血清中IgG红细胞血型抗体定量检测方法初探

·实验研究· 血清中 IgG红细胞血型抗体定量初探 孙继丽 　向东 　王健莲 (上海市血液中心 ,上海 200051) 　　摘要 :目的 　探索建立同种免疫患者血清中 IgG红细胞血型抗体定量的吸收放散 2EL ISA技术。方法 　采用 阴性红细胞平行操作 ,作为空白对照 ,通过吸收、放散纯化血清中 IgG抗体 ,用 EL ISA方法测定放散液中 IgG抗体浓 度 ,换算成血清中抗体浓度。采用该方法对 8名孕妇血清中的同种抗体 (抗 2D、抗 2E各 4例 )进行定量检测。结果 　EL ISA法测定 4名孕妇血清中 IgG抗 2D 浓度范围为 ( 11086—541712) μg/m l, IgG抗 2E浓度范围为 ( 01080— 71646)μg/m l。结论 　本研究初步建立的简便、实用的血清 IgG红细胞血型抗体定量方法 ,可用于准确测定孕妇血 清中 IgG特异性抗体的浓度。 　　关键词 :吸收放散 ; EL ISA;定量 ; IgG抗体 　　中图分类号 : R457. 1 + 1　R446161　　文献标识码 : A　　文章编号 : 10042549X (2009) 0320216202 　　对血清中 IgG红细胞血型抗体进行定量检测 ,具有十分 重要的临床意义 ,如监测母体血清中抗 2IgG D /E的抗体含 量 ,预判新生儿溶血病严重程度 [ 1—3 ] ,以采取相应治疗。 目前国内多采用间接抗人球蛋白试验 ( indirect anti2human globulin test, IAT)测定抗体效价 ,是一种相对估值 ;国外普遍 采用的自动化血液凝集技术 ,需要使用相应特异性的标准品 作为参照 ,且易受 IgM抗体干扰。基于上述因素 ,我们探索 建立 1种新的吸收放散 2EL ISA方法 ,即采用吸收、放散纯化 血清中特异性 IgG抗体 ,通过 EL ISA方法测定放散液中 IgG 抗体浓度 ,从而对血清中特异性 IgG抗体进行定量 ,现报道 如下。 1　与方法 1. 1　血清和红细胞 　8名孕妇血清 ,抗 2D、抗 2E各 4份 ,共 计 8份 , 1—4号为抗 2D, 5—8号为抗 2E,均来自 2000年 1 月 —2007年 12月本室产前检查 ;“O, DCcEE”,“O, dc2 cee”新鲜红细胞 ( < 72 h) ,均由本室提供。 1. 2　试剂与仪器 　人源 IgG抗体 EL ISA定量试剂盒 (美国 Bethyl Laboratories Inc,批号 : E802104217) , EL ISA 辅助试剂 盒 (深圳达科为生物技术有限公司 ,批号 : 071222) , GAMMA 酸放散试剂盒 (美国 IMMUCOR Inc,批号 : 359001) ,抗人球 蛋白 试 剂 (美 国 O rtho2Clinical D iagnostics Inc, 批 号 : IGG157A)。低离子介质浓缩液 (上海血液生物医药有限责 任公司 ,批号 : 20070828)。微孔板分光光度计 (美国 Molecu2 lar Devices Corp) , KA22200离心机 (日本 KUBOTA Corp ) ,微 量进样器 (澳大利亚 Labsystem s Corp)。 1. 3　吸收放散 　试验分试验组与对照组 2组进行 ,试验组 为待检血清与“O, DCcEE”红细胞反应 ,对照组 (空白对照 ) 为待检血清与“O, dccee”红细胞反应。将新鲜红细胞用生理 盐水洗涤 3遍 ,离心制备为压积红细胞 ,备用。取 1 m l血清 与 1 m l压积红细胞充分混匀 , 37 ℃孵育 60 m in。将吸收后 的红细胞生理盐水洗涤 6遍 ,各取 015 m l压积红细胞进行 酸放散 ,具体操作严格按照试剂盒说明进行。5号、6号样本 由于抗 2E血清效价偏低 ,我们在吸收过程中加大了血清量 , 并使用了低离子介质 ,为 4 m l血清 , 1 m l低离子介质溶液 , 与 1 m l压积红细胞充分混匀 , 37 ℃孵育 20 m in。 1. 4　效价滴定 　采用 IAT法同时测定每份血清及其试验组 放散液的效价 ,使用 5%白蛋白盐水溶液作为稀释剂。 1. 5　EL ISA检测 　按试验组效价对 2组血清的放散液进行 倍比稀释后 ,平行进行 EL ISA测定 ,复孔测定 4—8次。同时 对试剂盒提供的人源参照血清进行梯度稀释 ,复孔测定 ,绘 制标准曲线 (图 1)。具体操作严格按照试剂盒#说明书#。 Y = { ( - 21682) / [ 1 + (X /701901) ×11178 ] } + 21721　R2 = 1 图 1　人源参照血清标准曲线 1. 6　统计分析 　计算放散液 (效价为 1)、血清中抗体浓度 的平均值及标准差。血清中的抗体浓度 =放散液 (效价为 1)抗体浓度 ×血清抗体效价倒数。 2　结果 表 1为每份血清及 2组放散液中的抗体浓度 ,可以看 出 :当效价为 1时 ,抗 2D试验组浓度为 ( 51078—61868) ng/ m l,明显高于空白对照组的 (01190—01836) ng/m l;抗 2E试 验组浓度为 (121271—231082) ng/m l,也高于空白对照组的 (01185—91885) ng/m l。二者相减 ,放散液中抗 2D抗体的实 际浓 度是 ( 41242—61679 ) ng/m l, 抗 2E 的 实 际 浓 度 是 (101052—141934) ng/m l。参考原始血清中相应抗体效价 , 可知血清中的抗体浓度为抗 2D (11086—541712 )μg/m l、抗 2 E (01080—71646)μg/m l。每份血清重复检测 2—3次 ,所得 结果无明显差异。 ·612· 中国输血杂志 2009年 03月第 22卷第 3期 Chin J B lood Transfusion March, 2009, Vol. 22, No. 3 表 1　EL ISA和 IAT测定 8名孕妇血清、放散液中 IgG抗 2D /E浓度 ( ng/m l) 　　 编号 放散液 试验组 ( EL ISA) 对照组 ( EL ISA) 抗 2D / E IAT效价 血清IAT效价 抗 2D /E 1 61868 ±11721 01190 ±01111 61679 ±11828 1 8 192 54 7111680 2 51459 ±01416 01768 ±01475 41691 ±01337 1 1 024 4 8031488 3 61474 ±11065 01316 ±01096 61159 ±11154 1 512 3 1531195 4 51078 ±01099 01836 ±01059 41242 ±01159 1 256 1 0851904 5 151604 ±11973 51552 ±01746 101052 ±21719 1 8 801414 6 231082 ±41825 91885 ±31755 131197 ±11760 1 32 4221294 7 151120 ±01731 01185 ±01101 141934 ±01655 1 512 7 6461320 8 121271 ±11320 01479 ±01174 111792 ±11481 1 512 6 0371291 注 :放散液抗 2D /E =试验组 EL ISA值 -对照组 EL ISA值 ;血清抗 2D /E = (放散液抗 - D /E) ×血清 IAT效价 3　讨论 目前广泛用于 IgG抗体定量的间接抗球蛋白法 ,使用阳 性红细胞可直接测定特异性抗体含量 ,但仅能提供半定量结 果。EL ISA方法具有定量、准确、简便等优点 ,但因为存在大 量非血型特异性的 IgG分子的干扰 ,不能直接测定血清中特 异性血型 IgG抗体的浓度。我们结合上述 2种方法的优点 , 探索建立 1种新的程序 :吸收、放散、EL ISA测定放散液中 IgG抗体浓浓度、效价滴定、换算成血清中抗体浓度。国外 也曾有类似的程序报道 ,但都需要使用相应特异性、浓度已 知的标准品或校准品进行预试验 ,确定所用标准品或校准品 的已知浓度与吸收、放散、EL ISA方法测得的标准品或校准 品浓度的关联范围、相关方向及程度 ,优化试验条件后 ,再对 未知样品进行测定 ,操作繁琐 ,工作量大 [ 4, 5 ]。我们同时平 行测定血清和放散液中 IgG抗体效价 ,并将放散液 EL ISA测 定结果换算成效价为 1时的抗体浓度 ,再乘以相应的血清抗 体效价倒数 ,即为血清中的抗体浓度值。这样不仅不需要特 异性标准品或校准品 ,更大大简化了实验操作。且本结果显 示效价为 1时 IgG抗 2D的平均浓度为 51443 ng/m l,与文献 [ 6 ]报道的采用标准品可检出低至 5 ng/m l的 IgG抗 2D接 近 ,表明该方法具有足够的敏感性和准确性。 同时 ,我们对每份血清样本均设置了空白对照。结果显 示 ,除 2例抗 2E (5号、6号 )外 ,其余 6例抗体总的本底噪音 , 均小于文献 [ 4 ]报道的 25 ng/m l。值得注意的是 , 5号、6号 抗 2E血清由于效价偏低 ,在吸收过程中加大了血清量 ,并使 用了低离子介质 ,导致 IgG非特异性吸附明显增强 ,放散液 中对照组与试验组抗体浓度比均明显升高 ,但二者相减得到 的抗 2E浓度 (5号 , 101052 ng/m l; 6号 , 131197 ng/m l)与另 2 例未使用低离子介质的抗 2E结果 (7号 , 141934 ng/m l; 8号 , 111792 ng/m l)无明显差别。表明对低浓度抗体血清 ,加大 血清量、采用低离子介质加速吸收是可行的 ,所得结果准确 有效。 有研究报道 IAT能检出浓度低至 11 ng/m l的 IgG抗 2 D [ 7 ]。我们的结果表明 , IAT能够检测到的 IgG抗 2D浓度更 低 ,约为 51443 ng/m l,是前者的一半 ,可能是由于使用了 5% 白蛋白溶液作为稀释剂的结果 ; IgG抗 2E则约为 121494 ng/ m l。抗 2D与抗 2E的固有结合力强度均处于 ( - 10 200—12 800) Cal/mol间 [ 8 ] ,二者使用 IAT的最小检出量之间的差 异 ,很难用抗体亲和力不同来解释 ,可能是由于 2种抗原空 间结构的差异 ,造成抗球蛋白试验检测能力有所不同。 总而言之 ,我们探索建立简便、实用的血清特异性 IgG 抗体定量检测方法 ,初步的试验结果表明 ,能够在较短的时 间内获得比较准确的结果 ,希望能为新生儿溶血病的临床监 测及治疗提供准确的实验依据。 参 考 文 献 [ 1 ]　B ritish Comm ittee for Standards in Haematology. 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