩的蛋白质溶液放入较细的透析袋中，置入搪瓷盘内。透析袋周围可撒上聚乙二醇6000(PEG6000)，或聚乙烯吡咯酮，或蔗糖。以上物质在使用后(吸了大量水)都可以通过加温及吹风而回收；将装有蛋白质溶液的透析袋悬挂起来，用电风扇高速吹风(10℃以下)，也可达到浓缩目的，以上两法虽不如 SephadexG一25干胶快，但价格较便宜，方法也不烦琐。 生物化学是研究生物体内化学分子与化学反应的科学，从分子水平探讨生命现象的本质［1］。生物化学基本理论的建立、完善和发展是以实验研究为基础［2］。而要完成开发学生的潜能，培养学生的创新精神和创新能力，培养大学生的综合素质这一任务的重要手段是在开设的综合实验中得以实现的［3］。我们依据最新教学大纲，结合实验室现有的条件，对原有实验进行了重新整合，力争即有保留又有创新，了规模较大的综合实验“血清γ球蛋白的分离、纯化与鉴定”。经过反复实验预试，并经过一年（两学期）医学本科学生的实验教学证明，实验方法稳定，结果重复可靠，便于学生操作，教学效果良好。     1  材料与方法     1.1  仪器与材料     1.1.1  仪器  KDC40低速离心机、1.5cm×20cm玻璃层析柱、722可见分光光度计、DYY2C电泳仪及DYCZ24D型垂直板电泳槽均为国产。     1.1.2  试剂材料  新鲜猪血清、pH7.0饱和硫酸铵溶液、0.01mol/L pH7.0 PBS（磷酸盐缓冲生理盐水）、葡聚糖凝胶G25（SephadexG25）、奈氏（Nessler）试剂、20%（W/V）磺基水杨酸溶液、pH8.6离子强度0.06巴比妥缓冲液、氨基黑10B、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、SDS（十二烷基硫酸钠）考马斯亮蓝R250、甘氨酸、Tris、BSA（牛血清白蛋白）等除SephadexG25(SWEDEN进口分装)外均为国产。     1.2  方法  取新鲜血清2ml，加入等量PBS和饱和硫酸铵溶液，混匀后静止30min，3 000 rpm离心10min，沉淀物即是γ球蛋白。该步骤可重复12次，以保证纯度。     将γ球蛋白通过SephadexG25层析作用，用PBS洗脱，除去蛋白质中的小分子铵盐，从而达到γ球蛋白纯化的目的。洗脱下来的收集液可以用磺基水杨酸检测蛋白质的存在，用奈氏试剂检测是否除净NH4+,然后把含有γ球蛋白的样品合并收集。     把纯化的γ球蛋白与正常猪血清样品进行醋酸纤维素膜电泳作对照验证。     把纯化的γ球蛋白、正常猪血清样品用双缩脉试剂显色后，用分光光度法测定其含量，并稀释成2mg/ml。     把纯化的γ球蛋白、正常猪血清及标准蛋白（2mg/ml）分别用含巯基乙醇的样品缓冲液处理，用12%分离胶进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)［4］，作进一步对照验证。     2  结果     2.1  醋酸纤维素膜电泳  纯化的γ球蛋白样品为一条带（γ球蛋白位置）；正常猪血清样品为五条带（清蛋白、α1、α2、β及γ球蛋白）     2.2  SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳  正常猪血清样品出现十几条带，在清蛋白前面出现二条带且与纯化的γ球蛋白样品出现的二条带相平行。标准蛋白为纯一条带且与正常猪血清样品的清蛋白相平行，而纯化的γ球蛋白样品无明显清蛋白，其它蛋白带与正常猪血清样品相比较颜色对应变浅。     3  讨论     3.1  目的原理  血清中的γ球蛋白是一类结构相似具有重要免疫功能的多种蛋白质，它们的分子量多数在150KDa左右，基本结构由两条分子量相同的轻链(Ｈ链23KDa)和两条分子量相同的重链(Ｌ链55KDa)通过二硫键连接组成。 分离、纯化与鉴定γ球蛋白的方法很多，从设计的生化实验目的考虑，选用硫酸铵盐析分离、葡聚糖凝胶纯化γ球蛋白，不仅保证其相对纯度，节省时间，更重要的是保证其完好的生物学活性。而用醋酸纤维素膜电泳和SDSPAGE，对蛋白质进行量化、比较及特性鉴定，是较为经济、快速且可重复的方法，尤其是SDSPAGE，已成为许多研究领域广为应用的重要分析技术。     我们把纯化的γ球蛋白、正常猪血清及标准蛋白用含有巯基乙醇的样品缓冲液处理后进行SDSPAGE，可使纯化的γ球蛋白、正常猪血清中的γ球蛋白还原成两条分子量相同的轻链和两条分子量相同的重链而出现二条带，且相互平行；而标准蛋白不含二硫键，不能解链，故只出现一条带且与正常猪血清中的清蛋白相平行。至于纯化的γ球蛋白样品除γ球蛋白解链为重轻链后的其它蛋白在盐析时已分离出大部分，经高灵敏度的SDSPAGE仍可不同层度的显现出浅带。     3.2  体会  实验样品来源为猪血清，取材方便易得，同时节约了样品的用量，本实验只需1份(每1个小组)2 ml血清样品即可满足所需；节省了实验经费的支出；对环境无污染；而标准蛋白采用单一成分为国产牛白蛋白（67KDa），价格低廉，而且电泳成带清晰整齐，尤其适合教学。     结构安排合理，难易适度，精简了教学时数。综合实验共用16学时，分二次完成。第一次8学时，血清γ球蛋白的分离、纯化与鉴定（一），完成血清γ球蛋白的分离、纯化及醋酸纤维素膜电泳；第二次8学时，血清γ球蛋白的分离、纯化与鉴定（二），完成γ球蛋白、正常猪血清样品的定量和SDSPAGE,在时间上至少节省8学时。     在学生实验操作上，从刻度细管，可调玻璃加液器的使用到微量进样器，可调式移液器选用；从免疫抗体的分离、纯化到化学的显色和沉淀法的应用以及分子解链电泳，整个实验的基本理论清楚，有据可循，难易适度，循序渐进。     实验技术全面，方法稳定，使传统与现代结合。综合实验选用了生物化学较为代表，反映基本理论和基本技能又能培养学生科研能力的典型且便于操作的实验，并使之有机的整合为一体。整个实验覆盖了传统生化技术，包括离心技术、层析技术、分光光度法和电泳技术。并可以对二种电泳的方法、条件、应用范围及灵敏度等进行比较。     从学生实验结果看，在同等条件下，提取的γ球蛋白和正常猪血清中的γ球蛋白解链，其它蛋白和标准蛋白则不解链，从生理血清到分子蛋白；由样品的提取，到分子量的定位，特别是醋酸纤维素膜电泳的γ球蛋白位于第五条带，经过巯基乙醇处理的SDSPAGE后，使γ球蛋白重轻链分离，却活生生的跑到比γ球蛋白分子量小的清蛋白的前面，实验结果直观可见，可比性强，举一反三。     增加了知识的综合性，提高学生对实验的极大兴趣。血清γ球蛋白的分离、纯化、鉴定、蛋白定量及进一步鉴定五个子实验作为一个综合实验，涉及化学、生物、分子生物、生理及免疫等相关学科知识，内容连惯，一环紧扣一环，哪一环节出了差错都不可能有理想的结果，同时增加了实验的相对难度和操作的复杂性。学生都渴望自已的实验有满意的结果，势必要求学生从第一步操作开始，到最后做出实验结果，一点都不能含糊，认真主动的做好每一步，去求证理论的依据，这样达到了锻炼学生动手能力的教学目的，理论与实践的有机结合。     实验可分可合，可适合多层次教学。随着教育不断发展和多层次多元化办学模式的出现，我们原有的一些生物化学实验已不能满足多层次教学的需要。改革后的综合性实验既适合于本科生教学，由16学时完成；也可以根据不同专业，为专科高职生开设，分几次完成（每次4学时），如γ球蛋白分离与纯化（盐析与除盐）；醋酸纤维素膜电泳鉴定及用分光光度法测定血清蛋白含量。避免不必要的新开实验，减少实验准备材料，有利提高教学水平。     总之，综合实验将成为大学生综合素质培养、科学技术训练、对先进技术设备了解与掌握、创新人才孵育的摇篮［5］。