扬州大学《植物细胞工程》 第五章 生殖细胞培养（一）

null第五章 生殖器官培养第五章 生殖器官培养培养对象培养对象花药培养、花粉培养 子房培养、胚珠培养、胚培养、胚乳培养 离体受精第一节 花药和花粉培养第一节 花药和花粉培养一、 概述一、 概述概念 花药培养:把发育到一定阶段的花药接种在人工培养基上,使其发育和分化成为植株的过程. 花粉培养(小孢子培养):从花药中分离出花粉粒,使之成为分散的或游离状态,通过培养使花粉粒脱分化,进而发育成完整植株的过程. 花药培养和花粉培养是获 是植物单倍体的有效方法之一null二倍体(diploid )植物其单倍体（haploid）即一倍体（monoploid ）如， 玉米 2n = 2x = 20 n= x = 10； 水稻 2n = 2x = 24 n= x = 12四倍体(tetraploid)植物其haploid为dihaploid 如，马铃薯 2n = 4x = 48， n = 2x = 24 六倍体(hexaploid)植物其haploid为triploid 如，普通小麦2n = 6x = 42， n = 3x = 21八倍体(octoploid)植物其haploid为tetraploid 如，草莓 2n = 8x = 56 ，n = 4x = 28单倍体(haploid)是不是就是一倍体呢？ 单倍体(haploid)——指具有配子体（gametophyte）染色体数的孢子体(植物个体)(sporophyte)。 null 体细胞染色体数减半； 单倍体植物与二倍体相比较，有三个明显的特点： 生长发育弱，体形小、各器官明显减小； 雌雄配子严重败育，有的甚至不能进入有性 世代。 （二）花药或花粉培养在作物育种中的作用：（二）花药或花粉培养在作物育种中的作用：（1）缩短育种年限：常规育种需4-6年获得纯系，而小孢子培养仅需1-2年。null例： 二倍体供体植株基因型为AaBb，若要从后代中选择基因为AAbb的纯合单株 常规方法： AAbb出现的概率为1/16，并且不能将AAbb与Aabb、aAbb区分开。 （2）提高了目标基因型的选择效率 AB aB Ab ab AB AABB AaBB AABb AaBb aB aABB aaBB aABb aaBb Ab AabB AabB AAbb Aabb ab aAbB aabB aAbb aabbnull例： 二倍体供体植株基因型为AaBb，若要从后代中选择基因为AAbb的纯合单株 单倍体方法： AAbb出现的概率为1/4。 （2）提高了目标基因型的选择效率null 植株不受显隐性的影响，在诱变育种中能在当代及时获得突变个体，加倍后成为稳定的纯系。 （3）诱变育种中的作用 （4）利于筛选隐性突变体 提高诱变效率 null（5）利于获得优良植株 null（6）应用于远缘杂交，克服不育性 null2NN减数分裂nullN双核早期（三）花药和花粉培养中雄核发育的途径（三）花药和花粉培养中雄核发育的途径1、A途径 小孢子第一次有丝分裂为不均等分裂，形成营养细胞和生殖细胞 （1）A-V途径 由营养细胞重复分裂形成单倍体 （2）A-G途径 由生殖细胞重复分裂形成单倍体 （3）A-VG途径（E途径） 由营养细胞和生殖细胞各自独立分裂，共同形成单倍体 （4）C途径 营养细胞和生殖细胞通过核融合，形成多倍体植株（三）花药和花粉培养中雄核发育的途径2、B途径 小孢子第一次有丝分裂为均等分裂，形成大小相近的两个细胞。然后由这两细胞连续分裂形成单倍体植株，或者核融合形成多倍体植株。 （三）花药和花粉培养中雄核发育的途径null（四）花药培养与花粉培养的异同点（四）花药培养与花粉培养的异同点培养目的相同，均获得小孢子植株。 花药培养属于器官培养；而花粉培养属于细胞培养。 花粉培养没有药壁组织干扰，单倍体产量高。二、 花药培养技术二、 花药培养技术（一）研究历史： 首先报道通过花药培养获得单倍体植株成功的是印度学者Guha和Maheshwari (1964, 1966)。 1996年的统计数据明,已有至少250多种植物花药培养成功。 花药培养获得单倍体的技术途径已在禾本科作物、茄科作物、十字花科作物的育种中广泛应用。 null（二）花药培养的基本程序是： 外植体选择－消毒—剥取花药—接种—诱导培养—植株再生外植体的选择： 供试材料的遗传背景，供试材料的生理状态，花粉的发育时期等。nullN双核早期null 选择花药时，一般通过镜检来确定其中的花粉是否处于适宜的发育期。 最常用的方法有醋酸洋红法。但是，某些植物的花粉细胞核不易着色，需采用焙花青-铬矾法，这种方法能将花粉细胞核染成蓝黑色。 nullDifferent flower stages as used in anther culture. Stage 2 is the optimum stage of development for use in tobacco anther culturenull（二）花药培养的基本程序是： 外植体选择－消毒—剥取花药—接种—诱导培养—植株再生花药的剥取： 避免花药受到损伤，因为损伤常会刺激花药壁组织的发育，形成二倍体的愈伤组织。null（二）花药培养的基本程序是： 外植体选择－消毒—剥取花药—接种— 诱导培养—植株再生null 花药培养常用的基本培养基： N6：高硝态氮，低铵态氮，广泛用于禾本科植物的花药培养 B5、MS、White、Nitch 等。 C17（王培等，1986）：适于小麦花药培养，提高 出愈率。激素：相对较低的激素水平 蔗糖：一般2-3%，高浓度对禾谷类较有利 番茄花药培养对蔗糖浓度的诱导反应 蔗糖浓度 2％ 3％ 4％ 6％ 10％ 13％ 17％ 诱导频率 5％ 10％ 12％ 18％ 25％ 45％ 8％培养条件－温度和光照：null温度 柑橘在20°C以下，完全不能形成胚状体，且愈伤组织形成亦很少，当将温度提高 到21～25°C时便会有胚状体形成，而当温度提高到26°C以上时又完全不能形成胚状体。 油菜若将接种后的花药在30°C条件下培养2～3天，可显著提高花粉胚的形成率， 小麦在33°C条件下培养3～5天，可提高成愈率和绿苗率 光照：先弱后强 三、花粉培养技术三、花粉培养技术1、取材时期：四分体时期到单核早期。 2、花粉的分离： 3、小孢子纯化： 对获得的小孢子混合物进行分级过筛、梯度离心处理纯化小孢子 4、花粉的培养 nullnull1）自然散落法(漂浮培养自然释放法) ： 将花药接种在预处理液或液体培养基上，待花粉自动散落后，收集培养。 2）机械游离法 a.磁搅拌法：用磁力搅拌器低速搅拌培养液中的花药，使花粉游离出来； b.挤压法：在烧杯或研钵中挤压花药，将花粉挤出后收集培养。 花粉培养方法花粉培养方法1、平板培养：花粉置琼脂固化培养基上培养。 2、液体培养： 花粉悬浮在液体培养基中培养，需震荡，以利通气。 3、双层培养：先铺一层琼脂固体培养基（加入失活花药的浸提液），凝固后，在表面加入少量液体培养基培养。 4、看护培养：利用花药或花药愈伤组织释放出的活性物质促进花粉小孢子发育。 5、微室培养：利用小的盖玻片和凹穴载玻片形成微室进行花粉培养。null看护培养图解 1、胚状体发育途径：小孢子经历胚发生的各个阶段，最后子叶展开，形成花粉植株。四、花粉植株的形态发生方式烟草花药培养——通过胚状体途径再生形成小植株 1、胚状体发育途径：小孢子经历胚发生的各个阶段，最后子叶展开，形成花粉植株。 2、愈伤组织发育途径：小孢子分裂数次形成愈伤，再分化形成花粉植株。此途径产生的植株会出现变异且倍性复杂。 四、花粉植株的形态发生方式null愈伤组织转接种到再生培养基愈伤组织分化形成再生植株部分花药产生愈伤组织接种在平板上的水稻花药水稻花药培养的愈伤化发生途径五、花药和花粉培养中的白花苗五、花药和花粉培养中的白花苗白化苗的控制白化苗的控制 花粉发育时期：花药培养中，白花苗的比例随接种时花粉发育时期的延迟而提高。 培养基成分：高浓度的2,4-D会使花粉愈伤组织分化出更多的白化苗 培养温度：当培养温度提高时，白花苗的数目也随之增加。六、单倍体植株鉴定和染色体加倍六、单倍体植株鉴定和染色体加倍单倍体植株的鉴定 1）形态学鉴定 2）染色体分析 单倍体植株的二倍化