扬州大学《植物细胞工程》 第三章 植物组织培养再生植株

null第三章 植物组织培养再生植株第三章 植物组织培养再生植株植物组织培养再生植株的途径植物组织培养再生植株的途径123植物组织与器官培养基本步骤植物组织与器官培养基本步骤1、外植体的选择，建立无菌培养体系 2、无菌培养体系的快速增殖 3、器官发生，形成不定芽或胚状体 4、生根培养与试管苗的移植。第一节、无菌培养体系的建立与增殖第一节、无菌培养体系的建立与增殖 外植体的选择、灭菌、接种、培养一、无菌培养体系的建立二、外植体的脱分化——愈伤组织诱导二、外植体的脱分化——愈伤组织诱导（一）愈伤组织的形成 1、诱导期（起始期）：分裂准备期； 2、分裂期：细胞从开始分裂到持续分裂的时期； 3、形成期：愈伤组织不再增殖，组织内部 出现“维管组织结节”或“分生组织结节”。二、外植体的脱分化——愈伤组织诱导二、外植体的脱分化——愈伤组织诱导（二）愈伤组织诱导的条件 一般认为，诱导愈伤组织成败的关键主要在于培养的条件，其中，植物生长调节剂是诱导愈伤组织形成的极为重要的因素。二、外植体的脱分化——愈伤组织诱导二、外植体的脱分化——愈伤组织诱导（二）愈伤组织诱导的条件 生长素：启动细胞分裂的重要激素，是植物细胞脱分化、形成愈伤组织过程中不可缺少的物质。 常用的种类有2,4-D , IAA 和NAA , 所需浓度在0.01～10mg/L 范围内；二、外植体的脱分化——愈伤组织诱导二、外植体的脱分化——愈伤组织诱导（二）愈伤组织诱导的条件 细胞分裂素：能够使已脱分化的细胞，或细胞团保持持续有丝分裂。 常用的细胞分裂素是激动素、玉米素和6-BA ，使用的浓度范围在0.1～10mg/L。 生长素和细胞分裂素对保持愈伤组织的快速生长是必要的，特别是两者结合使用时，能更强烈地刺激愈伤组织的形成。（三）愈伤组织的增殖 （三）愈伤组织的增殖 增殖途径——继代培养继代培养（Subculture）——指培养组织在培养基上生长一段时间后，营养物质枯竭，水分散失，并已积累了一些代谢产物，此时需要将这些组织转移到新的培养基上，这种转移称为继代培养。 Subcultures are usually performed every 3 to 6 weeks!二、外植体的脱分化——愈伤组织诱导二、外植体的脱分化——愈伤组织诱导（四）优良愈伤组织的特性 增殖能力旺盛； 分散性好，容易建立优良的悬浮系； 有利于再分化，或得再生植株。null愈伤组织再分化成器官一般要经过三个生长阶段：第一阶段是外植体经过诱导形成愈伤组织；第二阶段是“生长中心”形成。当把愈伤组织转移到有利于有序生长的条件下以后，首先在若干部位成丛出现类似形成层的细胞群，通常称之为“生长中心”，也称为拟分生组织，它是愈伤组织中形成器官的部位； 第三阶段是器官原基及器官形成。 第二节 器官发生第二节 器官发生离体器官发生 :指培养条件下的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定根（adventitious roots）、不定芽（adventitious shoots）、类原球茎(PLBs)等器官的过程。 由胚性愈伤组织产生胚状体（体细胞胚）:胚性愈伤组织的面是高度分生组织化的细胞团，其表面可以产生大量的胚状体。 生根培养生根培养对于上述途径所获得的芽，在大多数情况下均需要转移到生根培养若进行生根诱导发育成完整植株。 生根培养基一般降低矿物营养的浓度，提高生长素的浓度。具体应根据植物种类而定。试管苗驯化移栽——Transplanting 试管苗驯化移栽——Transplanting 炼苗（驯化）：移栽前将培养物不开口，移到自然光照下锻炼2-3d，让试管苗接受强光的照射，使其长得壮实起来，然后再开口炼苗1-2d，经受较低湿度的处理，以适应将来自然湿度的条件 。nullnull蝴蝶兰的组织培养过程null蝴蝶兰的组织培养过程植物组织培养再生植株的途径植物组织培养再生植株的途径123第三节 植物组织培养常见问题及对策第三节 植物组织培养常见问题及对策组织培养常见问题组织培养常见问题（一）褐变 （二）玻璃化 (三）污染 （一）褐化现象及预防（一）褐化现象及预防1、褐化(nonenzymatic browning reaction )的原因 现象:外植体在诱导脱分化或再分化过程中,自身组织从表面向培养基释放褐色物质,以至培养基逐渐变成褐色,外植体也随之进一步变褐而死亡。 机理：植物受伤后 ,体内释放的酚类物质在酚氧化酶的作用下被氧化成褐色的醌类物质。 影响因素:褐化主要与植物材料的基因型和生理状态、取材时期、培养基以及培养条件等有关;在植物、尤其是木本植物组织培养中普遍存在。（一）褐化现象及预防（一）褐化现象及预防2、褐化的预防 1)选择合适的外植体(生理状态、生长部位） 2)培养基的优化筛选 3）使用抗氧化剂（VC、 间苯二酚、硝酸盐） 3）使用吸附剂（活性炭、聚乙烯吡咯烷酮） 4）及时继代培养 （二）玻璃化现象及预防（二）玻璃化现象及预防现象：植物组织培养中出现的半透明状的、畸形的试管植物，试管苗的叶、嫩梢呈水晶透明、水浸状，植株矮小肿胀、失绿，叶片邹缩卷曲，无功能性气孔，无栅栏组织，体内含水量高。 机理：尚不很清楚，可能是培养基渗透势不当，导致乙烯产生，进而激发其它激素和酶的活性，抑制蛋白质、纤维素和木质素的合成，促进叶绿素的分解，形成玻璃苗。 目前研究认为是植物细胞分裂与体积增大的速度超过了干物质生产和积累的速度，植物只好用水分来充涨体积，从而表现玻璃化。 （二）玻璃化现象及预防（二）玻璃化现象及预防预防：　　　　　　　　　　 （1）适当控制培养基中无机盐成分，适当提高蔗糖和琼脂浓度，减少含氮化合物的用量，降低培养基的水势。　　 （2）适当降低CTK、GA的浓度。考虑加入适当的脱落酸。 （3）改善培养器皿的气体交换状况； （4） 避免过高的培养温度，增加自然光照 （5）增加继代培养代数null第四节 人工种子 （Artificial seeds） 植物组织培养再生植株的途径植物组织培养再生植株的途径一、人工种子的概念一、人工种子的概念将植物离体培养产生的体细胞胚包埋于含有营养成分和保护功能的物质中，在适宜条件下发芽出苗的颗粒体。（Kamada,1985） 任何一种繁殖体，无论是在涂膜胶囊中包裹的、裸露的或经过干燥的，只要能够发育成完整的植株，均或称之为人工种子。 （陈正华等，1998）null观看录相:人工种子二、人工种子的优点二、人工种子的优点1.建立高效快速的植物无性繁殖方法（无性繁殖植物）。 2.对于制种困难的优异杂种种子可以快速获得大量种子。 3.用于快速繁殖不能正常产生种子的特殊植物材料。 4.与田间制种相比，可以节省制种用地，且不受季节限制。 5.与利用试管苗相比，可避免移栽困难，实现机械化操作，便于储藏和运输。三、人工种子的生产流程三、人工种子的生产流程1、繁殖体的人工诱导与生产增殖2、繁殖体的筛选和预处理胚状体； 微芽； 原球茎后熟培养； 人工筛选； 脱水干燥3、人工种子的包埋繁殖体的预处理人工胚乳：人工种皮:海藻酸钠 明胶果胶酸钠等繁殖体的包埋nullArtificial seed production from encapsulated PLBs regenerated from leaf base of Vanda coerulea Artificial seed production from encapsulated PLBs regenerated from leaf base of Vanda coerulea Sarmah DK et al., 2010, Current ScienceTHE ENDTHE ENDnull通过器官发生形成再生植株大体上有三种方式: 第二种方式为先根后芽; 第三种方式是在愈伤组织的不同部位形成芽和根， 再通过维管组织的联系形成完整植株。 第一种方式是先芽后根; Rapid Multiplication by Transfer of Cultures （一）胚状体(embryoid )的概念（一）胚状体(embryoid )的概念胚状体(体细胞胚, Somatic embyo)：离体培养中，没有经过受精过程，但经过了胚胎发育过程形成的胚的类似物。（二）体细胞胚的发生途径（二）体细胞胚的发生途径1、从外植体直接发生 2、经胚性愈伤组织发生 3、悬浮培养细胞发生null（三）体细胞胚的发生过程: null（四）胚状体（embryoid）特点： 不同于合子胚，因为它不是两性细胞融合产生; 不同于孤雌/雄胚，因为它不是无融合生殖的产物； 不同于器官发生方式形成的茎芽和根，因为它经历 了与合子胚相似的发育过程且成熟的胚状体是双极 性结构。 （五）影响体细胞胚发生的因素（五）影响体细胞胚发生的因素1、生长素（2,4-D）有利于诱导体细胞胚的形成，但是抑制体细胞胚的发育。 2、培养基中的氮源影响体细胞胚的发生频率。 3、不同基因型间体细胞胚的形成能力有差异。null体细胞胚发育再生成植株有两个明显的特点： 一是体细胞胚具有双极性（double polarity）； 二是体细胞胚形成后与母体的维管束系统连系 较少，即出现所谓的生理隔离（physiological isolation）现象。 null体细胞胚与合子胚的区别:合子胚在发育初期具有明显的胚柄，而体细胞胚 一般没有真正的胚柄只有类似胚柄的结构。 合子胚的子叶是相当规范的，可以作为分类的依 据，而体细胞胚的子叶常不规范，有时具有两片 以上的子叶。与相同植物比较，体细胞胚的体积明显小于合子胚。 体细胞胚没有休眠而体细胞胚则直接形成植株。合 子胚在胚胎发育完全进入子叶期以后，经过一系列 的物质积累和脱水就进入休眠。