流感裂解疫苗纯化及裂解工艺的优化

·36· 中国生物制品学杂志2008年1月第2I卷第1期ChinJBiologicalsJanuary2008，v0I．2INo．1 中国图书分类号R373．1+3文献标识码A 文章编号l004．ss03(20惦)oboJ6-04 流感裂解疫苗纯化及裂解工艺的优化 杨拮1 刘红岩1 马波1 郭仁1 彭建新2谢飞1侯峰1代云渡1 【预防制品】 f摘要】 目的优化大规模生产的流感病毒裂解疫苗的纯化及裂解工艺。方法 比较凝胶层析和蔗糖密度梯度超速 离心的纯化效果，以及TritonX-100和去氧胆酸钠两种裂解剂在不同条件下的裂解效果。结果层析法纯度稍高于蔗糖密度 梯度超速离心法，而蔗糖密度区带超速离心法的收率优于层析法。TritonX-100的裂解效果优于去氧胆酸钠，裂解剂浓度为 0．5％或0．8％，裂解3或4h，裂解率达90％以上。疫苗在4。C保存1年后，所有检测项目均合格，4℃保存18个月和37。C保存 28d后，HA含量仍保持在30t,#na以上。结论已建立了切实可行的流感病毒裂解疫苗规模生产的纯化及裂解工艺。 【关键词】流感裂解疫苗；纯化；裂解 OptimizationofProcedureforPurificationandLysisofInfluenzaVirusVaccine YANGZhe4，删Hong—yan，MABo，etal(oWalvaxBioTechCo．Ltd，Kunm／ng650018，China) 【Abstract】ObjectiveTooptimizetheprocedureforpurificationandlysisofinfluenzavirusvaccine．MethodsComparethepurification efficaciesbygelfiltrationchromatographyandbysucrosedensityS砌entcentfifutgation．aswellasthelysisefficacieswithTritonX-100andwith sodiumdeoxycholateundervariousconditions．ResultsThepurityofsplitinfluenzavaccineafterpurificationbygelfiltrationchromatographyWas slightlyhigherthanthatbysucn)sedensitygradientuhracentrifugation．whiletherecoveryofvaccinebythelatterwashigherthanthatbythefor· mer．TritonX-100showedgoodlysisefficacyascomparedwithsodiumdeoxycholate．AfterlysiswithTritonX-100atafinalconcentrationof 0．5％or0．8％for3or4h，morethan90％ofinfluenzavaccineWasbrzed．Afterstorageat4。Cfor12months，allthequalityindexesofthe purifiedvaccinemettherelevantrequirements．However，afterstorageat40Cfor18monthsorat37℃for28d，theHAcontentofvaccineWas stillmorethan30tc,／m1．ConclusionApracticalandfeasibleprocedureforpurificationandlysisofinfluenzavaccineWasdeveloped． 【Keywords】Splitinfluenzavirusvaccine；Purification；Lysis 本文根据WHO规程有关规定和《中国药典》三 部(2005版)相关规定，并参阅文献，对流感疫苗裂 解病毒抗原超速密度区带离心及凝胶层析纯化病毒 的具体方法进行了优化，建立了有效的规模化生产 疫苗的裂解和纯化工艺。 1．材料与方法 1．1鸡胚 种子批制备使用9～1113龄SPF鸡胚，来自北 京梅里亚维通实验动物技术有限公司；疫苗制备使 用封闭饲养健康鸡群的9。11日龄鸡胚，来自昆明 实验养鸡场。 1．2病毒 3个流行性感冒病毒毒种来自NIBSC，具有完整 的历史和质量背景资料。即H1N1A／NewCaledonia／ 20／'99(简称A1)、H3N2A／NewYork／55／2004(简称 作者单位：】云南沃森生物技术有限公司研发中心(昆明 650118)；2华中师范大学生命科学学院昆虫学研究 所(武汉430074)． 通讯作者：代云波，E-mail：daicloud@gmail．com A3)和B／JiangSu／10／2003株(简称B)。 1．3试剂及仪器 SerazymOvalbuminEUSA试剂盒购自SeramunDi． agnosticaGmbH；牛血清白蛋白品购自中国药品生 物制品检定所；蛋白纯化仪AKTAexplorerl00为Phar． macia产品；介质Sepharose4FF为Pharmacia产品。 1．4病毒培养及纯化 取工作种子，以稀释度10。3接种于1113龄的普 通鸡胚，经35℃培养72h后，置4℃冷胚过夜，收获 尿囊液。分别对不同批次的尿囊液进行检测，将无 菌试验、灭活试验合格且血凝滴度大于1：240的尿 囊液合并；将单型病毒原液经10伽粗滤后，再经3、 0．45和0．22肚m膜过滤，最后用相对分子质量为 300000的膜包进行约50倍超滤浓缩，再经 Sepharose4FF凝胶层析纯化或蔗糖密度区带超速离 心纯化。 1．4．1 Sepharose4FF凝胶层析：以0．01mol／LPBS (pH7．4)为平衡缓冲液；0．01mol／LPBS(pH7．4)为 洗脱缓冲液；流速1。0mL／min；病毒液经层析纯化 后，收集洗脱峰，用直接血凝法检测效价。 万方数据 中国生物制品学杂志2008年1月第2l卷第1期ChinJBiologicalsJanuary2008，V01．21No．1 ·37 · 1．4．2蔗糖密度梯度超速离心：蔗糖浓度30％一 55％，离心条件25000r／rain，8h。以核酸蛋白检测仪 描记样品在280nnl处的吸收曲线，病毒液经离心后， 直接血凝法检测效价，根据血凝滴度收集目的峰。 1．5病毒裂解 将血凝效价为1：2560的纯化病毒液分别加入 TritonX一100和去氧胆酸钠，获得浓度分别为0．2％、 0．5％和0．8％的裂解溶液，于1、2、3和4h分别取 样，电镜观察病毒裂解效果。 1．6卵清蛋白含量测定 采用ELISA双抗体夹心法，使用SerazymOvalbu— minEUSA试剂盒进行检测。 1．7血凝素含量测定 采用免疫单扩散法⋯。将100m抗体(NIBSC) 加入到1．5％、56℃的琼脂糖中，打孔，每孔直径为 3mlTl，每孑L边距为6mln。将待检样品、标准品(NIB． SC)及对照品(NIBSC)室温裂解40min，每孔加入样 品15m，扩散24h，PBS浸泡，晾干，考马斯亮蓝染 色，脱色后观察结果。 1．8纯度测定 采用HPLC法。 1．9总蛋白测定 采用Lowry法。 1．10内毒素测定 采用鲎试剂法。 1．11稳定性试验 疫苗于4℃保存1年后，测定其各项指标。于 370C保存7、14、21、28d，于4。C保存3、6、9、12、15、18 个月，分别测定各型HA含量。 2．结果 2．1病毒液纯化效果 2．1．1Sepharose4FF凝胶层析i收集洗脱峰1、2，经 血凝滴度和鉴别试验，确认病毒集中在峰1，见图1。 2．1．2蔗糖密度梯度超速离心：收集洗脱峰1、2、3， 经血凝滴度和鉴别试验，确认病毒集中在峰2中，见 图2。第1峰为鸡胚卵清蛋白及小分子杂蛋白颗 粒，第2峰为有结构的病毒颗粒，第3峰为大分子杂 蛋白，电镜下未见流感病毒颗粒。 2．1．3病毒液的纯度：高效液相色谱显示，出现完 整的一个峰，未见其他杂蛋白峰，在出样末端有微小 波，计算病毒液纯度可达85％以上。 2．1．4病毒液回收率：检测结果明，不同方法纯 化病毒后，鸡卵清蛋白和流感病毒峰分离效果显著， 纯化效果较好。纯化前卵清蛋白含量为25．5e-o／n[1l， 凝胶层析和蔗糖密度梯度离心纯化后分别为0．11 和0．28e-o／n[1l，其去除率分别为99．5％和97．5％。 蔗糖密度梯度离心和凝胶层析法的回收率分别为 42．O％和38．7％，见表1。 2 2 o {1 l Vl邶 l 一、 卜k——。一一 ! lL．～一1^ ，I 八～⋯／√1 昌 赛 暑 图1流感病毒Sepharose4FF凝胶层析图谱 Fig1．Sepharose4FFchroma删cprofileofinfluenza 图2流感病毒蔗糖密度梯度超速离心图谱 Fig2．Sucrosedensitygradientultracentrifagafionprofile ofinfluenzavirus 2．2不同裂解剂浓度和裂解时间的裂解效果比较 Al、A3和B株病毒纯化液在不同浓度裂解剂、 不同裂解时间的HA抗原含量和HA裂解收率检测 结果表明，TritonX．100的裂解效果优于去氧胆酸 钠。应用TritonX．100，裂解剂终浓度为0．5％或 0．8％，裂解3或4h时，3个型别病毒液裂解HA收获 率均达到了最高值(>90％)；不同型别病毒、裂解剂 浓度和裂解时间的裂解效果大致相同，见表2和表3。 以5个视野中完整病毒与0浓度中完整病毒个 数的比例为判定标准，从电镜照片可见，裂解前均为 完整病毒，见图3，裂解后的视野内基本无完整病 毒，见图4，表明使用TritonX．100裂解能达到预期效 万方数据 ‘38‘ 中国生物制品学杂志2008年1月第21卷第1期GirlnJBiologicalsJanuary2008，V01．21No．1 果 2．3疫苗稳定性 6批成品4。C保存1年后，所有检测项目检定结 果均符合《中国药典》三部(2005版)要求，除HA含 量略有下降外，其他项目均无明显变化，见表4。 图3流感病毒裂解前电镜照片 Fig3．Electronmicroscopyofwhole如m地IIzavirus 疫苗在376C保存7、14、21、28d后，其HA含量逐步 下降，但仍保持在30∥瑚以上。在4℃保存3、6、 9、12、15、18个月，HA含量缓慢下降，但也未低于 30彬1111的合格标准，见表5。 圈4流感病毒裂解(Tritanx-1∞)后电镜照片 Fig4．Electronmicroscopyat劬矧influenzavirus 表1病毒液纯化结果 Tab1．Purificationofinfluenzavirus CDllcentr咀edsaI喇e HA Ovalbumin Procedure HA OvalbuminContent ． ～、 Content Removal Purity(％) !垡《型2 (些《世2 1缝!型2 竺=：!!：! !些《世2 型!!丝2 Sepharose4FFchromatography860 25．5 374 38．7 0．11 99．5 91．5 Sucrosedensitygradient 860 25．5 419 42．0 O．28 97．5 86．9 111竺!!!旦鱼鲤麴 表2 TritonX-100裂解试验 Tab2．DeterminationofHAcontentbyTritonX-100lysistest Triton 1 h 2h 3h 4h Virus X．100 姒 HA HA HA (丝) (些《型2 竺：!!兰! (世《型!竺!：!兰!!碰型2 1=：=!兰!f碰鲤2 竺二!!兰!——一 (丝) !些型型2 1世型型! !坚型型2 1拦型鲤2 A1 0．2 79．3 44．2 93．2 57．4 118．5 s3．6 130．8 88．5 0．5 98．7 59．8 10r7．6 70．4 138．1 91．5 155．7 94．4 0．8 110．5 67．1 120．4 68．7 145．7 93．1 154．3 95．8 A3 0．2 83．5 41．8 103．2 60．2 123．8 79．6 133．4 87．4 0．5 92．7 48．7 121．6 70．8 157．1 90．2 170．3 92．1 O．8 99．6 48．9 128．3 74．1 160．2 94．5 168．7 94．7 B 0．2 77．2 47．6 99．6 62．1 125．2 85．7 138．7 89．4 0．5 108．5 61．5 110．5 73．2 147．7 90．8 163．8 90．9 ．．O．8 110．3 56．2 107．6 72．6 168．2 92．4 172．5 93．7 表3去氧胆酸钠裂解试验 Tab3．DeterminationofHAcontentbydeoxycholatelysistest l h 2h 3h 4h Virus HA HA HA HA 竺竺竺兰!!哑熊21=：=!兰!!凸趔2竺二=!兰：(应鲤2竺=!兰!(哑型2竺：竺!兰! A1 0．2 66．4 28．9 82．6 54．3 97．1 68．4 126．6 81．4 B 0．5 0．8 0．2 0．5 0．8 0．2 O．5 O．8 l 6 2 9 5 8 l 2宕8∞辨盯叽阱蹿s! 卫馏■o母4 j■铝鸲博"鲐勰钾酩 7 2 4 7 9 3 7 1龇斟竹观硒加观盯 6 8 4 8 9 4 9 7町为叭虬钉∞勉趵 4恩■o■J 4舟酾∞鼹酊毋卯研订■4卫石■4卫■％∞盯％呕％￡}呕 8 7 2 7 5 7 8 3∞矾掩舭瓶弘∞酡 7 9 6●6 2 8 3&}犯卯的他甜{。罟8 万方数据 中国生物制品学杂志2008年1月第2l卷第1期ChinJBiologicalsJanuary2008，V01．21No．1 ·39· 衰4疫苗4。C保存1年的各项稳定结果 Tab4．Stabilityoffinalproductafterstorageat4。Cfor12months 竺 竺： 竺! 盘Sephar”蛔4F丝F 碰Su型cro型seden型sity竺 HA(tc／n_11) AI 36±1 30±2 30±2 A3 49±2 32±l 334-2 B 37±l 34±l 32．4-l Sterilitytest eyrogentest Identityteat Totalproteins(pg／m1) Formaldehyde(ttg／m1) Merthiolate(tc,／m1) Ovallmmin(／1{g／m1) Safety pH Appearance VOIume Pass 189±5 20±l 75±3 0．35±0．07 Pass 7．1±O．5 Pass Pass Pass 164±4 17±l 72士2 O．22±0．07 Pass 7．2±O．4 Pass Pass Pass 173±7 13±2 醅±4 0．3l±O．06 Pass 7．1±O．5 Pass Pass 表5疫苗4℃和37℃保存不同时间的稳定性 Tab5．Stabmtyoffinalproductafterstorageat4。Cand370C 鼬arose AI 36±1 35±2 35-t-134±1 33±1 35±1 35±234±3 31±1 31±2 30±1 4FF A3 49±2 37±1 35±2 33±l 33±3 37±l 35±3 35±232±l 32±2 32±3 B 37±l 34±2 34±l 33±3 31±2 35±l 34±2 33±3 32±2 32±3 31-v3 SucrosedensitygradientAI 36±1 35±1 35±2 34±3 33±2 35±3 35±1 34±3 31±1 31±2 30±1 centrifugationA3 49±2 37±1 35±3 33±3 33±2 37±1 35±1 35±1 32±232±2 32士1 B 37±l 34±234±l 33±3 31±3 35±234±2 33±l 32±2 32±l 31±2 3．讨论 WHO每年根据全球流感病毒监测的分析推荐 下一年度的3型疫苗组分，以应对病毒的变异性【2j。 流感灭活疫苗能有效地保护60％。90％的健康人 群。当前批准使用的流感病毒裂解疫苗的主要免疫 原性组分是通过有机溶剂抽提纯化的HA，其含量至 少在30tc,／n：1l／株以上才能够提供足够的抗原以刺 激免疫反应。目前世界上有20多个国家生产流感 裂解疫苗或亚单位疫苗。 流感病毒纯化主要有两种方法，即超速区带离 心法和凝胶层析法。从本实验结果可以看出，两种 方法均可以获得较好的纯度和收率。从产业化的角 度考虑，密度梯度离心法的病毒回收率要优于凝胶 层析法，但纯度不如凝胶层析法。这个问题可以通 过减少梯度离心的中后部收样来调整。梯度离心结 果显示各相对分子质量颗粒分离得较明显，有效峰 为一个独立峰，未与杂蛋白峰交叉。 裂解剂选择的原则是【3，4J：①必须是已经运用 于生物制品或药品生产的试剂；②不能具有较高毒 性；③必须具有有效溶解流感病毒膜抗原的能力，收 获率不能低于70％。通过实验及中试生产验证， TritonX．100裂解流感病毒时HA抗原的收获率超过 80％，最高能达到95％。但在浓度高于1．0％，裂解 时间超过90min后，在病毒裂解的同时，部分血凝 素发生了断裂，影响疫苗抗原性，因此选择90min 作为裂解时间，1．0％作为裂解浓度。通过研究发 现，在相同浓度和时间，TritonX一100的裂解效果优 于去氧胆酸钠。 将裂解疫苗放置4℃、37℃的不同时间进行检 测，HA含量缓步下降，但均保持在30彬IIll以上， 表明该疫苗是稳定有效的。 参考文献 【1JWiliamsMS，MaynerRE，DanielNJ，eta1．NewdevelopmentsintheI№一rantofhaemagglutinincontentofinfluenzaviresvaccinesbysinde- radial-immunodiffusion．JBiolStand。1980，8：289-296． [2]㈨lC．1heannualproductioncycleforinfluenzavaccine．Vaccine， 2003，2l(16)：1776．1779． 13JWarburtonMF．Desoxycholste-splitinfluemvaccine．BIlllWorldHealth 嘶，1969，4l(3)：639—641． 14JGrossPA，EaRl8FA，GanrlanPF，eta1．Ctm阳risorIofnew晡tenX-100 andtween-ether-treatedsplit-treatedvaccinesinchildren．JCAinMicrobi— ol，198l，14(5)：534-538． (收稿日期：2007-05．23) 万方数据 流感裂解疫苗纯化及裂解工艺的优化 作者： 杨喆， 刘红岩， 马波， 郭仁， 彭建新， 谢飞， 侯峰， 代云波 作者单位： 杨喆,刘红岩,马波,郭仁,谢飞,侯峰,代云波(云南沃森生物技术有限公司研发中心,昆明 ,650118)， 彭建新(华中师范大学生命科学学院昆虫学研究所,武汉,430074) 刊名： 中国生物制品学杂志 英文刊名： CHINESE JOURNAL OF BIOLOGICALS 年，卷(期)： 2008，21(1) 被引用次数： 0次 参考文献(4条) 1.Wiliams MS.Mayner RE.Daniel NJ New developments in the measurement of haemagglutinin content of influenza virus vaccines by singleradial-immunodiffusion 1980 2.Gerdil C The annual production cycle for influenza vaccine 2003(16) 3.Warburton MF Desoxycholste-split influenza vaccine 1969(03) 4.Gross PA.Ennis FA.Gaerlan PF Comparison of new triton X-100 and tween-ether-treated split-treated vaccines in children 1981(05) 相似文献(6条) 1.期刊论文 吴红荣.郭大龙.王正宇.张文兵.齐娟.李佳林 流感裂解疫苗生产中沙门菌和微生物限度的监控研究 - 微生物学免疫学进展2009,37(3) 通过对2008年流感裂解疫苗生产中的监控,结果显示,流感病毒接种鸡胚尿囊液中未检出沙门菌,除菌过滤前微生物限度均小于10CFU/ml、细菌内毒素 均小于25EU/ml,纯化过程去除了99%的杂蛋白.表明生产中使用的健康鸡胚尿囊液是符合生物制品规程的要求,现行生产工艺对微生物限度和细菌内毒素的 控制是有效的,现行纯化过程对病毒液的纯化是有效的. 2.学位论文 罗德炎 大流行流感裂解疫苗的研制及关键技术的研究 2008 当前，高致病性人禽流感H5N1已在15个国家和地区发生，死亡率高，特别是印尼家族性感染被美国科学家证实为人传染人事例后，使得大流行流感 防控形势异常严峻。WHO预言，下一次流感大流行不是有和无的问题，而是早和晚的问题。因此，做好大流行流感疫苗研发和关键技术平台的研究，已成 为世界各国应对流感大流行采取的重大举措。 疫苗免疫接种是控制高致病性人禽流感最有效而经济的手段之一，但面临着高致病性人禽流感病毒H5N1毒株变异、鸡胚生产疫苗原料来源受限、注 射接种繁复等重大问题。因此WHO要求全球加快大流行流感疫苗研发和关键技术储备研究进程，为应对流感大流行做好充分的准备。 目前，高致病性人禽流感病毒H5N1感染主要分布在亚洲，特别是印尼、越南和中国，对其分离的毒株进行血清学、致病性和基因结构等分析表明 ，高致病性人禽流感病毒H5N1具有高度变异的特性，就中国分离的毒株存在南北之分。因此，WHO要求各国开展大流行流感原型疫苗的研究。目前大流行 流感疫苗的研究重点主要集中在灭活全病毒疫苗、裂解疫苗、减毒喷鼻疫苗、亚单位疫苗等。其中裂解疫苗具有不可多得的优势：与全病毒灭活疫苗仅 可用于成年人的特点比较，可广泛用于各类人群，尤其是作为禽流感病毒的高危人群-老人和12岁以下的儿童；不存在减毒疫苗毒力恢复的缺点，更安全 ；较亚单位疫苗具有更强的免疫原性和制各简单等优势。目前，大流行流感裂解疫苗已成为世界著名疫苗企业和研究机构介入的重点，并取得了阶段性 成果，为流感大流行作好了充分的准备。 基于大流行流感裂解疫苗应对流感大流行具有不可多得的优势，我们在国内率先成功研发了大流行流感裂解疫苗，解决了我国“无”和应急的问题 。同时围绕大流行流感疫苗关键技术平台：针对高致病性人禽流感病毒H5N1不断变异，需要运用RG技术来快速制备疫苗株的问题、鸡胚生产原料来源和 质量的问题、注射免疫不能产生全面免疫应答和接种复杂的问题进行了研究，其研究进展如下： 大流行流感裂解疫苗的研制：我们从美国CDC引进大流行流感疫苗株VNH5N1-PR8/CDC-RG(H5N1)，该疫苗株是利用反向遗传学技术，将高致病性人禽 流感病毒A/VietNam/1203/2004(H5N1)的HA、NA基因定点突变后和PR8的6个内部基因进行重组，得到大流行流感疫苗减毒株。 开展了大流行流感裂解疫苗种子批库的研究。通过SPF鸡胚传代建立了大容量符合疫苗生产的原始种子批、主种子批和工作种子批库。分别对大流行 流感疫苗各种子批进行了血凝滴度的检测、病毒型别的检定、EID50、无菌实验、支原体检测、外原因子检测及动物实验，实验证实建立的原始种子批、 主种子批和工作种子批库具有安全、有效和稳定，符合WHO规定大流行流感疫苗生产的要求。 开展了大流行流感裂解疫苗原液生产的研究。通过健康鸡胚培养、收获、灭活、裂解大流行流感裂解疫苗病毒，制备疫苗生产裂解病毒抗原。实验 表明病毒培养温度为33℃、培养时间为52h，病毒灭活采用1:4000的甲醛20～25℃灭活72h，病毒的纯化使用凝胶过滤Sepharose4FastFlow，病毒裂解选 择浓度为0.5％的TritonX-100，室温作用2.0h，建立了疫苗生产的最佳生产工艺，制备了大流行流感裂解疫苗原液。 开展了注射型大流行流感裂解疫苗成品和有效性的研究。选用铝盐佐剂，采用动物模型和抗原吸附率检测进行铝佐剂浓度的确定，确定的铝佐剂浓 度为1.2mg/ml。选用3.75、7.5、15.0、30.0、45.0、60.0、75.0、90.0μg/0.5ml8个疫苗剂量组，分别肌肉免疫小鼠和豚鼠，对疫苗免疫原性进行了初 步研究。通过血凝抑制实验来筛选疫苗的有效剂量，结果表明加铝盐佐剂的7.5、15.0、30.0μg/0.5ml是最佳的疫苗剂量组。我们同时对小鼠和豚鼠免 疫一针和两针时的免疫效果进行了统计分析，表明免疫两针效果明显优于一针。因此，确定的大流行流感疫苗临床试验为7.5、15.0、30.0μg/0.5ml成 品剂量组，免疫两针，为临床研究提供了依据。 开展了注射型大流行流感裂解疫苗安全性和稳定性的研究。通过动物过敏实验、异常毒性实验、急性毒性实验、热源质实验，结果表明大流行流感 裂解疫苗无毒性，使用安全。将大流行流感裂解疫苗成品置2～8℃、室温(22～25℃)、37℃，通过解吸附单扩实验验证抗原含量，免疫Balb/c小鼠测定 疫苗效力(中和抗体)，通过pH仪检测pH值，外观的观察来鉴定疫苗稳定性，并通过疫苗加速实验，制备的大流行流感裂解疫苗可在2～8℃保存两年 以上。 开展了注射型大流行流感裂解疫苗Ⅰ期临床研究，通过双盲实验完成了疫苗安全性、有效性研究，实验证明制备的疫苗安全、有效。 大流行流感疫苗关键技术的研究：围绕大流行流感疫苗研发中的疫苗毒株、培养介质和免疫途径的关键技术问题进行了研究，为应对流感大流行疫 苗快速研发做好准备。 一是针对高致病性人禽流感病毒H5N1高度变异的问题，开展了RG技术用于疫苗株的拯救。因为高致病性人禽流感病毒H5N1高度变异，需要不断更换 疫苗株，而快速、及时对流行株获得大流行流感疫苗株将是有效控制流感爆发流行的首要环节之一。我们通过流感病毒8质粒拯救系统，在BSL-3培养 A/Anhui/1/2005(H5N1)病毒，提取病毒RNA，利用基因重配技术将该病毒的HA(定点突变)、NA构建到双向表达质粒pHW2000上，将构建好的2质粒和PR86质 粒共转染COS-1细胞，获得重组的PR8/A/Anhui/1/2005疫苗株病毒。运用RT-PCR.、血凝实验、电镜、间接免疫荧光实验检测拯救的重组疫苗株病毒。实 验结果表明，拯救PR8/A/Anhui/1/2005疫苗株病毒基因序列正确，血凝滴度达到1:320以上；电镜下病毒形态正常，成丝状和囊状。CPE证实病毒毒力明 显降低，符合大流行流感疫苗株的要求，在国内率先建立了反向遗传学拯救流感疫苗株的关键技术平台。 二是针对大流行流感疫苗生产原料来源的问题，开展了Vero细胞替代鸡胚生产疫苗的研究。构建了pCDNA3.1-ST3GalⅢ表达载体，转染、G418加压筛 选Vero细胞，获得稳定高效表达高致病性人禽流感病毒受体的Vero细胞株。运用改造好的Vero细胞株培养PR8/A/Anhui/1/2005疫苗株病毒，通过细胞病 变和血凝实验结果证明，PR8/A/Anhui/1/2005疫苗株病毒感染Vero细胞病毒复制滴度提高，TCID50达到106.5-7，较普通的Vero细胞提高了100-150倍 ，初步建立了Vero细胞生产大流行流感疫苗的细胞系。我们将Eng53/v-aNS基因置换了8质粒系统的NS基因，重组病毒理论上可在Vero细胞上大量复制 ，但我们的实验结果却与预期值有差异，进一步实验仍在进行中。 三是喷鼻型大流行流感疫苗的研究，喷鼻大流行流感疫苗具有快速、简便大规模接种、免疫保护谱广的特点。将大流行流感裂解疫苗分别使用不同 的佐剂，采用不同的免疫途径，分别检测唾液、肺灌洗液中分泌型IgA，血液中的IgG、IgA，以及运用HI实验来确定喷鼻疫苗最佳剂型和最佳免疫途径。 结果表明，蛋白体佐剂与VNH5N1-PR8/CDC-RG(H5N1)制备的喷鼻型大流行流感裂解疫苗具用良好的免疫原性和安全性，其分泌型IgA是各类佐剂中最高的 ，其中肺灌洗液中IgA滴度为1:640，HI实验结果也证明，运用蛋白体佐剂喷鼻免疫大流行流感裂解疫苗将是一个具有良好开发前景的举措，。 结论：为加快适应和满足我国流感大流行疫苗研发和关键技术储备能力的需求。我们在应急上，已完成针对越南株大流行流感裂解原型疫苗的研究 ；围绕疫苗研发可持续发展战略上，针对高致病性人禽流感病毒H5N1株变异问题，建立了快速制备疫苗株的技术平台、针对疫苗生产原料来源和质量难 以控制的特点，初步建立了Vero细胞替代鸡胚生产疫苗的技术平台、针对注射疫苗不能产生局部免疫和交叉免疫保护的特点，制备了喷鼻型大流行流感 疫苗，可同时激发黏膜免疫和系统免疫，实现了对高致病性人禽流感病毒疫苗动态互补的研发创新体系，为流感大流行做好了充分的准备。 3.期刊论文 雷清.黄思扬.应莲芳.梁凌宇.马亚茹.蒋琳 重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位表达条件的优化及其佐 剂作用 -中国生物制品学杂志2008,21(3) 目的 优化重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的表达条件,并检测其黏膜佐剂作用.方法 通过向LB培养基中添加葡萄糖(终浓度为0.5%)、低温 培养诱导等方法诱导LTB的表达;采用阳离子交换法对目的 蛋白进行纯化;以LTB作为佐剂进行免疫试验.结果 可溶性重组大肠杆菌不耐热肠毒素(LTB)的 表达量明显提高,纯化后蛋白含量达95%以上,经纯化的LTB作为三价流感裂解疫苗或gD抗原的佐剂免疫BALB/c小鼠,可提高小鼠血清及黏膜的抗体水平,且 其效果与铝化剂及福氏佐剂相当或更高.结论 优化了LTB的表达条件,且表达的LTB具有较强的黏膜免疫佐剂作用. 4.期刊论文 王志武.卢日峰.范洪学 流感病毒的裂解、纯化及抗原性研究 -中国生物制品学杂志2002,15(3) 目的研究适于大规模生产的流感病毒裂解剂、裂解和纯化方法.方法使用不同表面活性剂(Triton X100和去氧胆酸钠)、不同浓度和时间进行裂解,通 过电镜进行裂解效果观察.裂解后经密度梯度离心纯化,并进行抗原性试验.结果 Triton X100的裂解效果优于去氧胆酸钠,应用1.0% Triton X100裂解 90min效果较好.裂解率达90%以上.裂解后纯化的样品抗原性与进口疫苗类似.结论该工艺适于流感裂解疫苗大规模生产. 5.期刊论文 戚凤春.王敏文.薄洪.郭桥.范宇红.王志刚.张玉辉.阎长太.盛军 去氧胆酸钠裂解流感病毒的效果研究 -中国生物制品学杂志2003,16(2) 目的研究去氧胆酸钠对流感病毒最佳的裂解条件.方法流感病毒在不同浓度的去氧胆酸钠作用一定时间后,经蔗糖梯度密度离心纯化,制备出流感裂解 疫苗样品.以电镜观察病毒裂解情况和血液凝集反应,测定病毒效价作为评价指标,确定最佳裂解条件.结果裂解纯化后的样品经电镜、SDS-PAGE检测表明 病毒颗粒完全裂解,裂解后的血凝效价收率约为80%.结论0.8%的去氧胆酸钠作用120min可使流感病毒达到最佳裂解效果. 6.学位论文 魏晓露 流感病毒裂解疫苗工艺研究 2008 流感病毒具有高度的传染性，能引起急性呼吸道传染疾病，流行特点是在短时间内突然爆发，迅速蔓延，造成不同程度的流行，包括世界大流行、 局部流行暴发及扩散。其发病率极高，同时伴有很高的死亡率。目前尚无特效药，接种流感疫苗是被公认的预防流感发生与传播的最佳方法，用鸡胚作 为病毒生长介质也是目前流感疫苗生产最常用的培养基质。 我们首先将来源于WHO流感参考和研究合作中心的H1N1、H3N2、B三种不同型别的流感病毒毒株分别接种于SPF级鸡胚，经培养后，收获其尿囊液，制 备主代和工作种子批。将工作种子批接种来源于封闭式房舍内饲养的健康鸡群鸡胚进行大规模培养，收获病毒液，然后经超滤浓缩、纯化、裂解、灭活 、二次纯化等步骤，获得三个型别的单价病毒液。在这过程中首先明确了适宜的毒种稀释倍数和病毒收获时间，然后摸索了蔗糖密度梯度离心纯化应该 收集的病毒峰，并对工艺中裂解剂以及灭活剂的选用进行了研究，确定了生产工艺。 选用两种裂解剂Triton X100和Triton N101，以不同浓度对流感病毒单价纯化液作用，通过电镜进行裂解效果观察，确定最佳裂解时间，用单向免 疫扩散法检测HA含量作为评价指标。结果表明：Triton X100的裂解效果较优越，0.5％～1％,Tdton X100作用90min可使流感病毒裂解。我们在本次研究 中，将二乙烯亚胺(Binarv Ethylene Imine，简称BEI)引入制备流感病毒灭活疫苗当中，与甲醛做对照， BEI的最佳灭活时间在24～36h之间，甲醛的为 3h；BEI的灭活后的免疫效果明显优于甲醛。运用RT-PCR的方法测定出病毒8个基因灭活前后的变化，表明BEI灭活病毒的同时将8个基因序列完全破坏 ，而甲醛破坏不完全，从分子生物学水平证明经BEI灭活的流感灭活疫苗更加安全、可靠。通过单向免疫扩散试验对两种灭活剂的灭活效果做进一步验证 ，发现虽然BEI灭活病毒的时间长，但是其样品中HA含量较甲醛灭活的高，但BEI能否用于人用疫苗的制备还需进一步研究进行大量的临床实验。 本研究对使用鸡胚培养流感病毒制备流感裂解疫苗生产工艺的几个重要环节进行试验摸索，为将来生产工艺的进一步改进提供了研究基础。 本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_zgswzpxzz200801011.aspx 授权使用：中国疾病预防控制中心(中国疾病预防控制中心)，授权号：5597c7ca-32f1-467a-bf64-9e1700d43d73 下载时间：2010年10月22日