头孢地秦和阿米卡星治疗肺炎克雷伯氏菌感染对小鼠胸腺细胞凋亡的影响

收稿日期：!""! # $! # $% 作者简介：王雪欣，女，生于 $&’( 年，硕士，医师。 临床上发现革兰氏阴性菌感染时，机体细胞免疫 功能比较低下。近年研究表明，细菌、内毒素与淋巴细 胞的凋亡有关，且它们所引起的淋巴细胞凋亡与脓毒 血症时机体免疫功能低下密切相关。本实验中我们用 肺炎克雷伯氏菌感染小鼠，观察 !)*内胸腺凋亡及应 用头孢地秦和阿米卡星对凋亡的影响。 ! 材料与 !" ! 材料 健康 +,- 小鼠由重庆医科大学实验动物中心提 供。肺炎克雷伯氏菌由重庆医科大学传染病寄生虫病 研究所抗生素研究室提供临床分离菌种 .编号：!""" # %’! /。头孢地秦：每瓶 $0，德国 -123*45公司生产；阿米 卡星：每瓶 "6 !0，成都天台山制药有限公司生产 .批号 "$"!"$ /。78+9:凋亡检测试剂盒购自德国 ;12*<=>02< ?@>>*2=> 公司。流式细胞仪型号：ABCD C@E=F2<；美国 ;6 G公司制造；激光工作条件：)%%>H。 !" # 方法 （$）健康 +,- 小鼠 (" 只，雌雄各半，体重 $% I !!0，随机分为两组，每组 !(只。一组作为正常对照，腹 腔注射 "6 JHE无菌生理盐水；另一组小鼠腹腔注射浓 度为 $"J CA8 K HE 的细菌悬液 "6 J HE。感染后 J、L、&、 $!、!)* 各组分别取 ( 只小鼠以颈椎脱臼的方法处死 小鼠，用 ’(M的酒精消毒后打开胸腔，取出胸腺组 织剪碎，用针芯轻轻研磨，经 !"" 目尼龙筛网过滤， 制成单细胞悬液，加入 N;D 液洗涤 !、J 次，调节细 胞浓度为 $ O $"’ K HEP 离心沉淀，用 ’"M冰乙醇悬浮 混匀 Q $，! R。根据试剂盒说明操作，上流式细胞仪检测凋 亡细胞的百分率。 （!）取健康 +,-小鼠 !( 只，雌雄兼有，体重 $% I !!0，随机分为 (组，每组 (只。各组小鼠均腹腔注射浓 度为 $"JCA8 K HE 的细菌悬液 "6 JHE；其中一组作为感 染对照组。配制头孢地秦和阿米卡星浓度分别为 !(、 ’(H0 K HE，于感染后 $*给小鼠腹腔注射 "6 !HE不同浓 度的抗生素溶液；对照组腹腔注射相同量的生理盐水。 注射细菌悬液 &* 后杀死小鼠，取胸腺制成单细胞悬 液，用 78+9:法标记后上流式细胞仪检测凋亡率 .方 法同上 /。 （J）将感染后 &*对照组和感染组胸腺取出用丙二 醛固定制作电镜切片。 （)）统计 数据值以 ! S "表示，应用 DBD软 件，同时间点对照组与感染组参数用 #检验，感染组与 治疗组参数用 $检验。 # 结果 #" ! 肺炎克雷伯氏菌小鼠感染模型 感染组小鼠心脏血经生化鉴定均为肺炎克雷伯氏 菌，对照组血培养 !)*无细菌生长，证明肺炎克雷伯氏 头孢地秦和阿米卡星治疗肺炎克雷伯氏菌感染 对小鼠胸腺细胞凋亡的影响 王雪欣 $ 钱元恕 ! .$ 上海市杨浦区安图医院， 上海 !"""&J； ! 汕头大学医学院药理教研室， 汕头 ($("J$） 摘要： 目的 研究肺炎克雷伯氏菌感染及应用头孢地秦、阿米卡星治疗后对 +,-小鼠胸腺细胞凋亡的 影响。方法 给 +,-小鼠腹腔注射肺炎克雷伯氏菌悬液，建立肺炎克雷伯氏菌感染模型。78+9:法染色后用流 式细胞仪观察 !)*内胸腺细胞的凋亡量。腹腔注射不同剂量的头孢地秦和阿米卡星，观察注射后 &*胸腺细胞 的凋亡量。结果 胸腺细胞凋亡在感染后逐渐增高，至 !)* 达高峰（ %T"6 "$）。与感染组相比，头孢地秦 (、 $(H0组的凋亡率分别下降 (LM、%$M，两组比较有显著性差异 . %T"6 "( /。阿米卡星 (、$(H0组的凋亡率分别 下降 )$M、’LM，两组比较也有显著性差异 . %T"6 "( /。结论 肺炎克雷伯氏菌感染能引起胸腺细胞发生凋亡， 应用头孢地秦和阿米卡星能明显抑制胸腺细胞的凋亡。 关健词： 肺炎克雷伯氏菌； 感染； 头孢地秦； 阿米卡星； 胸腺细胞； 凋亡 中图分类号：U&L( 文献标识码：B 文章编号：$""$V%L%& .!"") /"$ # "")" # ") ·)"· 中国抗生素杂志 !"") 年 $月第 !& 卷第 $期 表 ! 小鼠胸腺细胞凋亡率的比较 !"，# $ %，! & ’ ( 时间（)） * + , -. ./ 感染组 *0 1. $ -0 21# +0 31 $ 20 ’1## -.0 +- $ 20 +’## ./0 *1 $ ’0 -,## /’0 1/ $ *0 /2## 同时间点与对照组比较 #："420 2-； ##5 "420 22-。 -：对照组； .：感染组 图 - 感染 ./)胸腺细胞凋亡率比较 头孢地秦和阿米卡星治疗肺炎克雷伯菌感染对小鼠胸腺细胞凋亡的影响 王雪欣等 ·/-· 生理盐水对照组 -0 -- $ 20 .- -0 2* $ 20 2’ -0 2’ $ 20 2’ -0 22 $ 20 2/ -0 2/ $ 20 2/ 凋亡率（"） -.0 +- $ 20 +’ ’0 ’/ $ .0 .,# .0 *3 $ -0 ’/#* 10 /+ $ -0 1,# *0 2+ $ -0 1/#+ ! ’ ’ ’ ’ ’ 感染组 头孢地秦 ’67组 头孢地秦 -’67组 阿米卡星 ’67 阿米卡星 -’67组 表 " 头孢地秦、阿米卡星治疗组与感染组胸腺细胞 凋亡率的比较 ! # $ % ( 菌感染模型建立。 "# " 感染组和对照组小鼠胸腺细胞凋亡率的比较 对照组胸腺细胞在 ./)内仅有极少量发生凋亡。 89:小鼠感染肺炎克雷伯氏菌 *) 后胸腺细胞开始出 现少量凋亡，至 ./) 凋亡率达高峰。各时间点感染组 与对照组比较，均有显著升高 ! "420 2-，表 -、图 - (。 "# $ 用药组小鼠胸腺细胞凋亡率 小鼠感染肺炎克雷伯氏菌 ,) 后，头孢地秦 ’、 -’67 和阿米卡星 ’、-’67 四个组的凋亡率均低于感 染组；剂量越大，抑制效果越明显。与感染组相比，头 孢地秦 ’、-’67组的凋亡率分别下降 ’+"、3-"，两组 比较有显著性差异 ! "420 2’ (。阿米卡星 ’、-’67 组的 凋亡率分别下降 /-"、1+"，两组比较也有显著性差 异 ! "420 2’，表 .）。 "# % 对照组与感染组胸腺透射电镜照片比较 感染后 ,)电镜下小鼠胸腺中可以见到单个的凋 亡细胞。主要表现为凋亡细胞体积减小，胞浆内电子 密度增高 !图 .;(；染色质浓集并靠近核膜，形成新月 状体 !图 .<(；细胞核体积明显缩小，核固缩 !图 .=(； 形成具有完整膜性结构的凋亡小体 !图 .>(。 $ 讨论 目前的研究发现，革兰氏阴性菌感染能诱发淋巴 细胞凋亡。本实验中正常小鼠胸腺细胞只有极少量出 现凋亡，而肺炎克雷伯氏菌感染后 ./)内胸腺细胞凋 亡率则不断上升，至 ./)达到高峰，说明细菌感染对机 体免疫器官有明显的损害作用。同时我们也观察到小 鼠胸腺细胞出现典型的凋亡形态改变：凋亡早期，细胞 体积缩小，失去细胞连接，胞浆内电子密度增高，染色 质聚集并靠近核膜，形成新月状体，胞膜、线粒体、高尔 基体等细胞器保持完整；凋亡中期，核固缩，或裂解为 数个致密体；在凋亡晚期，这些致密体与其他细胞器成 分形成具有完整膜性结构的凋亡小体。 脓毒血症时淋巴细胞凋亡的机制目前还不清楚。 小鼠注射 ?@A 后，胸腺皮质内小淋巴细胞凋亡明显， 皮质明显萎缩变薄，而髓质的改变不明显 B * C。表型分 析，主要以<= D/、<= D3 E 细胞显著减少为主 B / C。一方面， 脓毒血症时由于细菌及内霉素的不断入侵，E细胞被 激活，当非特异性的损伤时可致淋巴细胞的凋亡 B ’ C。大 量未成熟 E 细胞凋亡将引起释放至外周淋巴器官中 的成熟淋巴细胞减少，损害免疫功能，导致免疫抑制， 这种抑制以 E 淋巴细胞功能抑制尤为突出。另一方 面，脓毒血症时淋巴细胞凋亡增加代表机体免疫系统 的一种代偿，以抑制早期失控的炎症反应和提高机体 生存率。 近年来研究表明，抗菌药对真核细胞的功能，尤其 是免疫调节功能具有明显影响。在抗感染治疗中一方 面直接对病原菌起到选择性抗菌作用，另一方面还可 能通过增强机体免疫功能以产生协同抗菌作用。头孢 地秦是第三代氨噻唑头孢菌素，它可增强吞噬细胞的 吞噬杀菌作用；显著提高免疫缺陷患者的<= D/ 细胞 数，使<= D/ F <= D3 比值升高或恢复正常；增强自然杀伤 细胞活性；且使活化的淋巴细胞 9? G .受体表达增多， 减少 9? G +和 E8H的产生，对免疫低下感染者尤为突 出 B +I 1 C。阿米卡星属氨基糖苷类抗生素，是体内或半体 内抑制免疫功能的抗菌药。国内报道，阿米卡星发挥抗 感染作用的同时还可引起<= D*、<= D/ 细胞的显著降低， 表现为抑制 E细胞功能的作用 B 3 C。 在细菌感染引起的胸腺细胞凋亡的研究中，关于 #：与感染组比较 "420 2’；*：与头孢地秦 ’67组比较 "420 2’； +：与阿米卡星 ’67组比较 " 420 2’。 ·!"· 中国抗生素杂志 "##! 年 $月第 "% 卷第 $期 & 图 " ’：正常胸腺细胞（ ( )###）； *：凋亡的胸腺细胞中胞浆电子密度增加（ ( +)##）； ,：凋亡的胸腺细胞中染色质边集（ ( -###）； .：凋亡细胞体积缩小，核固缩（ ( )###）； &：凋亡小体形成（ ( )###） . * ,’ 使用抗菌药在体内对胸腺细胞凋亡影响的研究尚未见 报道。我们于感染后 $/分别给小鼠腹腔注射不同剂量 的头孢地秦或阿米卡星，发现 %/ 后小鼠毒血症状减 轻，胸腺细胞凋亡率明显下降。抗生素剂量越大，抑制 凋亡作用越明显，各治疗组与感染组比较均有显著性 差异。这可能是因为两者对革兰氏阴性菌均具有强大 的杀菌效力，能在体内杀灭肺炎克雷伯氏菌，减少 012、345等炎性介质的释放，阻断 345介导的 3细胞 凋亡，减少胸腺淋巴细胞的凋亡。头孢地秦对 3/# 细 胞朝 3/$ 细胞转化有促进作用，但却能抑制 3/# 朝 3/" 细胞转化，使 60 7 $、60 7 "、654 生成增多，60 7 -、 345 生成减少，提高机体免疫力。阿米卡星虽然对 3 细胞有抑制作用，但能杀灭革兰氏阴性菌，阻断炎性细 胞因子所介导的 3淋巴细胞凋亡，提高机体对病原菌 的应答反应，一定程度上弥补了药物本身对 3细胞的 抑制作用。 本实验表明，细菌感染时，头孢地秦和阿米卡星能 明显抑制胸腺细胞的凋亡，说明抗菌药在抗感染的同 时对机体免疫功能有一定的调节作用。脓毒血症时既 存在过度的炎症反应，也存在明显的免疫功能低下。因 此细菌如何诱导机体免疫细胞凋亡的机制有待进一步 的研究。 参 考 文 献 8 $ 9 司徒镇强，吴军正 : 细胞培养 8; 9 : 第一版 : 北京：世界图 书出版公司< $%%-："%% 8" 9 张军田 : 现代药理实验方法 8; 9 : 第一版 : 北京：人民卫生 出版社< $%%=："++ 8> 9 ?@ABC D< EFGAHF E< 5IJCKFLF 4< !" #$: %& ’(’) CGHIMNCOG OP FQOQNORCR CG N/A N/STIR US FHTCGCRNLFNCOG OP TSMLOUFMNALCFV MOLH PFMNOL W NLA/FVORA -< -’XHCTSMOVFNA Y 8 Z 9 : %&*!+" %,,-&(. $%%+< -) W) Y [ $+%> 8! 9 0CG D2< 0AC \D< 0OK 30< !" #$/ %& ’(’) CGHIMNCOG OP FQOQNORCR CG CTTFNILA N/STOMSNAR US 2NFQ/SVOMOMMFV AGNALONO]CG * 8 Z 9 : 0 %,,-&)$/ $%%"< $!% W! 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