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乙肝病毒携带者PBMC细胞中Toll样受体2表达水平与乙肝病毒增殖相关性研究

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乙肝病毒携带者PBMC细胞中Toll样受体2表达水平与乙肝病毒增殖相关性研究 · 224 · 广 医 科 大 学 学 R 报 SI 2010 Apr;27(2)JOURNA OF GUANGXI MEDICAI UNIVERSITY I ” 乙肝病毒携带者 PBMC细胞中 Toll样受体 2表达水平 与乙肝病毒增殖相关性研究 冷 静 吴亚滨 郑 禹 王启辉 李佳荃 白 玉 (广西医科大学免疫学教研室 南宁 530021) 摘要 目的:探讨乙肝病毒(HBV)增殖与无症状乙肝病毒携带者(ASC)外周血中 Toll样受体 2(TLR2)表达水平的相关性。 方法:分离乙肝病毒携带者...
乙肝病毒携带者PBMC细胞中Toll样受体2表达水平与乙肝病毒增殖相关性研究
· 224 · 广 医 科 大 学 学 R 报 SI 2010 Apr;27(2)JOURNA OF GUANGXI MEDICAI UNIVERSITY I ” 乙肝病毒携带者 PBMC细胞中 Toll样受体 2表达水平 与乙肝病毒增殖相关性研究 冷 静 吴亚滨 郑 禹 王启辉 李佳荃 白 玉 (广西医科大学免疫学教研室 南宁 530021) 摘要 目的:探讨乙肝病毒(HBV)增殖与无症状乙肝病毒携带者(ASC)外周血中 Toll样受体 2(TLR2)表达水平的相关性。 方法:分离乙肝病毒携带者和健康志愿者外周血单个核细胞,分别用免疫细胞化学染色方法检测 TLR2在细胞表面的表达情 况;用 RT—PCR方法检测 TI R2的 mRNA水平;用 El ISA法检测乙肝病毒携带者和健康志愿者血清中 TLR2活化后产物 TNF_a的表达水平。结果:HBV复制活跃组的外周血单个核细胞中 TI R2在蛋白水平和 mRNA水平表达明显低于 HBV复 制不活跃组和健康对照组;HBV复制活跃组血清中 TNF_a水平显著低于 HBV复制不活跃组。结论:乙肝病毒携带者外周血 单个核细胞 TLR2的表达及活化与乙肝病毒的增殖有相关性。 关键词 Toll样受体 ;乙肝病毒;外周血单个核细胞;无症状乙肝病毒携带者 中图分 类号 :R512.62 文献标 志码 :A 文章编号:1005—930X(2010)02—0224—04 THE STUDY oN RELATIoNSHIP BETW EEN TLR2 IN PERIPHERAL BLOoD MONoNU— CLEAR CELLS oF ASC AND PROLlFERATIoN oF HBV Leng Jing,Wu Yabin,Zheng Yu,et a1.(Department of Immunology,Guangxi Medical University,Nan— ning 530021 China) Abstract Objective:To study the relationship between the expression level of Toll—like receptor on surface of peripheral blood mononuclear cells(PMBCs)of asymptomatic HBV carrier(ASC)and the proliferation of HBV.Methods:PMBCs and sera from ASC and health people were isolated and collected.The expression of TLR2 in the surface of PMBCs and the level of TLR2 mRNA transcription in PMBCs were detected by immunocytochemistry and RT—PCR,respectively.An ELISA Kit was used to detect serum TNF—a leve1. Results:The intensity of TLR2 expression on surface of PMBCs and the level of TLR2 mRNA transcription in PMBCs in high level of HBV copy group were significantly lower than those in health control group and low level of HBV copy group.The intensity of serum TNF—a in low level of HBV copy group is significant— ly higher than that in high level of HBV copy group.Conclusion:The expression and activation of TLR2 on PBM Cs of ASC correlate significantly with the HBV proliferation. Key words Tolllike receptor;HBV ;PMBC;ASC 乙型病毒性肝炎是严重危害人类健康和生存质量的传 染病 ,乙型肝炎 病毒 (hepatitis B virus,HBV)是 其致 病的病 原体,其感染可引起急性和慢性乙肝感染,但 目前关于 HBV 引起持续 性 感染 的 机理 尚不清 楚 。Toll样受 体 家 族 (Toll like receptors,TLRs)是天然免疫系统的重要组成成分,在正 常情况下,是机体抗病毒免疫的重要成分,其中Toll样受体2 (TLR2)在其中发挥着重要作用l】 ]。然而新近研究表明,一 些病毒如痘病毒、丙肝病毒等可以抑制 TLRs介导的天然免 *基金项目:广西青年 自然科学基金(桂科青 0135012);广西医科大学 博士启动基金资助项目 收稿日期:2009—12—1O 疫,从 而破坏宿 主抗病 毒防御 功能n ]。亦有文 献报道 HBeAg阳性 的慢 性 乙肝 患 者 的外 周 血单 核 细 胞 (PMBC) TLR2的表达下降,提示 HBV可能抑制 TI R2的表达,从而 引起 后 续 乙 肝 的 慢 性 化 _6 ]。本 研 究 通 过 检 测 和 比 较 HBeAg阳性和 HBeAg阴性 的无 症状 乙肝病 毒携带 者 (ASC)血外 周单个核细胞的 TI R2表达情况以及 TLR2活化 产物 TNF— 的表达水平,旨在了解外周血单个核细胞 TLR2 表达水平与体内 HBV增殖情况的相关性,从而为进一步了 解机体抗乙肝病毒感染的免疫功能状态及今后开展免疫治 疗研究提供依据 。 1 材料与方法 1.1 病例选择与分组:48例乙肝病毒携带者为广西医科大 冷 静,等 .乙肝病毒携带者 PBMC细胞中 Toll样受体 2表达水平与乙肝病毒增殖相关性研究 学第一附属医院传染病科 2007年 1~4月门诊乙肝病毒感染 者,其中男 39例,女 9例,平均年龄(32.7_--4-12.O)岁。诊断依 据参照中华医学会传染病学分会、肝病学会分会联合修订的 《病毒性肝炎防治》(2000年 9月西安),选择血液 HB sAg阳性,但无肝炎症状和体征,各项肝功能正常的病人,根 据 HBeAg的状态和 HBV拷 贝数将乙肝病 毒携带者分为 HBV复制活跃组 (HBeAg阳性 ,HBV DNA拷 贝数>1×10 copies/mI )和 HBV复制 不活跃组 (HBeAg阴性 ,HBV DNA 拷贝数介于 1×1O。~1×10 copies/mI 之 间)。同时选取 健 康志愿者作为健康对照组,共 10例,其 中男 4例,女 6例,平 均年龄(28.0±5.3)岁,无心、肝、。肾、消化道、代谢异常和神 经等系统疾病史,HBV血清学标志物均为阴性。 1.2 标本采集与处理:空腹取静脉血 5 mL,其 中 4 mI 用 Optiprep (混合法)分离外周血单个核细胞,余下 1 mI 用于 分离血清,一20℃保存备检。 1.3 PMBC上 TI R2的检 测 :用 免疫 细胞化 学法 检测 外周 血单个核细胞 TLR2的表达情况 :取分离得到的 PMBC一部 分,进行细胞涂片固定,以山羊抗人 TI R2多克隆抗体作为 一 抗 ,生物素标记的兔抗山羊 IgG作为二抗进行标记,生物 素一过氧化酶 DAB显色并用苏木素复染胞核,以 PBS代替一 抗,做为阴性对照组,显微镜拍照后用病理图像分析系统(德 国莱卡,型号 DMR+Q55O)读取灰度值进行图像分析。 1.4 TI R2 mRNA 的检测 :取分离所 得 的部 分 PMBC,用杭 州博 日Simply P总 RNA提 取试剂 盒提取 总 RNA,用 Oligo (dT)为引物(见表 1)进行逆转录,合成 cDNA,然后用逆转录 产物进行 PCR扩增(PCR反应条件 :预变性 :95℃ 5 rain;变 性 :94℃ 30 S;退 火 :5O~65℃ 30 S;延伸 :72℃ 3O S;共 3O 次循环;循环结束后延伸:72℃ 10 rain),扩增产物进行琼脂 糖凝胶电泳 ,用凝 胶成 像分 析系统 进行 检测和 分析 ,对 mR— NA进行定量 ,IOD值表 示其含量 ,以 TI R2值/内参照 ac— tin值表示其相对表达水平。检测引物如下 表 1 RT PCR引物 TLR2 : : t>~ctin韦蒙;f 暑 GAGCAC GTTTAC AcTATC GAcCGC CTAc AGGC 1.5 血清 TNF a水平检测:用深圳 晶美公司的 TNF c~ EI ISA试剂盒对血清进行检测,操作步骤按试剂盒书进 行 。 1.6 统计学方法 :实验 数据 均以 ± 5表示 ,样本 间 比较 用 SPSS 13.0统计 分析软件进行 单因素方差分析 (One—Way AN()VA),P d0.05为差异具有统计学意义。 2 结 果 2.1 PBMC表面 TI R2表 达水 平 :各 组 PMBC细胞 化学 结 果(图 1)经显微病理图像分析仪进行灰度测定分析测定及统 计学分析(表 2),显示 HBV复制不活跃组和健康对照组的 PMBC中 TI R2的阳性率及表达水平(灰度与表达水平成反 比)均明显高于 HBV复制活跃组(P<0.05);HBV复制不 活跃组与健康对照组无显著差异(P>O.05)。 表 2 PMBC表面 TI R2阳性率和蛋白表达水平( ±s) 注 与健康对照组 比较,P<0.05; 与 HBV复制不活 跃组 比较 ,P d0.05; 与健康对 照组 比较 ,P d0.05 图 1 PMBC TI R2免疫细胞化学染色 A:HBV复制活跃组 B:HBV复制不活跃组 C:健康对照组 D:阴性对照组 · 226 · 广西医科大学学报 2010 Apr;27(2) 2.2 PMBC中 TLR2 mRNA的表达水平:RT—PCR结果经 琼脂糖凝胶电泳结果(图 2)显示,HBV复制活跃组 PMBC TI R2 mRNA表达水平明显低于 HBV复制不活跃组及正常 对照组(PO.05),见表 3。 】 2 3 4 actin 645 bp TLR2 442 bp 1 500 bp i 000 bp 500 bp 100 bp 图 2 PMBC中 TI R2 RT—PCR结 果 1:健康对照组 2:复制活跃组 3:复制不活跃组 4:Marker 表 3 PMBC中 TI R2 mRNA表达水平( ±S) 注 : 与健康对照组 比较 ,PO.05 2.3 血清中 TNF_a浓度水平:EI IsA法检测各组血清中 TNF—a水平 ,结果显示 ,HBV复制活跃组血清 中 TNF.d水平 明显低于 HBV复制不活跃组(P<0.001),而 HBV复制活 跃组和 HBV复制不活跃组血清 TNF_a水平明显高于健康 对照组 (P<0.001),见表 4。 表 4 血清中 TNF-a表达水平( ±S) 注: 与健康对照组比较,PO.05)。T1和 T2间的软组织面角、 鼻突度和颏厚等呈高度正相关(r>o.70,P
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