基因芯片

基因芯片 基因芯片的应用 陈景辉 20070052 生物技术系，农学与生物技术学院，云南农业大学，昆明 5230231 摘要：基因芯片技术的诞生是基于人类基因组计划的成果，是融微电子学、生物学、物理学 、 化学、计算机科学为一体的新技术。基因芯片技术本质是生物信号的平行分析，它利用核酸分子杂交原理，通过荧光标记技术检测杂交亲和与否，再经过计算机分析处理可迅速获得所需信息。由于其具有高通量、微型化、连续化、自动化、快速和准确等特点，已引起国际国内广泛的关注和重视，在许多领域得到了广泛的应用。本文综述了基因芯片的技术、分类、制作方法以及在植物、微生物上的应用。 关键词：基因芯片技术、植物、细菌、应用 基因芯片( gene chip) 是生物芯片 (Bio chip)的一种，又称 DNA芯片( DNA chip)、 DNA微阵列(DNA microray) ，是生物芯片技术中发展最成熟以及最先进入应用和实现商品化的领域。基因芯片技术(gene chip technology)是随着人类基因组计划(human genome project, HGP)的进展而发展起来的具有广阔应用前景的生物技术之一。自1995年S c h e n a等在《Nature》上首次发表基因芯片研究的论文以来，短短十几年时间，该技术已显示出了巨大的商业价值受到科技界及各大企业的关注，目前已广泛应用于基因表达谱、疾病诊断、药物筛选、遗传作图、基因突变等方面的研究。 1基因芯片技术 1.1基因芯片技术的原理和特点 基因芯片技术是建立在基因探针和杂交测序技术上的一种高效快速的核酸序列分析手段。其原理是将数以万计的D NA探针片段有序地固化于支持物表面上，或者通过原位合成技术合成到玻片上，产生二维 D N A探针阵列，然后将待测样品中的 DN A、RNA或 c DN A用同位素或荧光物质标记后。与玻片上的探针进行分子杂交。通过计算机对每个探针上的杂交信号作检测、分析，从而反映出材料中大量基因的信息。是一种进行DNA 序列分析及基因表达信息分析的强有力工具基因芯片技术。 基因芯片技术特点的核心是微型化，芯片每平方厘米固体表面上可固定10个 D N A片段、数万个基因。 一次分析可得到数万个基因的表达信息。 微型化的另一方面是样品用量与试剂用量的微量化， 用纳克级的mR NA、微升级的杂交液就能分析成千上万个基因的表达信息。这些都是其它研究技术所无法比拟的。 芯片制作及分析过程易于自动化。芯片制作可实现 自动化，可根据要求将需要分析的基因制作成符合要求的芯片； 杂交、洗片等过程都可实现自动化， 工作效率大幅提高。 1.2基因芯片的分类 依据不同的分类方法大致可分以下几种： （1）根据探针载体基质不同分为无机片基基因芯片和有机片基基因芯片。前者指其基质基片是无机物，如：载玻片、硅片等；后者是指其基质基片是有机物如纤维素、聚丙烯/尼龙膜等。 （2）按点样方式根据芯片点样方式不同，可分为原位合成芯片、矩阵芯片、电定位芯片三类。 ( 3 ) 按芯片使用功能分类生物芯片因功能和用途不同可分为测序芯片、表达谱芯片和基因差异表达分析芯片等。 1.3基因芯片的制作方法 基因芯片的制作方法有多种： ( 1 ) 原位合成法： 此技术是将半导体中的光蚀刻技术运用到DNA的化学合成中， 在固相载体上原位合成寡聚核苷酸，每一次循环都有特定的核苷酸加到特定的位点上，每一个寡核苷酸片段代表了一种特定的基因，存在于DN A芯片的特定位置上。但是此种方法合成的芯片成本高，制备繁琐、耗时。 ( 2 ) 微矩阵法：是将P C R得到的c DN A、寡核苷酸片段等用喷点或针点的方式直接排列于固相介质上。此方法制作的芯片成本低，易操作，点样密度高，可以对一个样品同时进行多方面的检测。因此，此种类型的芯片更容易被接受和推广。 ( 3 ) 电定位方法：是利用静电吸附原理将DNA快速定位在介质上。这种方法制作工艺复杂，点样密度低，推广还有一定难度。 2基因芯片在植物研究中的应用 基因芯片技术在植物研究中广泛应用于特异性相关基因和新基因的检测、基因表达水平检测、基因突变及多态性分析等。 2.1特异性相关基因和新基因的检测 应用基因芯片技术，对比每一个测定基因和已知基因，即可进行新基因的寻找和表达的监测。Ah a r o n i 等从草莓中分离了1701个c D NA片段，与480个矮牵牛植物克隆作为对照，构建成微阵列芯片来研究草莓果的不同成熟时期果色与成熟度的关系，以此方法发现并证实了有两个基因是新基因， 其中之一是草莓乙酰基转移酶基因。在成熟的草莓中， 此酶在特殊化合物的合成过程中有很重要作用，同时多种水果中都有这种酶的存在。Aharoni还发现红色果实比白色果实SAAT的表达活性高。 2.2基因表达水平的检测 植物生长发育是一个十分复杂的过程，涉及到众多基因的表达、调节、控制。以往的研究局限于某一种或某一类基因的行为和功能，不能监测该基因或该类基因与其他基因的互作， 无法从整个基因组水平进行研究。利用基因芯片技术进行的表达水平检测可自动、快速地检测出成千上万个基因的表达情况，进而推断基因的功能，这有助于加快植物生长发育机理的研究。Schena等采用拟南芥基因组内共45个基因的cDNA微阵列( 其中14个为完全序列，31个为E S T ) ，检测该植物的根、叶组织内这些基因的表达水平，用不同颜色的荧光素标记逆转录产物后分别与该微阵列杂交，经激光共聚焦显微扫描，发现该植物根和叶组织中存在26个基因的表达差异，而参与叶绿素合成的CAB1基因在叶组织较根组织表达高500倍。 2.3突变性和多态性检测 将基因芯片技术用于检测分子突变，不仅可准确地确定突变位点和突变类型，更主要的是它的快速高效是目前所用的其他方法无法比拟的。 基因芯片可以同时检测多个基因乃至整个基因组的突变，还可研究基因（组）的多态性，这将大大促进植物育种科学的发展并促进植物新品种的产生。尽管有关植物突变性和多态性检测的报道较少，但研究突变性和多态性对检测与防治植物疾病，探究分子突变与环境的关系，促进植物育种和植物新品种的产生等有积极意义。 3基因芯片技术在细菌中的应用 3.1细菌的种和型的鉴定 Charl等采用基因芯片对4种细菌( 痢疾杆菌、大肠杆菌、伤寒杆菌、空肠弯曲菌 )进行诊断和鉴别。可以鉴定多种细菌到种或属的水平。Troesch和Gingernas利用分枝杆菌DNA芯片杂交图像进行了基因分型与菌种鉴定。 3.2细菌耐药性的检测 Liang等用基因芯片既可以同时检测耐药菌的多个耐药基因，还可以同时对多个耐药菌的多个耐药基因进行检测。Troesch等报道利用基因芯片检测耐利福平结核菌标本，结果显示与测序结果完全相符，说明基因芯片可用于检测细菌的耐药基因。 3.3毒力基因的检测 Chizhikov等设计了代表肠杆菌科细菌6个常见抗原决定簇或毒力因子的寡核苷酸芯片 能同时检测大肠埃希菌、沙门菌和志贺菌的不同菌株。 C a 1 l 等制备了包含大肠杆菌O157：H7四个毒力因子寡核苷酸探针芯片，复合PCR后进行杂交，比传统电泳灵敏度高，可检测到 1fg的基因组 D N A，该芯片可以区分O157：H7和O 91：H2。 3.4细菌—宿主间相互作用的研究 细菌基因组容量远大于病毒基因组，其致病机理比病毒复杂得多对于细菌—宿主细胞 间的相互作用则可研究双方表达谱的变化，但目前研究仅限于宿主或细菌。 Chiou等将 AGS细胞与(幽门螺杆菌) 共同培养，然后用基因芯片技术检测细胞基因表达的情况，H.pylori共培养细胞的基因表达与正常条件培养细胞的基因表达明显不同，有21个基因表达上升，17个表达下降表达改变的基因中多数是转录因子基因，如癌基因c-jun、 基本转录要素结合蛋白 2基因(BETEB2 ) 和转录因子ETR101等。 4小结及展望 基因芯片是众多学科技术相互融合与相互渗透的结果。其发展势头十分迅猛，在生命科学的各个领域得到广泛地应用，但在实际应用过程中尚有许多技术问题亟待解决：( 1 ) 基因芯片的特异性的提高；( 2 ) 样品制备和标记操作的简单化和化；( 3 ) 增加信号检测的灵敏度；( 4 ) 高度集成化样品制备、 基因扩增、 核酸标记及检测仪器的研制和开发；( 5 ) 数据的后续生物信息学分析。 基因芯片发展方向包括以下几个方面：第一，现在cDNA芯片需要大量的RNA( 10ug总RNA或500ng的mRNA) ，因此必需改进 R NA的扩增方法以分析更小量的 R NA，最终进行单细胞表达分析；第二，需发明新的更敏感的信号检测系统；第三，芯片制备、样品处理、杂交、检测以及数据分析的标准化，提高基因芯片的准确性和可靠性。 尽管基因芯片技术还存在很多问题，但由于其具有并行化和高通量的特点，它的应用前景仍十分广阔。相信随着科学技术的发展，基因芯片技术将会迅速成熟起来并将渗透到生命科学的各个领域中去。 参考文献 [1]马立人，蒋中华．生物芯片【M】.北京:化学工业出版社,2000：4-10． [2]阿茹娜，吴岩，2004，生物芯片应用研究进展，内蒙古医学院学报，26(3)：227-232. [3]Aharoni A,KeizerLC P,BouwmeesterH J,et al.Identification of the SAATgene involved in strawberry,flavor biogenesis by Use of DNA Inicroarrays[j].Plant Cell,2000,12:647-661. [4]Schena M,ShKlon D,Davis R W,et al.Quantitative monitoring of gene expression patterns whith a comeplementary DNA microarray[j].Science,1995,270(5235):467-470. [5]CARL ,F ,EDMAN .Pthogen analysis and genetic predisposition testing using microelectonic arrays and isothermal amplification[J].Invest Med,2000,2:93-101. [6]TROESCH A,NGUTEN H,MIYADA C G,et al.Mycobacterium species identification and rifampin resistance testing with high-density DNA probe arrays [j].Clinical Microbiology ,1999,37(1):49-55. [7]GINGRTAS T S，GUANDOUR G，ＷANG G,et al.Simultaneous genotyping and specis identification using hybridization pattern recognition analysis of generic mycobacterium DNA array [J].Genome Resarch,1998,8:435.