H9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法

ICS 11.220 B41 中华人民共和国国家 GB/T 19438.4—2004 H9亚型禽流感病毒荧光 RT-PCR检测方法 Method of the real-time RT-PCR for the detection of Avian Influenza virus subtype H9 2004-2-15发布 2004-2-15实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会 发布 GB/T19438.4—2004 I 前 言 本标准是依据 GB/T1.1—2000《标准化工作导则 第 1部分：标准的结构和编写》制定的。 本标准的附录Ａ是本标准的资料性附录。 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出。 本标准起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局、深圳市匹基生物工程股份有限公司。 本标准主要起草人：张利峰、张鹤晓、刘继红、郭晋优、刘艳华、杨伟。 本标准系首次发布的国家标准。 GB/T19438.4—2004 1 H9亚型禽流感病毒荧光 RT-PCR检测方法 1 范围 本标准了荧光RT-PCR检测H9亚型禽流感病毒的操作方法。 本标准适用于活禽及其产品中H9亚型禽流感病毒的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的 修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T19438.1-2004 禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法 3 缩略语 下列缩略语适用于本标准： 荧光 RT-PCR 荧光反转录-聚合酶链反应。 Ct值 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 RNA 核糖核酸。 DEPC 焦碳酸乙二酯。 PBS 磷酸盐缓冲盐水（配方见附录 A）。 Taq酶 Taq DNA聚合酶。 4 原理 H9亚型禽流感病毒荧光 RT-PCR检测方法是采用 TaqMan技术。设计一对仅在 H9亚型禽流感病毒 血凝素基因间保守的特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针。探针的 5’端和 3’端分别标记不同的 荧光素，如 5’端标记 FAM荧光素，它发出的荧光能够被检测仪器接收，称为报告荧光基团（用 R表示）， 3’端一般标记 TAMRA荧光素，它在近距离内能吸收 5’端报告荧光基团发出的荧光信号，称为淬灭荧光 基团（用 Q表示）。 当PCR反应在退火阶段时，一对引物和一条探针同时与目的基因片段结合，此时探针上R基团发出的荧 光信号被Q基团所吸收，仪器检测不到R所发出的荧光信号；当PCR反应进行到延伸阶段时，Taq酶在引物 的引导下，以四种核苷酸为底物，根据碱基配对的原则，沿着模板链合成新链；当链的延伸进行到探针 结合部位时，受到探针的阻碍而无法继续，此时的Taq酶发挥它的5’→3’外切核酸酶的功能，将探针切 成单核苷酸，消除阻碍，与此同时标记在探针上的R基团游离出来，R所发出的荧光再不为Q所吸收而被 检测仪所接收；在Taq酶的作用下继续延伸过程合成完整的新链，R和Q基团均游离于溶液中，仪器可继 续检测到R所发出的荧光信号。 5 与试剂 5.1 试剂 除特别以外，本标准所用试剂均为分析纯，所有试剂均用无RNA酶污染的容器（用DEPC水处 理后高压灭菌）分装。 氯仿 GB/T19438.4—2004 2 异丙醇（-20 oC预冷） PBS：121±2 ℃，15 min高压灭菌冷却后，无菌条件下加入青霉素、链霉素各 10 000 U/mL 75%乙醇:用新开启的无水乙醇和无 RNA酶的水配制（符合 GB 6682－92要求），-20 oC预冷 H9亚型禽流感病毒荧光 RT-PCR检测试剂盒 1）:组成、说明及使用注意事项见附录 A 5.2 仪器与器材 荧光RT-PCR检测仪 高速台式冷冻离心机（最高转速12 000 r/min以上） 台式离心机（最高转速2 000 r/min） 混匀器 冰箱(2 oC～8 oC和-20 oC两种) 可移动紫外灯 微量可调移液器及配套带滤芯吸头（10 µL、100 µL、1 000 µL） 专用毛细玻璃管或PCR管 Eppendorf管（1.5 mL） 6 抽样 6.1 采样工具 下列采样工具必须经（121±2） oC，15 min高压灭菌并烘干： 棉拭子、剪刀、镊子、注射器、1.5 mL Eppendorf管、研钵。 6.2 样品采集 6.2.1 活禽 取咽喉拭子和泄殖腔拭子，采集方法如下： ——取咽喉拭子时将拭子深入喉头口及上颚裂来回刮3次～5次取咽喉分泌液； ——取泄殖腔拭子时将拭子深入泄殖腔转一圈并沾取少量粪便； ——将同一样品的咽喉拭子和泄殖腔拭子一并放入盛有1.0 mL PBS的1.5 mL Eppendorf管中，加盖、 编号。 6.2.2 肌肉或组织脏器 待检样品装入一次性塑料袋或其它灭菌容器，编号，送实验室。 6.2.3 血清、血浆 用无菌注射器直接吸取至无菌Eppendorf管中，编号备用。 6.3 样品储运 样品采集后，将采集的样品放入密闭的塑料袋内（一个采样点的样品，放一个塑料袋），于保温箱 中加冰、密封，送实验室。 6.4 样品制备 6.4.1 咽喉、泄殖腔拭子 样品在混合器上充分混合后，用高压灭菌镊子将拭子中的液体挤出，室温放置30 min，取上清液转 入无菌的1.5 mL Eppendorf管中，编号备用。 6.4.2 肌肉或组织脏器 取待检样品2.0 g于已洗净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加10 mL PBS混匀，4 oC，3 000 r/min 离心15 min取上清液转入无菌的1.5 mL Eppendorf管中，编号备用。 6.5 样本存放 1） 由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同 的效果，则可使用这些等效产品。 GB/T19438.4—2004 3 样本在2 oC～8 oC条件下保存应不超过24 h，若需长期保存应放在-70 oC以下冰箱，但应避免反复冻 融（冻融不超过3次）。 7 操作方法 7.1 实验室的设置与管理 实验室的设置与管理见GB/T 19438.1-2004附录C。 7.2 样本的处理 在样本制备区进行。 7.2.1 取 n个灭菌的 1.5 mL Eppendorf管，其中 n为被检样品、阳性样品与阴性样品的和（阳性样品、 阴性样品在试剂盒中已标出），做标记。 7.2.2 每管加入 600 µL裂解液，分别加入被检样本、阴性对照、阳性对照各 200 µL，一份样本换用 一个吸头，再加入 200 µL氯仿，混匀器上振荡混匀 5 s（不能过于强烈，以免产生乳化层，也可以用手 颠倒混匀）。于 4 oC、12 000 r/min离心 15 min。 7.2.3 取与 6.2.1相同数量灭菌的 1.5 mL Eppendorf管，加入 500 µL异丙醇（-20 oC预冷），做标记。 吸取本标准 6.2.2各管中的上清液转移至相应的管中，上清液应至少吸取 500µL，不能吸出中间层，颠 倒混匀。 7.2.4 于 4 oC、12 000 r/min离心 15 min（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置），小心倒去 上清，倒置于吸水纸上，沾干液体(不同样品须在吸水纸不同地方沾干)；加入 600 µL 75％乙醇，颠倒 洗涤。 7.2.5 于 4 oC、12 000 r/min离心 10 min（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置），小心倒去 上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体（不同样品须在吸水纸不同地方沾干）。 7.2.6 4 000 g离心 10 s（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置），将管壁上的残余液体甩到 管底部，小心倒去上清，用微量加样器将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面， 室温干燥 3 min，不能过于干燥，以免 RNA不溶。 7.2.7 加入 11 µL DEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的 RNA，2 000 r/min离心 5 s，冰上保存备用。提 取的 RNA须在 2 h内进行 PCR扩增；若需长期保存须放置于-70 oC冰箱。 7.3 检测 7.3.1 扩增试剂准备 在反应混合物配制区进行。 从试剂盒中取出相应的荧光RT-PCR反应液、Taq酶，在室温下融化后，2 000 r/min离心5 s。设所需 荧光RT-PCR检测总数为n，其中n为被检样品、阳性样品与阴性样品的和，每个样品测试反应体系配制 见下表。 每个样品测试反应体系配制表 试剂 RT-PCR反应液 Taq酶 用量 15 µL 0.25 µL 根据测试样品的数量计算好各试剂的使用量，加入到适当体积试管中，按每4份样品加入1颗RT-PCR 反转录酶颗粒，计算应加入的酶颗粒数，充分混合均匀，向每个荧光RT-PCR管中各分装15 µL反应混合 物液体，转移至样本处理区。 7.3.2 加样 在样本处理区进行。 在各设定的荧光RT-PCR管中分别加入上述样本处理步骤7.1.7中制备的RNA溶液各10 µL，盖紧管 盖，500 r/min离心30 s。 7.3.3 荧光 RT-PCR检测 在检测区进行。 sxy 矩形 生工提取RNA方法 GB/T19438.4—2004 4 将本标准7.2.2中离心后的PCR管放入荧光RT-PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。 循环条件设置： 第一阶段，反转录42 oC /30 min； 第二阶段，预变性92 oC/3 min； 第三阶段，92 oC/10s，45 oC/30s，72 oC/1min，5个循环； 第四阶段，92 oC/10s，60 oC/30s，40个循环，在第四阶段每次循环的退火延伸时收集荧光。 试验检测结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。 8 结果判定 8.1 结果分析条件设定 直接读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩 增曲线的最高点为准。 8.2 质控标准 8.2.1 阴性样品无 Ct值或无扩增曲线。 8.2.2 阳性对照的 Ct值应<28.0，并出现典型的扩增曲线。否则，此次实验视为无效。 8.3 结果描述及判定 8.3.1 阴性 无Ct值或无扩增曲线，表示样品中无H9亚型禽流感病毒。 8.3.2 阳性 Ct值≤30，且出现典型的扩增曲线，示样品中存在H9亚型禽流感病毒。 8.3.3 有效原则 Ct>30的样本建议重做。重做结果无数值者为阴性，否则为阳性。 GB/T19438.4—2004 5 附 录 A （资料性附录） H9亚型禽流感病毒荧光 RT-PCR检测试剂盒的组成 A.1 试剂盒组成 每个试剂盒可做48个检测，包括以下成分： 裂解液 30 mL×1盒 DEPC水 1 mL×1管 H9亚型禽流感病毒RT-PCR反应液 750 µL×1管 RT-PCR酶 1颗/管×12管 Taq酶 12 µL×1管 阴性对照 1 mL×1管 阳性对照（非感染性体外转录RNA） 1 mL×1管 A.2 说明 A.2.1 裂解液的主要成分为异硫氰酸胍和酚，为RNA提取试剂，外观为红色液体，于4 ℃保存。 A.2.2 DEPC水，是用1%DEPC处理后的去离子水，用于溶解RNA。 A.2.3 H9亚型禽流感病毒RT-PCR反应液中含有检测H9亚型禽流感病毒的特异性引物、探针及各种 离子。 A.3 使用时的注意事项 A.3.1 由于阳性样品中模板浓度相对较高，检测过程中不得交叉污染。 A.3.2 反应液分装时应避免产生气泡，上机前检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪 器。 A.3.3 RT-PCR酶颗粒极易吸潮失活，必须在室温条件下置于干燥器内保存， 使用时取出所需数 量，剩余部分立即放回干燥器中。