肺炎克雷伯菌中质粒介导的AMPC酶及相关表型研究

作者单位 : 210002南京军区南京总医院全军医学检验中心微生 物室 ·细菌耐药基因· 肺炎克雷伯菌中质粒介导的 AmpC酶及 相关表型研究 邵海枫 　赵晓智 　王卫萍 　王锦娜 　李珍大 　　【摘要 】　目的 　证实临床分离的部分肺炎克雷伯菌 ( Kp)除产超广谱β内酰胺酶 ( ESBL s)外 , 还同时产 AmpC酶 ,并探讨了 AmpC酶编码基因存在方式。方法 　对临床分离的可疑同时产 ESBL s 和其他高活性广谱β内酰胺酶的 8株 Kp进行接合试验 ,并对供体菌和接合子同时采用三维试验、 ESBL s试验、AmpC酶诱导试验和β内酰胺类抗生素最低抑菌浓度 (M IC)试验测定 ,并进行 AmpC基 因携带状态、表达方式和酶活性分析。结果 　8株 Kp菌通过接合试验共得到 10株接合子 ,其中有 6 株供体菌均只得到同时表达 AmpC和 ESBL s的 1种接合子 ;另 2株供体菌 ,各得 2株接合子 , 1株同时 表达 AmpC和 ESBL s, 1株仅表达 ESBL s; 8株供体菌均未得到单独表达 AmpC的接合子。表达 AmpC 接合子的耐药表型与受体菌非常接近 ,酶的活性也必须用克拉维酸 (CA)和邻氯西林 (CLO)两种酶抑 制剂才能完全抑制 ,其中有 5株可被头孢西丁 ( FOX)诱导使某些指示药出现截平现象。结论 　在 Kp 中 ,已出现质粒携带的 AmpC基因 ,有可能与编码 ESBL s的基因存在于同一质粒上 ,并具有诱导型和 非诱导型两种表达形式。 【关键词 】　克雷伯氏菌 ,肺炎 ; 　质粒 ; 　β内酰胺酶类 ; 　基因 Study on pla sm id2m ed ia ted Am pCβ2lactama ses and the ir resistance phenotypes in K1pneum on ia　 SHAO Hai2feng, ZHAO X iao2zhi, WANG W ei2ping, WANG J in2na, L I Zhen2da. Center of M edica l L abora tory Science of PLA, N anjing General Hospita l of N an jing Comm and, N anjing 210002, China 【Abstract】　O bjective　To confirm that some clinical isolates of K1pneumoniae p roduce ESBL s and AmpC enzymes as well and to investigate the existing form of the gene encoding AmpC enzymes1 M ethods The eight isolates which p roduce ESBL s and other highly activeβ2lactamases were tested for the transfer of resistant gene1The donors and transconjugants were detected for AmpC gene and activity of the enzymes with three2dimensional test, ESBL test, AmpC inducible test and agar dilution test forM ICs toβ2lactam s1Results Ten transconjugants were obtained from the 8 Kp1 Out of the 8 donors, 6 yielded 1 type of transconjugant exp ressing both ESBL s and AmpC1Each of the other two p roduced 2 types of transconjugant, one exp ressing both ESBL s and AmpC and the other exp ressing ESBL s alone1 No transconjugant exp ressing AmpC only was obtained1The sim ilar resistance phenotypes were observed between the donors and the transconjugants harbouring AmpC genes1The activity of the β2lactamases could only be inhibited with both CA and CLO1W hen cefoxitin was used as the inducing agent, blunt of the inhibition zones of the indicator antibiotics was observed in 5 of the 8 transconjugants1Conclusion 　The p lasm id2carried AmpC gene is p resent in K1pneumoniae and it m ight coexist on the ESBL s2encoding p lasm id and that there are two exp ressions, inducible and non2inducible1 【Key words】　Klebsiella pneumoniae; 　Plasm ids; 　beta2Lactamases; 　Genes 　　超广谱β内酰胺酶 ( ESBL s)和 AmpC酶是导致 革兰阴性杆菌对广谱β内酰胺类抗生素耐药的主 要原因。编码 ESBL s的基因 ,由耐药质粒携带 ,常 见于克雷伯菌属 ( Kp )和大肠埃希菌 ( E1coli) ,也可 见于其他革兰阴性杆菌。编码 AmpC酶的基因存在 于大多数细菌的染色体上 ,呈诱导型表达 ,但 Kp的 染色体上无 AmpC基因 [ 1 ]。在持续使用头霉菌素 类、β内酰胺类、酶抑制剂类复合制剂的压力下 ,出 现了由质粒编码的 AmpC酶 [ 2 ]。我们按美国临床实 验室化委员会 (NCCLS)的标准方法检测 Kp是 否产 ESBL s时 ,发现其中有些菌对广谱β内酰胺类 抗生素大多耐药而 ESBL s表型不典型 ,推测同时存 在其他高活性的β内酰胺酶干扰了 ESBL s的检测。 ·711·中华检验医学杂志 2006年 2月第 29卷第 2期　Chin J Lab Med, February 2006, Vol 29, No12 本研究对这类菌进行酶的活性和质粒接合等一系列 试验 ,探讨其耐药表型与耐药基因的相关性。 和方法 11菌株来源 : 从我院分离到 8株 Kp,表型特点 为 :用 V itek GNS2506卡检测 ESBL s为阴性 ,用双纸 片法增效检测可疑阳性 [头孢他啶 /克拉维酸 (CAZ/ CA)或 /和头孢噻肟 (CTX) /CA抑菌环直径大小不 定 ,抑菌环内有散在单个菌落生长 ]。ESBL s阳性标 准株 : Kp ATCC 700603。AmpC阳性工程株 : E1coli DH5αACT21。受体菌 : 链霉素 ( STR ) 耐药 E1coli C600 (浙江大学医学院附属第一医院俞云松教授赠 送 )。三维试验指示菌 : E1coli ATCC 25922。 21试剂 : 抗生素纸片包括氨苄西林 (AMP)、阿 莫西林 (AMO ) /CA、哌拉西林 ( P IP)、哌拉西林 /他 唑巴坦 ( P IP /TZ )、头孢唑啉 ( KZ )、头孢西丁 ( FOX)、头孢曲松 (CRO)、头孢他啶 (CAZ)、头孢他 啶 (CAZ) /CA、头孢噻肟 ( CTX)、头孢噻肟 (CTX) / CA、头孢吡肟 ( FEP)均为 Oxoid公司产品。STR (山 东鲁抗医药股份有限公司 ) , CRO、CAZ、CTX (三九 集团深圳九新药业公司 ) , FOX (默沙东中国有限公 司 ) , CA (南京本原 2东原制药馈赠 ) , MH肉汤、MH 琼脂、麦康凯琼脂等均为 Oxiod公司产品。 31接合试验 : 将供体菌 ( Kp )和受体菌 ( E1coli C600)各 109 CFU /m l悬于 MH肉汤 , 35℃孵育 18 h, 在含 1 mg/m l STR和 8μg/m l CRO的麦康凯琼脂上 筛选产广谱β内酰胺酶的接合子 ,再用含 1μg/m l CAZ、1μg/m l CTX、4μg /m l CA 和 1 mg/m l STR的 麦康凯琼脂淘筛产 AmpC酶的接合子。 41药敏试验 : 按 NCCLS 2002年版标准 [ 5 ] ,采 用琼脂稀释法检测药物的最低抑菌浓度 (M IC)。 51三维试验及酶抑制试验 : 参考 Coudron 等 [ 224 ]介绍的方法。将指示菌 E1coliATCC 25922涂 布 MH琼脂。中间贴 CRO 纸片 ,四周四条放射状 槽 ,槽内加待测菌的酶浸出液 36μl,再分别加生理 盐水、200 mg/L CA、20 mol/L CLO、200 mg/L CA + 20 mol/L CLO混合液各 4μl。35℃孵育 18 h后 ,加 生理盐水槽的指示菌沿抑菌环向 CRO纸片方向生 长 ,表示含高活性β内酰胺酶 ,加 CA可抑制或部分 抑制这种生长表示含 ESBL s,加 CLO能抑制或部分 抑制表示含 AmpC酶 ,加 CA和 CLO才能完全抑制 表示含 ESBL s和 AmpC两种酶。 61头孢西丁诱导试验 : 方法类似 KB法药敏试 验 ,平皿中央贴 FOX纸片作为诱导剂 ,四周分别贴 CAZ、CAZ/CA、CTX、CTX /CA、P IP /TZ 5种纸片作为 指示剂 , FOX纸片与指示剂纸片中心到中心的距离 为 18 mm ,指示纸片与 FOX相邻处的抑菌环出现截 平现象表明诱导产生 AmpC酶。 结 果 11耐药性转移 : 用含 STR和 CRO的麦康凯对 接合子进行第一次筛选 , 8株 K p均将对 CRO的耐 药传递给受体菌 E1coli C600,共得到 10株不同的 接合子。其中 Kp 1和 Kp 2各得 2株不同表型的接 合子 ECR 111、ECR 112 和 ECR 211、ECR 212,再用含 CAZ、CTX、CA、STR的麦康凯琼脂对这 10株接合子 进行第二次筛选 , 得 8 株接合子。 ECR 112 和 ECR 212在含 CA的琼脂上被抑制不能生长。 21临床分离株和接合子的耐药表型 : 10株接合 子中 , 8株接合子与其供体菌的表型相似 , ECR 112 和 ECR 212加 CA后的 M IC低于 1μg /m l。用双纸 片增效试验检测 ESBL s的试验中 , FOX耐药的 8株 接合子与其临床的分离株一样 , CAZ/CA 和 (或 ) CTX /CA得抑菌环虽比其单药增大 5 mm以上 ,但 CAZ/CA和 (或 ) CTX /CA的抑菌环内有散在的单个 菌落生长。 31 CA和 CLO对酶活性的抑制 : 8株临床分离 株和 10株接合子在三维试验中均具有水解 CRO的 β内酰胺酶活性 ,除 ECR 112和 ECR 212,仅用 CA即 可完全抑制酶的活性外 ,其他菌株需用 CA加 CLO 才能完全抑制酶活性。 41 质粒型 AmpC 的诱导表型 : ECR 112 和 ECR 212的诱导结果阴性 ;其他 8株接合子 ,用 FOX 诱导后 5株酶活性增强。表现为邻近 FOX纸片一 侧的某些药物的抑菌环出现截平现象 ,或抑菌环内 生长菌落密度明显高于远离 FOX的一侧。 讨 论 本试验采用转质粒的方法证实了质粒介导的 AmpC酶菌株在国内临床感染株中出现 ,所选择的 8 株 Kp 经酶抑制试验均证实为同时产 ESBL s和 AmpC酶的耐药菌 ,并成功的通过转质粒试验将产 AmpC酶的功能转入受体菌。 三维试验的结果显示 ,用 CRO 和 STR筛选出 来的接合子 ,表型显示有单独表达 ESBL s的 ,也有 同时表达 ESBL s和 AmpC酶的 ,但是未发现单独表 ·811· 中华检验医学杂志 2006年 2月第 29卷第 2期　Chin J Lab Med, February 2006, Vol 29, No12 达 AmpC酶的接合子。用 CAZ、CTX、CA、STR进一 步筛选后 ,仅表达 ESBL s酶的接合子被抑制 ,能同 时表达 AmpC酶的接合子可以生长 ,这些接合子在 三维酶浸出活性抑制试验中 ,必须用 CA和 CLO联 合才能完全抑制酶的活性 ,在 CAZ/CA或 CTX /CA 的抑菌环中看到散在单个菌落生长 ,即 CA抑制了 ESBL s的活性 ,但不能抑制 AmpC酶的活性 ,圈内生 长的单个菌落分离后 ,也具有以上特性。由此推断 我们所测试的 8 株 AmpC 基因可能导入了携带 ESBL s耐药基因的大质粒 ,并非由单独的质粒携带 , 这一推测还需做进一步的试验证实。 据文献报道质粒介导的 AmpC酶是非诱导性 的 [ 5 ] ,也有文献报道质粒介导的 AmpC酶具有可诱 导性 [ 6 ]。AmpC基因的这两种表达形式可能存在于 不同的菌株中。我们采用 FOX进行诱导 , 8株 Kp 的接合子有 5株与其供体菌一样具有被诱导现象 (与 FOX相邻的某些抗生素抑菌环出现截平现象 ) , 3株接合子未显现明显的被诱导现象。值得研究的 是 , 5株可诱导型接合子在无 FOX诱导的情况下也 产 AmpC酶 ,在酶浸出三维试验中 , CLO对酶活性产 生部分的抑制。我们尝试用低浓度的 FOX诱导 ,在 三维试验中 AmpC酶无明显增加迹象 ,可能因为大 量 ESBL s的存在 ,掩饰了 AmpC酶活性上升的显现。 参 考 文 献 1 MorosiniM I, Ayala JA, Baquero F, et al. B iological cost of AmpC p roduction for Salmonella enterica serotype Typhimurium. Antim icrob Agents Chemother, 2000, 44: 3 13723 143. 2 Coudron PE, Moland ES, Thom son KS. Occurrence and detection of AmpC beta2lactamases among Escherichia coli, Klebsiella pnemoniae, and Proteus m irabilis isolates at a veterans medical center. J Clin M icrobiol, 2000, 38: 1 97121 978. 3 刘金波 ,邵海枫 ,李珍大 ,等. 阴沟肠杆菌高活性β2内酰胺酶检测 与相关耐药表型分析. 中华检验医学杂志 , 2002, 25: 3602361. 4 邵海枫 ,刘金波 ,张小卫 ,等. 用于三维试验的最适酶抑制剂浓度 探讨. 临床检验杂志 , 2003, 21: 3522353. 5 Barnaud G, A rlet G, Verdet C, et al. Salmonella enteritidis: AmpC p lasm id2mediated inducible beta2lactamase (DHA21) with an ampR gene from Morganella morganii. Antim icrob Agents Chemother, 1998, 42: 2 35222 358. 6 Fortineau N, Poirel L, Nordmann P. Plasm id2mediated and inducible cephalosporinase DHA22 from Klebsiella pneumoniae. J Antim icrob Chemother, 2001, 47: 2072210. (收稿日期 : 2005201229) (本文编辑 :毛家都 ) 基金项目 :国家高科技发展 863资助项目 (No12001AA215051) 作者单位 : 325035温州医学院检验医学院 微生态学研究所 (楼 永良、王震、吕建新、陈秀枢、高国辉、陆永绥 ) ;成都军区联勤部军事 医学研究所 (郑颖、尹惠琼、邱薇、李作生、范泉水 ) 通讯作者 :陈秀枢 ,电子信箱 : lyl@wzmc1net 超广谱β内酰胺酶 SHV24型基因克隆表达与纯化研究 楼永良 　王震 　郑颖 　吕建新 　陈秀枢 　尹惠琼 　邱薇 　李作生 　范泉水 　高国辉 　陆永绥 　　在临床微生物学诊断、食品监测、药物生产等研究中均 对超广谱β内酰胺酶 ( ESBL )有广泛需求 ,而目前市售商品 酶都是从天然耐药菌提取的低纯度酶 ,且价格高昂。 我们对 ESBL SHV24型基因的克隆表达和纯化进行系 统研究 ,既具有基础性意义 ,也探索了获取大量、高纯度、低 成本 ESBL的方法学平台 ,为进一步的相关研究奠定基础。 一、材料和方法 11菌株和质粒 :经筛选的高产 SHV24型 ESBL的大肠埃 希菌 ( E1coli)和 E1coli ATCC25922标准株由温州医学院微 生态研究所陈秀枢教授提供 ; pET28a表达载体 , E1coli BL21 (DE3)和 E 1coli JM109菌由成都军区军事医学研究所提供。 21试剂与仪器 : 限制性内切酶 Nco I、Xho I、pMD 182Tvector(宝生物工程有限公司 ) ; T4连接酶、Tag DNA p lus聚合酶、Taq DNA聚合酶、UN IQ210柱式 DNA胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒 (上海生物工程有限公司 ) ; N itrocefin (英国OXO ID公司 )。31SHV24基因的扩增和克隆 :来自高产 SHV24酶E1coli,引物设计引入酶切位点。SHV F: 5′2GG CCATGGGGATGCGTTATATTCGC23′(划线为 Nco I酶切位点 ) , SHV R: 5′2TA CTCGAGGCGTTGCCAGTGCTCGA23′(划线为 Xho I酶切位点 )。反应条件参见文献 [ 1 ]。PCR产物纯化后 ,按 pMD 182T vector说明书 ,进行连接 ,连接产物转化感受态 JM109,经 含氨苄西林及其蓝白斑平板筛选后 ,扩增获筛选的重组菌 , 提质粒酶切 ,最后测序 ,结果用 B last进行核苷酸序列比对。 41pET282SHV24重组质粒的构建和鉴定 :将 pMD18T2 SHV24和 pET28a分别用 Nco I、Xho I双酶切 ,胶回收纯化的 酶切 SHV24基因片段和 pET28a载体 ,用 T4连接酶 16℃连 接 4 h后 ,转化感受态 E1coli BL21 (DE3) ,经含阿米卡星的 ·911·中华检验医学杂志 2006年 2月第 29卷第 2期　Chin J Lab Med, February 2006, Vol 29, No12