表观遗传学-DNA甲基化

null观遗传学表观遗传学第二章 DNA甲基化A Symphonic ExampleA Symphonic ExampleA Symphonic ExampleA Symphonic Example拉尔夫·沃恩·威廉姆斯 (Ralph Vaughan Williams)，作于1910Epigenetic differences：monozygotic twinsEpigenetic differences：monozygotic twins内容纲要内容纲要一、DNA的甲基化 二、真核生物的DNA甲基转移酶 三、DNA去甲基化 四、DNA甲基转移酶抑制剂一、DNA甲基化 (1)一、DNA甲基化 (1)1. DNA甲基化：在DNA甲基转移酶 (DNA methyltransferase, DNMTs) 的作用下，将一个甲基添加的胞嘧啶的5’-碳分子上，形成5-甲基化胞嘧啶 (5-methylcytosine) 2.胞嘧啶甲基化后产生5-甲基化胞嘧啶能够自发的脱氨基形成胸腺嘧啶 (Thymine)：5mC -> T 3. 哺乳动物中，~1%的DNA碱基能够发生甲基化修饰 4. DNA甲基化的分布： (1)转座子 (2) 逆转录病毒衍生的重复序列 (3) 大多数功能基因的编码区一、DNA甲基化 (2)一、DNA甲基化 (2)1. DNA甲基化的模式： (1) 线虫：无甲基化的胞嘧啶 (2) 果蝇：极少量的甲基化胞嘧啶，识别模式CpT (主要) vs. CpG (极少) (3) 哺乳动物：CpG (~70%)或者CpNpG 2. CpG – Cytosine phosphate Guanine 3. 镶嵌的甲基化 (mosaic methylation): 基因组中，高度甲基化的部分DNA序列被大的非甲基化DNA序列所分隔开 4. 难以被DNA修复系统所识别： CG→TG是可遗传的CpG岛的甲基化 (1)CpG岛的甲基化 (1)1. CpG岛：富含CpG区域，长度500~1000bp，GC含量超过55% 2. 非随机出现：~60%的编码基因的5’UTR区域（转录起始区域）含有CpG岛。 3. CpG的含量： (1) CG出现的期望值（百分比）：1/16 = 6.25% (2) 观察值：很少（~1%） (3) 原因：CG具有很高的突变率 4. C-T转换率是其他碱基对转换率的10-40倍以上 5. 例如：人类肿瘤细胞中的p53基因，50%的点突变都发生在CpG上。CpG岛的甲基化 (2)CpG岛的甲基化 (2)1. CpG在重复片段以及基因的3’UTR区域能够发生甲基化 2. CpG岛通常不被甲基化 3. 哺乳动物中： 26,000-45,000 CpG岛。常分布在持家基因和一些组织表达特异性基因的启动子区域 4. CpG岛：可以被HpaII酶(C|CGG)切成小片段，因此也叫HTF岛DNA序列中的四种碱基/核苷DNA序列中的四种碱基/核苷DNA甲基化DNA甲基化SAH, S-adenosylhomocysteine; SAM, S-adenosylmethionineDNA甲基化DNA甲基化C –> 5mC –> T?C –> 5mC –> T?5-Methylcytosine (5mC)?DEAMINATIONDEAMINATIONDeamination: 去氨基化反应An enzyme to remove it from DNA: uracil-N-glycosylase. DNA甲基化的检测DNA甲基化的检测1. 传统实验 Methylation-sensitive restriction enzymes Methylation-specific enzyme McrBC 2. 现代方法 MeDIP: methylated DNA immunoprecipitation assay MBD：methylation binding domain 3. DNA甲基化位点的确定：Bisulfite genomic sequencingDNA甲基化的检测DNA甲基化的检测Bisulfite ModificationBisulfite Modification测序: 非甲基化的C将被测序成T，反链为A DNA甲基化位点鉴定的方法DNA甲基化位点鉴定的方法DNA甲基化的功能DNA甲基化的功能精确的功能有待进一步研究，一般学术界公认的两类功能是: 宿主防御模型 (The Host Defence Model) 基因调控模型 (The Gene Regulation Model) 宿主防御模型宿主防御模型1. 转座子的甲基化 2. 人类基因组~45%的区域是转座子 3. 高度甲基化，细胞中90%的甲基化CpG位于转座子中 4. 转座子的活性：对机体非常有害 5. 宿主防御模型：抑制转座子的活性转座子导致的PEV转座子导致的PEV基因调控模型基因调控模型1. DNA甲基化的主要功能：转录沉默 (silencing transcription) (1) 基因的启动子区域通常不被甲基化修饰 (2) 建立特定的基因表达模式：组织特异性、生殖特异性… (3) 基因印记、X染色体失活 2. DNA甲基化抑制基因转录的机制： (1) 干扰转录因子对DNA元件的识别和结合 (2) 将转录因子的DNA识别序列转变为阻抑物的识别序列 (3) DNA甲基化有利于招募染色质重塑或修饰因子 3. DNA甲基化：是转录沉默的结果和维持，而不是原因DNA甲基化抑制基因转录的机制DNA甲基化抑制基因转录的机制Long-term silencing直接干扰机制 (1)直接干扰机制 (1)直接干扰机制 (2)直接干扰机制 (2)间接机制间接机制The methyl-CpG-binding proteins MeCP1 and MeCP2能够与甲基化的DNA结合 MeCP2能够招募Sin3a, HDACs，形成复合物，阻遏转录MeCP2MeCP2二、真核生物的DNA甲基转移酶二、真核生物的DNA甲基转移酶1. 哺乳动物: DNMT1, DNMT3A, DNMT3B，DNMT3L, DNMT2 2. 拟南芥：DRM2, MET1，DNMT2, CMT3 3. 粗糙脉孢菌 (Neurospora crassa): DIM2, dim-5, RID DNA甲基转移酶DNA甲基转移酶DNA甲基转移酶: 系统发育DNA甲基转移酶: 系统发育分析哺乳动物的DNA甲基转移酶哺乳动物的DNA甲基转移酶DNMT1: maintenance methyltransferases DNMT3A & DNMT3B: de novo methyltransferases – 胚胎移植过程中高表达 ◄daughter strand◄daughter strandDNA甲基化与去甲基化DNA甲基化与去甲基化DNA甲基化的维持：两种模型DNA甲基化的维持：两种模型PCNA:在染色体上滑动UHRF1：特异性的与半甲基化位点结合表观遗传修饰的重编程表观遗传修饰的重编程配子形成胚胎植入前的发育精原细胞滋养外胚层DNA甲基化：Cell MemoryDNA甲基化：Cell MemoryDNA甲基转移酶的功能DNA甲基转移酶的功能DNA甲基化的通路：哺乳动物DNA甲基化的通路：哺乳动物启动子的甲基化启动子的甲基化(a) 未知蛋白质因子X失去，DNMT结合，促使启动子甲基化 (b) 聚合酶失去，DNMT结合->甲基化 (c) 某些转录因子招募DNMT到启动子区域，促使甲基化 (d) 组蛋白甲基转移酶(HMT)招募DNMT…DNA甲基化的通路：拟南芥DNA甲基化的通路：拟南芥1. TXN：Transcription 2. 拟南芥中大多数全新甲基化由siRNA介导 3. DRM2: de novo; MET1: MaintenanceDNA甲基化：哺乳动物 vs. 植物DNA甲基化：哺乳动物 vs. 植物CpG为什么不被甲基化？DNA甲基化的通路：粗糙脉孢菌DNA甲基化的通路：粗糙脉孢菌1. RIP: repeat-induced point mutationDnmt1Dnmt11. Dnmt1chip/-: Dnmt1的表达量为正常小鼠的10%； 2. 低甲基化 3. Dnmt1chip/-小鼠出生体重为正常的70% 4. 80%的小鼠4-8个月内产生淋巴瘤 5. 癌基因c-myc表达量异常增高Dnmt3bDnmt3b1. 小鼠胚胎纤维原细胞中的Dnmt3b失活导致DNA的低甲基化 (Hypomethylation)，染色体不稳定，使癌症细胞永生化 2. 形成有丝分裂染色体桥 3. 转入Dnmt3b能够恢复表型Dnmt3a & Dnmt3bDnmt3a & Dnmt3b表达特异性： Dnmt3a: ubiquitous Dnmt3b: 前额，眼睛Dnmt3a & Dnmt3bDnmt3a & Dnmt3b对哺乳动物的发育至关重要三、DNA去甲基化三、DNA去甲基化1. DNA去甲基化 (DNA demethylation): 5甲基胞嘧啶 (5mC) 替代成胞嘧啶的过程 2. 两种方式 (1) 主动去甲基化 (Active DNA demethylation) A. Bona fide demethylation B. Indirect demethylation (2) 复制相关的去甲基化 (Replication-coupled DNA demethylation)Active DNA demethylationActive DNA demethylation1. 5-甲基胞嘧啶去甲基化酶将5-甲基胞嘧啶水解成胞嘧啶和水 2. 5-甲基胞嘧啶/DNA糖基化酶将5-甲基胞嘧啶从磷酸二脂键骨架中切除，然后通过内切酶修复5-甲基胞嘧啶去甲基化酶5-甲基胞嘧啶去甲基化酶1. 1999年，A549细胞中提取，MBD2； 2. 需要很高的能量：使O-H键和C-C键断裂之后，再形成C-O键和C-H键 3. 从热动力学上可行Bona fide demethylationBona fide demethylation+甲醇+甲醛+二氧化碳+琥珀酸盐5-甲基胞嘧啶/DNA糖基化酶5-甲基胞嘧啶/DNA糖基化酶1. MBD2b: MeCP2的同源蛋白质Indirect demethylationIndirect demethylationReplication-coupled DNA demethylationReplication-coupled DNA demethylation四、DNA甲基转移酶抑制剂四、DNA甲基转移酶抑制剂1. 核苷类DNA甲基转移酶抑制剂 2. 非核苷类DNA甲基转移酶抑制剂核苷类DNA甲基转移酶抑制剂核苷类DNA甲基转移酶抑制剂1. 5-azacytidine: 第一个发现的甲基化抑制剂。有细胞毒性，低剂量能够治疗白血病 2. 5-aza-2’-deoxycytidine: 诱导细胞增生的停止 3. Zebularine： 5-azacytidine的衍生物 4. FCDR：5-Fluoro-2'-deoxycytidine 4. 作用机理：在体内通过代谢形成三磷酸脱氧核苷，在DNA复制过程中代替胞嘧啶，与Dnmts具有很强的结合力 (suicide substrates)。核苷类DNA甲基转移酶抑制剂核苷类DNA甲基转移酶抑制剂1. EGCG: 绿茶中的聚苯复合物 2. RG108: 小分子，阻遏Dnmt的活性中心 (c) 4-amino-benzoic acid衍生物: Procainamide (d) Psammaplins (e) 寡聚核苷酸：MG98抑制剂的抑制机理抑制剂的抑制机理抑制剂的抑制机理抑制剂的抑制机理