细胞化学(外2ppt

nullnull 血液学研究所 中国医学科学院 协和医科大学 血液病医院 崔 雯 null 细胞化学(或组织化学)是组织学的一个分支，是在细胞形态学的基础上研究细胞的生物化学成分，及其定位、定量及代谢功能状态的学科。 null 经典细胞化学从1830年问 世以来已经逐步完善。经过19世纪中叶重氮染料的应用，到上世纪初已将酶的组化反应显示出来，上世纪50年代对哺乳动物和人白细胞的过氧化酶、碱性磷酸酶、酯酶、溶酶体等染色技术相继出现，并不断完善。 null 近代细胞化学则在此基础上，吸收并运用生物化学、免疫学、细胞生物学和分子生物学的基本原理与技术，从细胞分子水平研究细胞形态与功能的关系。 近年来又发展了放射自显影、免疫荧光和免疫酶标等免疫组织化学新技术。对研究核蛋白的合成、细胞动力学、细胞胞浆和膜免疫球蛋白合成、细胞分化抗原达以及白血病和淋巴瘤的免疫学分型研究中，发挥了巨大的作用。 null 随着杂交瘤技术和DNA重组技术的不断发展和应用，发展了原位杂交细胞化学，通过染色体基因定位、核酸分子原位杂交、原位聚合酶链反应，洞察单个细胞内原癌基因的激活、扩增及表达变化等，为探索癌变发生机制、肿瘤早期诊断、治疗、预后判断以及肿瘤防治展现美好前景。 影响细胞化学染色因素 影响细胞化学染色因素 标本的制备和保存 标本固定和固定剂的选择 酶作用底物特异性和选择 酶反应的最适时间、温度和pH。 抑制剂NaF、酒石酸和活性剂 Ca2+、Mg2+的选择及控制。 储备液和缓冲液的制备及保存 阳性率及阳性指数计算法 阳性率及阳性指数计算法 阳性率 观察100个需计数的细胞， 其阳性细胞的个数。 阳性指数 将计数100个细胞中的阳 性细胞，按不同强度的细胞个数乘 以相对应强度之和。 即（+）×1+（++）×2 + （+++）×3 +（++++）×4 细胞化学染色 细胞化学染色 急性白血病分型，形态学是基础，瑞氏染色准确率45.7%，细胞化学染色可将诊断提高到80%以上，国际上用MIC分型进一步提高了白血病的诊断率。而现国际上又提出WHO分型，对细胞化学提出更高要求。 髓过氧化物酶染色 （Myeloperoxidase，MPO） 髓过氧化物酶染色 （Myeloperoxidase，MPO） 血细胞所含过氧化物酶主要为髓过氧化物酶(MPO)，MPO是一类糖蛋白，相对分子质量约为150000，是人类中性粒细胞含量最多的蛋白质，约占细胞干重的3%~5%。 null 用MPO PHMPZE探针与正常 人染色体中期细胞作原位杂交 MPO基因定位在染色体 17q11～q22 为单拷贝基因 从AML原始细胞分离总RNA作Northern印迹杂交揭示有多个MPO mRNA条带。 两个主带在3.1～3.3kb区域 两个弱带在2.5kb和2.7kb区域 null 对HL60细胞系中MPO的生物合成和加工过程研究发现，有大、小亚单位各一个，对内糖苷酶敏感，无MPO活性。MPO前体还需进一步进入溶酶体，经蛋白切割后才能成熟并具有活性。这提示MPO前体转录时或转录后的加工缺陷可产生异常的MPO，使后者在早幼粒细胞发育过程中不能包装到嗜苯胺蓝颗粒中。 null 在早期原始细胞尚无颗粒时可在核膜、内质网上发现其阳性物，此时在光镜下则难以识别出来，用电镜或MPO mRNA探针作核酸分子原位杂交，可使部分细胞显示阳性。 null 临床白血病研究中方法 全长MPO cDNA作探针进 行RNA印迹法杂交；  MPO cDNA探针作反转录 聚合酶链反应(RT-PCR)； 原位杂交。 null 用MPO cDNA探针作原位杂交，证明AML表达MPO mRNA，原始粒细胞、早幼粒细胞均表达较高水平的MPOmRNA，随着粒细胞的分化成熟，逐渐下降。但在ALL都无一表达MPO mRNA，而且用分子生物学方法检测MPO mRNA要比细胞化学染色显示MPO更加灵敏。 null 髓过氧化物酶是嗜天青颗粒中一种溶酶体酶，主要存在于线粒体和溶酶体中，主要功能是破坏生物氧化过程中有巨毒的过氧化物，使其放出氧，参加细胞内氧化还原过程，是一种与生物氧化有关的重要酶类。 过氧化酶的实验方法 过氧化酶的实验方法 1958年 Washburn 复方联苯胺法 1965年 Kaplow 二盐酸联苯胺法 1985年血液学国际化委员会(ICSH) 二氨基联苯胺法（DAB染色法） 过氧化酶氨基-甲基卡巴唑染色法 二盐酸联苯胺法 联苯胺方法联苯胺方法二氨基联苯胺法 二盐酸联苯胺法 二氨基联苯胺法 二盐酸联苯胺法 ICSH规定MPO方法选择条件 ICSH规定MPO方法选择条件 酶反应基质是否容易获得 是否致癌倾向危险 反应产物的显示观察是否满意 MPO染色原理MPO染色原理 细胞颗粒中的过氧化酶，能将过氧化氢中的氧释放出来，氧化二氨基联苯胺（DAB），形成金黄色沉淀而定位于过氧化酶活性的部位。 MPO染色注意事项 MPO染色注意事项 双氧水现用现配。 反应时注意室温，及时调 节作用时间。 标本如不及时染色，要放 冰箱4℃干燥保存。 MPO正常参考结果 MPO正常参考结果 粒细胞系 原粒细胞呈阴性或弱阳性，阳性反应物为粗颗粒聚集状。自早幼粒细胞及以后各阶段中性粒细胞均为阳性反应，并随细胞成熟程度其反应渐加强，但衰老的细胞因过氧化酶活性降低而反应减弱。 嗜酸粒细胞为强阳性反应。 嗜碱粒细胞呈阴性或弱阳性反应。 null 其它细胞 成熟单核细胞、组织细 胞呈阴性或弱阳性反应； 幼红细胞、淋巴细胞、 浆细胞、巨核细胞及血小 板均为阴性反应。 nullMPO临床意义 MPO临床意义 POX主要存在于线粒体和溶酶体中，定位于中性粒细胞和单核细胞嗜天青颗粒中。 急性白血病MPO反应强弱顺序 M3>M2b>M2a>M6(粒)>M4 >M1>M5>HAL>ALL ALL和ANLL的鉴别 ALL和ANLL的鉴别 ALL MPO阴性 50年代至今有人主张MPO>3%，Haspos主张MPO>5%为ANLL，随着免疫技术的发展，检测手段增多,提示我们MPO低阳性率时，注意急性混合型白血病和M0。 急性淋巴细胞白血病MPO阴性 急性淋巴细胞白血病MPO阴性 急性混合型白血病 MPO急性混合型白血病 MPOnull急性非淋巴细胞白血病MPO特点 急性非淋巴细胞白血病MPO特点 粒系MPO 原粒细胞 阴性或弱 阳性反应(+～++) 阳性反应物颗粒 粗大，聚集。 nullnullnull 早幼粒细胞以下阶段随着细胞分化成熟而增强. 中幼粒和晚幼粒细胞阳性物充满胞浆，少部分盖在细胞核上(++～++++)。 null M2b中异常中幼粒细胞MPO呈强阳性，部分异常中幼粒细胞阳性物在细胞核的凹陷处聚集成团，呈团块状反应。 nullnullM2b包涵体MPO阳性M2b包涵体MPO阳性nullM2b MPO染色呈团块样反应M2b MPO染色呈团块样反应null 急性早幼粒细胞白血病是一种在临床、形态和细胞遗传学方面有明显特征的AML亚型。MPO呈强阳性反应（+++）～（++++）。 阳性物深棕黄色充满胞浆， 细胞外浆一般为阴性。 null 细胞遗传学分析表明M3细胞存在15和17号染色体易位，M3的MPO显著高水平提示MPO可能与这一易位相关。用MPO探针与M3患者骨髓染色体中期细胞杂交结果表明MPO基因从17号染色体转位至15号染色体，t(15;17) 其断裂点位于17q11.2，并且部分M3患者存在MPO基因分子水平重排，表明MPO基因转位、重排和形成断裂点对M3亚型的形成具有发病学意义。 nullnull 嗜酸粒细胞MPO呈强阳性，对花青苷不敏感。 嗜碱性粒细胞阴性或弱阳性 嗜酸粒细胞MPO呈强阳性，对花青苷不敏感。 嗜碱性粒细胞阴性或弱阳性 ANLL中Auer小体MPO 可呈阳性 ANLL中Auer小体MPO 可呈阳性 单核系MPO单核系MPO 原始单核细胞 溶解度很小，缺乏MPO活性，阴性或 弱阳性。 幼稚单核细胞 阴性或弱阳性反应。阳性反应物颗粒 细小,散在分布于细胞浆与细胞核上。 nullnullnullM4MPO染色 M4MPO染色 null过氧化酶缺乏过氧化酶缺乏 有些粒细胞白血病表现过氧化酶缺乏。Nielsen等报道AML患者出现严重感染时中性粒细胞会出现MPO缺乏。有个别M3也表现出（-），可能由于在转录过程中出现异常。如还有一部分呈现强阳性，这提示MPO基因的表达并不完全丧失，可能是由于部分转录（transcribed）或产生了不稳定的无效RNA所致。 过氧化酶缺乏过氧化酶缺乏原始及幼稚巨核细胞和浆细胞MPO阴性原始及幼稚巨核细胞和浆细胞MPO阴性null高雪氏细胞阴性 尼门匹克细胞阴性 组织嗜碱细胞阴性 海兰细胞阴性或 阳性 网状细胞MPO阴性或阳性 网状细胞MPO阴性或阳性 原红及幼红细胞MPO呈阴性，AL时偶见弱阳性反应。 原红及幼红细胞MPO呈阴性，AL时偶见弱阳性反应。 苏丹黑B染色法 （sudan black）苏丹黑B染色法 （sudan black） 脂类包括中性脂肪和类脂(磷脂、糖脂和胆固醇等)，脂类不仅在体内贮存热量和供给热量，而且构成细胞各种质膜的重要成分。脂蛋白构成细胞的各种质膜,与细胞的生理功能有密切关系。 null 苏丹黑染料是脂溶性燃料，能溶解于脂类，将组织细胞内的脂类显示出来。显示脂类的染色方法有多种，以苏丹黑B最为常用，因在苏丹染料中，苏丹黑B的染色力最强，它不仅可显示大的脂肪滴,还可以显示微细结构中的隐性脂类,不受标本陈旧的影响。 SBB染色原理SBB染色原理 苏丹黑B可溶解于细胞质内的含脂结构，将胞质中的中性脂肪、磷脂及胆固醇等脂类染色呈棕黑色或深黑色颗粒，定位于胞质中。 null 此染色机制不完全清楚， 有些根据血细胞苏丹黑染色 特殊性，提示苏丹黑显示血细胞 中脂类的原理，它不是一般的物 理溶解现象，而是细胞化学结合 的结果，但多数学者认为是细胞 内的脂类物质与苏丹黑B染料非 化学性结合。 SBB染色实验方法 SBB染色实验方法 SBB染色正常参考结果 SBB染色正常参考结果 粒系原粒细胞为阴性或弱阳性反应。自早幼粒细胞以后各阶段中性粒细胞均呈阳性 反应，且随细胞成熟程度阳性反应逐渐增强。 嗜酸粒细胞为嗜酸颗粒边缘深染而中央为蛋白质淡染或粗大圆球状棕黑色阳性反应。 嗜碱粒细胞呈阴性或弱阳性反应，颗粒大小不一，大的具有嗜苏丹黑壳及核心。 null单核细胞、网状细胞 阴性或弱阳性； 幼红细胞、淋巴细胞、 巨核细胞以及血小板 阴性。 nullSBB染色的临床意义SBB染色的临床意义 SBB与MPO临床意义及反 应顺序基本一致： M3>M2b>M2a>M6（粒） >M4>M1>M5>HAL>ALL ALL与ANLL的鉴别 ALL与ANLL的鉴别 急淋：各阶段淋巴细胞SBB均呈阴性反应。但国内外均有报道ALL SBB染色可见阳性，1984年Stass SA报道350例ALL有6例阳性，占1.6%，4例L1、2例L2，SBB阳性率>5%，最高64%，而POX和CE均为阴性。 ALL SBB(-) ALL SBB(+) ALL SBB(-) ALL SBB(+) null  SBB除染初级颗粒外，还能染不同的脂类，包括中性脂肪、磷脂和胆固醇。白血病细胞内脂类代谢异常可导致SBB阳性。 这些病例可能代表淋巴系和髓系混合白血病，但可能性小，认为SBB阳性ALL是ALL的一个特殊的细胞化学亚类，并对治疗发生良好反应。 null 我院观察329例ALL，阳性15例，占4.6%，阳性率低，阳性反应物很弱，颗粒细 小,可能是线粒体磷脂。 ANLL SBB多表现阳性。 ANLL SBB染色 ANLL SBB染色 原始粒细胞SBB染色阴性，分化较好原始粒细胞在核周Golgi器开始出现弱阳性反应，阳性物颗粒粗大，聚集，浓缩； 早幼粒及以下阶段粒细胞SBB为阳性，阳性强度（++～++++）。 nullnullnullnull M2b中部分分化不好 的异常中幼粒细胞SBB 在细胞核的凹陷处，呈 团块状反应；发育好的 异常中幼粒细胞阳性物 充满胞浆，呈强阳性反应。 nullnull APL异常早幼粒细胞SBB反应最强，强度为（+++）～（++++）。 嗜酸细胞和嗜碱细胞 SBB染色嗜酸细胞和嗜碱细胞 SBB染色nullnull 原、幼单核细胞SBB 阴性或弱阳性 阳性物颗粒细小，散在分布于细胞浆与 细胞核上。 nullM4 SBB染色M4 SBB染色ANLL细胞内的Auer小体 表现强的嗜苏丹黑B染色。 ANLL细胞内的Auer小体 表现强的嗜苏丹黑B染色。 浆细胞和原始及幼稚巨核细胞SBB 阴性 浆细胞和原始及幼稚巨核细胞SBB 阴性 网状细胞SBB阴性或弱阳性 网状细胞SBB阴性或弱阳性 海兰细胞SBB阴性或阳性 高雪氏细胞 尼门匹克氏细胞SBB阴性 海兰细胞SBB阴性或阳性 高雪氏细胞 尼门匹克氏细胞SBB阴性 早期红细胞在AL时 SBB可见阳性 早期红细胞在AL时 SBB可见阳性 MPO与SBB染色比较 MPO与SBB染色比较 我们通过对203例病例总结，发现在ANLL中，二者反应强弱顺序是平行的。 SBB比MPO出现的早，反应强，但作用时间长，染色液渣子多，特别是在ALL中可见阳性与M1较难鉴别。 MPO作用时间短，操作简单，背景干净，酶无扩散，易于辨认，特异性强，MPO底物有致癌作用,可用一些联苯胺的衍生物或其它类药物代替以减少毒性。 MPO染色 SBB染色 MPO染色 SBB染色 酯酶(Esterase) 酯酶(Esterase) 酯酶属于水解酶，水解羧酸酯。是一组在不同pH条件下，水解各种脂肪族或芳香族酯类的酶，根据酯酶存在的细胞类型、催化底物和pH不同等。分成特异性酯酶和非特异性酯酶两大类。水解短链脂肪酸酯为非特异性酯酶，萘AS-D氯乙酸盐作底物称为特异性酯酶。酯酶染色法在粒细胞，单核细胞、粒-单核细胞和淋巴细胞白血病等的诊断和分型方面有重要意义。 null 1973年Li把人的WBC分离成无细胞的液体，在pH6.3-7.4，用聚丙烯酰胺凝胶电泳证明人血细胞含有九种酯酶同工酶，而不同的血细胞所含同工酶亦不相同。 粒细胞系 1，2，7，8，9 淋巴细胞 1，6 单核细胞系 血小板 4，5，3，6 毛细胞 5 null α-醋酸萘酯 丁酸萘酯 氯醋酸AS-D 4，5 较强 强 +／- 1，2 +／- -/+ 强 单核细胞α-醋酸萘酯 氯醋酸AS-D 单核细胞α-醋酸萘酯 氯醋酸AS-D 粒细胞α-醋酸萘酯 氯醋酸AS-D粒细胞α-醋酸萘酯 氯醋酸AS-Dnull 各种酯酶的交叉反应有一定的物质基础，在单核细胞中发现CE的几条电泳带，而在中性粒细胞中，则能发现几条抗NaF的NSE电泳带，正确掌握实验条件能减少各种酯酶的交叉反应，增加细胞化学染色的特异性。 Li把酯酶分成三大类 Li把酯酶分成三大类 非特异性酯酶 中性非特异性酯酶 α-醋酸萘酯酶 (Alpha-naphthol acltate esterase) 醋酸萘酯AS-D酯酶 (Naphthol AS-D acltate asterase) 醋酸萘酚AS酯酶 (Naphthol AS acltase)  酸性非特异性酯酶 α-醋酸萘酯酶 α-丁酸萘酯酶 (Alpha-Naphthol butynate asterase) null 碱性非特异性酯酶 α-丁酸萘酯酶 特异性酯酶 氯乙酸萘酚AS-D酯酶 (Naphthol AS-D chloroacetate esterase) 氨基乙酸   特异性酯酶 naphthol AS-D chloroacetate esterase， SPE，CE 特异性酯酶 naphthol AS-D chloroacetate esterase， SPE，CE CE通常被看成是粒细胞及肥大细胞的标志酶，分布局限，很多报道都强调了它对粒细胞有较强的特异性。 null 1953年Gomori首先证明了中性粒细胞含有SPE，Molong从Gomori用萘酚AS-D醋酸作酯酶染色的底物，中性粒细胞能显示强阳性的报告中得到启发，与1960年和Bustone等探讨了SPE染色原理，并比较了多种合成萘酚AS-D氯乙酸酯的反应强度和酶抑制的效果，合成新的底物，提出此酶主要存在于粒系统里，在粒系白血病，原始粒细胞为强阳性反应,但成熟粒细胞的酶反应下降.国外1960年开始应用与临床。 nullCE染色实验临床应用 CE染色实验临床应用 国外1960年 Moloney 固紫酱法 1971年 Yam 付品红 1975年 Leden stull 付品红pH6.3 国内1982年 特异性酯酶染色方法介绍 特异性酯酶染色方法介绍 国际血细胞标准化委员会1985年 固紫酱GBC法 (Fast garnert GBC salt) 新品红方法 (New Funchisn ) CE固紫酱GBC法 坚牢蓝BB法 CE固紫酱GBC法 坚牢蓝BB法 CE副品红方法 CE副品红方法 CE染色原理CE染色原理 细胞内的氯乙酸萘酚酯酶，在作用液中可以将氯乙酸AS-D萘酚进行水解，释放氯乙酸AS-D与重氮盐偶联产生不溶性有色沉淀，定位于胞质内。 CE染色正常参考结果 CE染色正常参考结果 粒系 原粒细胞呈阴性反应，少数分化好的早幼粒细胞至成熟中性粒细胞呈阳性反应。 嗜酸粒细胞呈阴性或弱阳性反应。 嗜碱粒细胞呈阴性反应。 nullnull单核细胞呈阴性或弱阳性反 应。 淋巴细胞、浆细胞、幼红细 胞、巨核细胞和血小板均 呈阴性反应。 组织嗜碱细胞呈强阳性反应。 特异性酯酶染色的临床意义特异性酯酶染色的临床意义 我们总结203例急性白血病， 其阳性率强弱的排列顺序为： M3>M2b>M5>M2a>M4 >M6（粒）>Ml>ALL null粒系 原始及早幼粒 细胞一般阴性， 少部分可见弱 阳性反应(+～ ++)。 null 自中幼粒阶段后反应 较强，阳性物充满胞浆， 反应强度为(+++～ ++++)。部分M2b在细胞 核的凹陷处呈团块状反应。 null异常早幼粒细胞M3呈强阳性反应。易见柴束样结晶。 异常早幼粒细胞M3呈强阳性反应。易见柴束样结晶。 null 嗜碱粒细胞阴性 个别弱阳性。 嗜酸粒细胞阴性 或弱阳性。 单核细胞：阴性或弱阳性反应(+～++)，阳性物为颗粒状散状分布。 单核细胞：阴性或弱阳性反应(+～++)，阳性物为颗粒状散状分布。 ALL CE染色阴性 ALL CE染色阴性 NK细胞CE呈阳性 NK细胞CE呈阳性 T型－NHL BMT型－NHL BMT型－NHL CET型－NHL CE浆细胞CE 阴性个别可见阳性 浆细胞CE 阴性个别可见阳性 巨核细胞、高雪细胞和尼门匹克细胞CE阴性 巨核细胞、高雪细胞和尼门匹克细胞CE阴性 海蓝细胞CE阴性或弱阳性。 海蓝细胞CE阴性或弱阳性。 组织嗜碱细胞CE强阳性 组织嗜碱细胞CE强阳性 组织嗜碱细胞甲苯胺蓝染色组织嗜碱细胞甲苯胺蓝染色特异性酯酶染色鉴别意义 特异性酯酶染色鉴别意义 MPO+ SBB + CE + ＞50% M2b MPO+ SBB+ CE +/-＜50% M2a MPO - SBB- CE+ M5b M2a 和M3b鉴别 M2a CE (-)； M3b CE (+) M2a MPO+ CE +/- M2a MPO+ CE +/- M2b MPO+ CE + M2b MPO+ CE + M5b MPO - CE + M5b MPO - CE + M2a CE (+-) M3b CE(+) M2a CE (+-) M3b CE(+) MPO SBB SPE三种染色比较 MPO SBB SPE三种染色比较 ●SBB出现的早，反应强，其次是MPO，存在于嗜天青颗粒里。CE出现最晚，它存在于特异性颗粒里。 ●CE对M1、M2a早期粒细胞(原+早)的检出率，不如MP0、SBB。 ●CE在M5b时比相应MPO阳性率高，比M1、M2a的CE高。 ●CE在M3、M2b染色时，阳性率、阳性指数与MP0、SBB相平行。 非特异性酯酶 (Non-Specific Esterase) 非特异性酯酶 (Non-Specific Esterase) 非特异性酯酶是一组在酸性、中性和碱性pH条件下，水解各种短链脂肪酸酯或芳香族酯的酶。几乎存在于所有血细胞，包括巨核细胞、浆细胞，甚至上皮细胞的溶酶体内。该酶是单核细胞、巨噬细胞的标志酶,分布较广泛。 null底物：α-醋酸萘酚酯酶 (α-Naphthyl acetate esterase, α-NAE) 萘酚AS醋酸酯酶 (Naphthyl AS acetate esterase, NASAE) 萘酚AS-D醋酸酯酶 (Naphthyl AS-D acetate esterase, NAS-DAE) α-丁酸萘酚酯酶 (α-Naphthyl Batyrate esterase, α- NBE) 重氮盐 坚牢蓝B 固蓝BB 六偶氮付品红 α-醋酸萘酚酯酶 α-丁酸萘酚酯酶 α-醋酸萘酚酯酶 α-丁酸萘酚酯酶 萘酚AS-D醋酸酯酶（固兰BB法） 萘酚AS-D醋酸酯酶（固兰BB法） null 1990年国内外对NBE和NAE同时做底物，进行分析比较，发现前者敏感性逊于后者，而特异性高于后者。Li也提出增加鉴定单核细胞的特异性，可用α-丁酸萘酚代替α-醋酸萘酚，β-萘酚化合物的呈色性和产物的稳定性不如相应的α-萘酚化合物，两者的差异只是-OH连接位置不同。 null 不加NaF积分值-加NaF积分值 NaF抑制率 = —————————————— × 100％ 不加NaF积分值 抑制率大于50％为抑制，NaF 用量15mg／10m1作用液。 血液学标准化委员会推荐的非特异性酯酶染色方法 丁酸盐反应 萘AS-D醋酸盐固兰BB法 血液学标准化委员会推荐的非特异性酯酶染色方法 丁酸盐反应 萘AS-D醋酸盐固兰BB法 中性非特异性酯酶 (NSE NAE NASE) 中性非特异性酯酶 (NSE NAE NASE) α-萘酚醋酸酯酶 α-Naphthol acetate esterase，α-NAE 原理:在中性条件下，酯酶将醋酸萘酚水解，产生萘酚，在与重氮盐偶联，产生不溶性的有色沉淀。 NSE酶型 NAE颗粒型 NSE酶型 NAE颗粒型 NAE局灶型 NAE局灶型 NAE弥散型 NAE弥散型 中性非特异性酯酶正常参考结果 中性非特异性酯酶正常参考结果 粒细胞系 各阶段粒细胞均为阴性或弱阳性 反应，随细胞成熟阳性减弱呈阴 性，不被氟化钠抑制。 单核细胞 阳性反应较强,能被氟化钠抑制。 null 其它细胞 成熟淋巴细胞部分呈阳性反应，阳性物多表现为颗粒状，不被氟化钠抑制； 巨核细胞和血小板呈强阳性反应； 早期幼红细胞可呈阳性反应，随幼红细胞的成熟阳性反应逐渐减弱，不被氟化钠抑制。 NAE正常参考结果NAE正常参考结果 中性非特异性酯酶染色临床意义 中性非特异性酯酶染色临床意义 是单核细胞和巨噬 细胞的标志酶 单核细胞NAE 单核细胞NAE 原始单核细胞NAE 多呈阳性，少部分为阴性。 大部分阳性细胞呈局灶型或颗粒型反应。 幼稚单核细胞NAE 阴性、弱阳性和强阳性。 阳性物颜色鲜艳呈细小颗粒弥散状， 加NaF后阳性率及指数明显降低或阴性。 M5aNAE染色M5aNAE染色M5aNAE染色M5aNAE染色M5bNAE染色M5bNAE染色M5bNAE染色M5bNAE染色M5NAE+NaF染色M5NAE+NaF染色粒系NAE染色粒系NAE染色原始及早幼粒细胞阴性或弱阳性反应. 酶型多为弥散型、局灶型，少数可呈 颗粒状。  M3部分可呈强阳性反应，阳性物弥散 型分不清颗粒。不被NaF抑制。 中幼粒细胞阴性或中等强度阳性，部 分M2b可呈团块样反应，较强。可被 NaF抑制。 M2aNAE染色M2aNAE染色M3NAE染色M3NAE染色M2bNAE染色M2bNAE染色M4NAE染色M4NAE染色null 浆细胞 部分呈强阳性。 阳性物为数个 较大、较强的 颗粒聚集。 部分被NaF抑制。淋巴细胞NAE染色 淋巴细胞NAE染色 阴性或阳性，阳性物可呈颗 粒型或局灶型，在pH5.0条 件下，T-淋巴细胞NSE活性 显示更为充分。 有利于ALL和ANLL的鉴别。 ALL NAE染色ALL NAE染色CLL NSE 颗粒状 CLL NSE 颗粒状 巨核细胞NAE染色巨核细胞NAE染色阳性较强，可表现弥散型 和颗粒型。易被NaF抑制， α-丁酸萘酚（-）。 幼稚巨核细胞NSE染色 幼稚巨核细胞NSE染色 null巨核细胞NAE染色巨核细胞NAE染色 有核红细胞NSE可呈阳性 有核红细胞NSE可呈阳性 null 网状细胞、高雪、海兰等一些非造血细胞为强阳性反应且不被NaF抑制。 nullα-丁酸萘酚酯酶染色 (alpha—naphthyl butyrate esterase，α-NBE) α-丁酸萘酚酯酶染色 (alpha—naphthyl butyrate esterase，α-NBE) 原理 血细胞中的α-丁酸萘酚酯酶在pH碱性环境下，能将基质液中的α-丁酸萘酚水解产生α-萘酚，再与重氮盐偶联形成不溶性沉淀，定位于胞质内。 null α-丁酸萘酚酯酶染色对单核细 胞特异性较NAE强，但灵敏度差。 对鉴别单核细胞和巨核细胞有重要 意义。 α-醋酸萘酚酯酶 α-丁酸萘酚酯酶 单核细胞 强+ 强+ 巨核细胞 强+ -过碘酸 - 雪夫反应 periodic acid-schiff，PAS 又名糖原染色 过碘酸 - 雪夫反应 periodic acid-schiff，PAS 又名糖原染色 糖原是人类的一种重要的贮存糖，如见于肝细胞内的。它是产生能量的重要物质，在化学上糖原是D-葡萄糖分子组成的聚合体，对急性AL的分型及MDS，AA，高雪等诊断都有着重要意义。 过碘酸-雪夫反应原理 过碘酸-雪夫反应原理 过碘酸-碱性品红中的过碘酸是氧化剂，可以打开多糖乙二醇基，把-CHOH.CHOH变成-CHO和-CHO，或把多糖中的CHOH-CO变成CHOCO此新生的醛基与无色碱性品红染液（schiff）结合成紫色染料，其反应颜色的深浅于细胞内乙二醇基的含量成正比。 PAS染色阳性结果 PAS染色阳性结果 阳性结果为胞质内出现粉 红色物质，细胞核为蓝色。 颗粒状 片状 珠状 块状 nullnull 阳性物分布 细颗粒弥散状 阳性物分布 细颗粒弥散状 PAS为裙边样反应 PAS为裙边样反应 PAS呈淡粉色PAS呈淡粉色细颗粒弥散状基础上可见小珠 细颗粒弥散状基础上可见小珠 中粗颗粒、粗颗粒散在分布。 中粗颗粒、粗颗粒散在分布。 PAS珠状、块状呈冠状。 PAS珠状、块状呈冠状。 PAS正常参考结果 PAS正常参考结果 粒细胞系 原粒细胞多呈弱阳性反应，少部分可见阴性。自早幼粒细胞以后随细胞的成熟程度阳性反应逐渐增强，至成熟阶段阳性最强。 嗜酸粒细胞颗粒本身不着色，但颗粒间的胞浆呈弥漫粉红色； 嗜碱粒细胞为阳性，反应物呈粗颗粒、珠状和块状。 nullnullnull 淋巴细胞系 大多数淋巴细胞呈阴性反应，少 数胞质内有少量红色颗粒。 B淋巴细胞PAS正常值为 阳性率:20% 阳性指数:30 红细胞系 幼红细胞和成熟红细胞均呈阴性 反应。 null 巨核细胞系和血小板 阴性或阳性 阳性物呈珠状或块状 成熟巨核细胞阳性指数 正常值：107.4±13.8 nullnull 单核细胞呈阳性反应，阳性反应物为细颗粒弥散状、中粗颗粒往往位于胞浆边缘； 浆细胞大多呈阴性，少数为红色颗粒； 组织细胞为阳性或阴性反应； 巨噬细胞可呈细颗粒的阳性反应. nullPAS染色临床意义 PAS染色临床意义 急性白血病类型的鉴别 原幼淋细胞 阴性或阳性，阳性反应物呈细颗 粒、中粗颗粒和粗颗粒散在分布； 珠状和块状一个至数个成冠。 成熟淋巴细胞 细颗粒、中粗颗粒、粗颗粒散在分布。 ALL PAS(-/+) ALL PAS(-/+) null ALLPAS中粗、粗颗粒散在分布。 ALLPAS中粗、粗颗粒散在分布。 ALL PAS粗颗粒 ALL PAS粗颗粒 ALL PAS粗颗粒小珠 ALL PAS粗颗粒小珠 nullnullnull成熟淋巴细胞PAS 细颗粒、中粗颗粒和粗颗粒。成熟淋巴细胞PAS 细颗粒、中粗颗粒和粗颗粒。null 非霍奇金淋巴瘤 （NHL）PAS 阴性或阳性反应， 阳性反应物为中粗 颗粒、粗颗粒散在 分布；Reed- Sternberg细胞则 为弱阳性或阴性反 应。 null原粒及早幼 粒细胞呈阴 性或弱阳性， 阳性反应物 为细颗粒弥 散状。 M2b PAS细颗粒弥散状 M2b PAS细颗粒弥散状 异常早幼粒细胞的PAS异常早幼粒细胞的PAS 强阳性 阳性反应物为密集的细颗粒弥散状，胞浆边缘及外浆处多分布粗大颗粒； 部分易见柴束状结晶； 少数病例在细颗粒弥散状基础上可见1~2个小珠。 nullnullnullnullnull嗜碱粒细胞PAS为强阳性， 阳性物多表现粗颗粒、珠状、块状。嗜碱粒细胞PAS为强阳性， 阳性物多表现粗颗粒、珠状、块状。nullM4EO异常嗜酸粒细胞PAS 可见深粉红色小珠 M4EO异常嗜酸粒细胞PAS 可见深粉红色小珠 原、幼单核细胞PAS染色原、幼单核细胞PAS染色 阳性较粒细胞强 细、中粗颗粒弥散状分布， 边缘及外浆处可见粗颗粒。 部分在细颗粒基础上可见小 珠； 少数呈裙边样反应。 nullnullnullnullnullnull 微分化型AL （M0） PAS可为细颗粒、中粗颗粒散在分布；部分在此基础上可见小珠。 nullnullANLL Auer小体PAS阳性 ANLL Auer小体PAS阳性 原始巨核细胞PAS原始巨核细胞PAS 阴性或阳性反应 中粗颗粒、粗颗粒散在分布。 部分可见小珠或块状。 小巨核细胞PAS 呈细小颗粒弥散状，边缘处 为粗颗粒及小珠。 nullnullnullnullnullnullnullAHL PAS部分细胞呈细颗粒 弥散状，部分细胞呈粗颗粒、珠状。   AHL PAS部分细胞呈细颗粒 弥散状，部分细胞呈粗颗粒、珠状。   null戈-谢细胞呈强阳性反应 戈-谢细胞呈强阳性反应 尼曼-匹克细胞PAS染色为阴性或弱阳性，空泡中心阴性。 尼曼-匹克细胞PAS染色为阴性或弱阳性，空泡中心阴性。 浆细胞PAS阴性或弱阳性， 阳性物呈淡粉色，偶见小珠。 浆细胞PAS阴性或弱阳性， 阳性物呈淡粉色，偶见小珠。 骨髓内转移的腺癌细胞PAS 强阳性反应，表现为红色颗粒或块状。 骨髓内转移的腺癌细胞PAS 强阳性反应，表现为红色颗粒或块状。 组织嗜碱细胞PAS强阳性， 细颗粒弥散状，部分可见大粗颗粒。 组织嗜碱细胞PAS强阳性， 细颗粒弥散状，部分可见大粗颗粒。 海蓝细胞PAS 海蓝细胞PAS 红细胞系统 红细胞系统 阴性： 正常人和再障。 阴性：正常红细胞、AA、CLL 弱阳性：巨幼贫、溶血性贫血 强阳性：红白血病及各类急性白 血病的幼红细胞、MDS、 IDA、 和重型地中海贫血。 有核红细胞PAS反应物酶型有核红细胞PAS反应物酶型 原、早红细胞为大粗颗粒、 珠、块状。 中、晚幼红细胞为细颗粒 弥散状分布， 成熟红细胞有时亦可为阳 性。 IDA PAS IDA PAS MDS PAS染色MDS PAS染色M6 PAS 染色M6 PAS 染色null 酸性磷酸酶染色法(ACP) 酸性磷酸酶染色法(ACP) 酸性磷酸酶是一组能在酸性pH条件下，水解磷酸酯的酶，它定位于溶酶体中，并被认为是这些细胞器的标志酶，溶酶体外的ACP一般与膜结合，对L+酒石酸不敏感，溶酶体内的ACP跳动快，对热稳定，对L+酒石酸敏感。在大部分有核血细胞的胞浆里均存在酶活性，在临床血液学上，酸性磷酸酶反应对诊断HCL，鉴别T-细胞型和非T细胞型淋巴增生有重要意义。 国际血液学标准委员会推荐的酸性磷酸酶染色法国际血液学标准委员会推荐的酸性磷酸酶染色法固紫酱GBC (Fast Gamet GBC method) 固红ITR (Fast Red ITR method) 副品红方法 (parosanilche method) nullACP染色正常参考结果 ACP染色正常参考结果 粒细胞系 各阶段粒细胞ACP染色 呈弱阳性或中度阳性。 单核细胞 强弱不等的阳性反应。 淋巴细胞 阴性或弱阳性反应。 红细胞系 部分幼红细胞ACP为阳 性反应。 浆细胞和巨核细胞ACP为强阳性。 nullnull 酸性磷酸酶染色临床意义 酸性磷酸酶染色临床意义 酸性磷酸酶存在于许多造血细胞的溶酶体中，如粒细胞、T淋巴细胞、浆细胞，单核细胞、巨核细胞、有核红细胞和吞噬系统。酸性磷酸酶是一组同功酶，用聚丙烯酰胺凝胶电泳证明，人类白细胞的酸性磷酸酶中，共有7种同功酶。同功酶5具有独特的抗酒石酸的功能，是HCL所特有的。 null 同功酶 0 高雪 单核 巨噬细胞 1.2. 4 中性粒细胞 1. 4 单核细胞 3b 各型Al的原始细胞内 3 淋巴细胞 5 毛细胞 也有提示高雪和巨噬细胞。 毛细胞白血病的诊断 毛细胞白血病的诊断 HCL ACP呈阳性反应，阳性为中等强度或强阳性反应，并具有抗L（+）-酒石酸的功能。 1972年M观察22例HCL发现75-95％病例呈强阳性反应；还观察318例病例，发现何杰金氏病，上皮样细胞有比较强的阳性，反应++-+++。传单中异淋(-)或弱阳性。有人观察24例毛白，有23例阳性。 null 据我们观察8例HCL，7例ACP阳性，有4例阳性率>60％，3例阳性强度可见++++。TRAP后6例为阳性。2例仍可见++++。HCL平均阳性率56％，比欧美报道98％低，与日本报道52％相同。有人认为TRAP中只要有一个++++可诊断HCL。 nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull 在我们总结622例不同类 型AL中，发现6例病种 23例 具有抗酒石酸的功能， 有NHL、 B-CLL、T-ALL、 AHL、 GALL、CML急淋变。 国外也 有人报道一些恶性淋巴性疾病 也具有抗酒石酸的功能。 CLL 骨髓瑞氏染色CLL 骨髓瑞氏染色CLL ACP CLL ACP CLL TRAP CLL TRAP NHL 骨髓瑞氏染色NHL 骨髓瑞氏染色nullnullnullNHL 骨髓瑞氏染色NHL 骨髓瑞氏染色nullnullT型-NHL BMT型-NHL BMT型-NHL ACPT型-NHL ACPT型-NHL TRAPT型-NHL TRAPM5 BMM5 BMM5 ACPM5 ACPM5 TRAPM5 TRAP ACP对T-ALL和B-ALL有鉴别意义 ACP对T-ALL和B-ALL有鉴别意义 在人体发育中，T淋巴细胞的酸性磷酸酶出现在发育早期阶段的即胸腺细胞，并持续到成熟。定位于Coigi器中，所以大多数急性和慢性T淋巴细胞增生疾病都表现ACP活性，阳性物多呈颗粒型，少数可为阴性，T-ALL反应最强，B淋巴细胞增生的ACP反应弱阳性或阴性。 ACP阳性率 ＞50％ T-ALL < 50％ B-ALL T-ALL ACP T-ALL ACP B-ALL ACPB-ALL ACPnullACP ALL和ANLL的鉴别 ACP ALL和ANLL的鉴别 ALL多为颗粒型 ANLL以单核细胞表现最强，粒系M3最强，部分早幼粒细胞也可见强阳性，阳性物呈弥散状分布。 nullnullnullnull网状细胞呈强阳性反应 网状细胞呈强阳性反应 网状细胞TRAP 阳性网状细胞TRAP 阳性巨核细胞，血小板呈 较强的阳性反应。 巨核细胞，血小板呈 较强的阳性反应。 null 红细胞 ACP 红细胞 ACP null 浆细胞ACP 较强的阳性反 应。 阳性物为大粗颗粒和小珠散在分布于细胞浆内。 高雪和尼门匹克细胞ACP鉴别 高雪和尼门匹克细胞ACP鉴别 高雪氏细胞 强阳性 尼曼-匹克细胞 阴性或弱阳性 海蓝细胞ACP 海蓝细胞ACP 转移瘤细胞ACP强阳性 转移瘤细胞ACP强阳性 谢 谢谢 谢