蛋白质组技术实验手册

第一部分 组织和细胞蛋白样品的制备 第一部分 组织和细胞蛋白样品的制备 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 组织和细胞的来源： 1.1.2 仪器设备 机械组织匀浆器 低温高速离心机 (>40,000 g) 超速离心机 超生细胞破碎仪 超纯水装置 1.1.​ 3 试剂 三氯醋酸 (TCA) 丙酮 二硫苏糖醇 (DTT) 尿素 CHAPS PMSF EDTA 乙醇 磷酸 考马斯亮蓝R350 抑肽素A 亮肽素 ●试剂纯度均应是分析纯或以上。 1.1.4 溶液配制 (1)​ PBS： NaCl 8 g, KCl 0.2 g, Na2HPO4 1.44 g, KH2PO4，溶于800 ml水中，用HCl调pH至7.4，用纯水定容至1 L； (2)​ EDTA 储存液： 18.61 g Na2EDTA·2H2O，溶于70 ml纯水中，用10 mol/L NaOH调节pH值至8.0 (约需2 g NaOH颗粒)，定容为100 ml。可高压灭菌后分装备用； (3)​ 亮肽素储存液 (50 μg/ml，100×) 10 mg/ml溶于水，-75℃保存；使用时配成50 μg/ml储液，-20℃保存； (4)​ 抑肽素储存液 (70 μg/ml，100×) 1 mg/ml溶于甲醇，-75℃保存；使用时配成70 μg/ml储液，-20℃保存； (5)​ PMSF储存液 (10 mM, 100×): 17.4 mg PMSF，溶于1ml异丙醇中，-20℃ 保存。 (6)​ DTT 储存液 (1 M): 0.31 g DTT溶于2 ml H2O中，-20℃ 保存 (DTT或含有DTT的溶液不能进行高压处理，可过滤除菌)。 (7)​ 裂解液: Lysis buffer A (9 M urea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors) Final concentration Amount Urea (FW 60.06, Sigma, >99.5%) 9 M 10.8 g CHAPS (FW 614.89, Sigma, >98% 4% (w/v) 0.8 g Ultrapure H2O to 20 ml prepare fresh or store in aliquots at –20℃ A cocktail of protease inhibitors DTT(FW 154.25, Promega) 1% 13 μL/200 μL Lysis buffer (15.5×stock), -20℃ Lysis buffer B (7 M urea, 2 M thiourea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors) Lysis buffer C 40 mM Tris-base (pH 9.5) in ultrapure H2O Lysis buffer D (8 M urea, 4% CHAPS, 40 mM Tris(base), 40 ml) Final concentration Amount Urea (FW 60.06) 8 M 9.6 g CHAPS 4% (w/v) 0.8 g Tris base (FW 121.1) Ultrapure H2O to 20 ml prepare fresh or store in aliquots at –20℃ A cocktail of protease inhibitors DTT (FW 154.25, Promega) 1% 13 μL/200 μL Lysis buffer (15.5×stock), -20℃ Lysis buffer E (5 M urea, 2 M thiourea, 2% SB 3-10, 2% CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors) Final conc. Amount Urea 5 M 3.0 g Thiourea (FW 76.12) 2 M 1.52 g SB 3-10 (FW 307.5) 2% 0.2 g CHAPS 2% 0.2 g Ultrapure H2O to 10 ml A cocktail of protease inhibitors DTT (FW 154.25, Promega) 1% 13 μL/200 μL Lysis buffer (15.5×stock), -20℃ Lysis buffer F 100 μL SDS sample solution (1% w/v SDS, 0.375 M Tris-HCl, pH 8.8, 50 mM DTT, 25% v/v glycerol) ●CA、蛋白酶抑制剂混合物和DTT在临用前加入。 (8) 蛋白酶抑制剂混合物[3] 成分 终浓度 蛋白酶抑制剂混合物 PMSF 35 μg/ml or 1 mM EDTA 0.3 mg/ml (1 mM) 抑肽素 0.7 μg/ml 亮肽素 0.5 μg/ml 1.2 方法 1.2.​ 1组织蛋白提取方法 1.3.​  1.2.1.1 三氯醋酸/丙酮沉淀法 [1] (1)​ 冰上取材，称湿重，置液氮中冻存或直接进行下一步； (2)​ 在液氮中研碎样品或使用机械匀浆器磨碎组织； (3)​ 将粉末悬浮于含DTT (0.2% w/v)的10%三氯醋酸（w/v）的丙酮溶液中； (4)​ 蛋白–20℃沉淀过夜； (5)​ 35 000×g (6℃) 离心30 min； (6)​ 将沉淀重悬于含0.2% DTT的预冷丙酮中； (7)​ -20℃放置1 h； (8)​ 35 000×g (6℃) 离心30 min； (9)​ 在通风橱中让丙酮充分挥发，得到干燥的沉淀； (10)​ 在裂解液中重新溶解沉淀（50-100 mg 组织需要1 ml裂解液）； (11)​ 15℃, 40 000×g，离心1hr； (12)​ 用Bradford法[2]测定上清的蛋白浓度，分装后置–75℃保存。 1.2.1.2 超速离心法 (1)​ 取材； (2)​ 用研钵在液氮冷冻条件下将样品研成粉末，每1 g样品加入0.5 ml裂解液，使用组织匀浆器匀浆30 s； (3)​ 组织悬液15℃，10 000×g离心10 min； (4)​ 上清液4℃，150 000×g超速离心45 min； (5)​ 小心避开上层漂浮的脂质层，吸取离心上清6℃ 40,000g再次离心50 min； (6)​ 取离心上清。Bradford法定量，分装后置–75℃保存。 1.2.2 培养细胞蛋白提取 1.2.2.1循环冻融法 (1)​ 吸出培养液弃去，0.01 mol/L PBS洗一次； (2)​ 加入PBS，用橡胶刮收集细胞于10 ml离心管中； (3)​ 500×g，离心5 min； (4)​ 弃上清，PBS洗三次（室温,500× g，5 min）， (5)​ 在离心管中加入1ml PBS，重悬细胞，用1 ml 微量加液器移入Eppendorf管中； (6)​ 执行Biofuge存储程序8，500×g 5 min离心； (7)​ 用200 μl 微量加液器吸出PBS，弃去； (8)​ 吸干残留的PBS，估计样品体积，加入5倍体积裂解液，巴氏滴管混匀，液氮中反复冻融三次(每次置液氮中3 s， 室温融化)，DTT在第一次冻融后加入； (9)​ 执行Biofuge存储程序6，15℃，40 000×g，离心1hr (Biofuge)； (10)​ 上清Bradford法定量，沉淀-75℃保存备用。 1.2.2.2 超声破碎法 (1)​ 取对数生长期的细胞，吸出培养液弃去，0.01 mol/L PBS洗一次； (2)​ 加入PBS，用橡胶刮收集细胞于10 ml离心管中； (3)​ 室温，500× g，离心5 min； (4)​ 弃上清，PBS洗3次（室温,500× g，5 min）； (5)​ 在离心管中加入1ml PBS，重悬细胞，用1 ml 微量加液器移入Eppendorf管中，500× g离心5 min； (6)​ 吸干残留的PBS，估计样品体积，加入5倍体积裂解液，混匀，移入1.5 ml Eppendorf管中，冰浴中以最大功率超声破碎细胞（3×10 s）； (7)​ 15℃, 40 000×g，离心1hr (Biofuge)； (8)​ 上清Bradford法定量，沉淀-75℃保存备用。 2 结果和讨论 蛋白质提取的基本步骤包括清洗组织或细胞、裂解细胞、离心除去膜组分等获得溶解的蛋白质上清。 我们破碎细胞采用循环冻融法和超声波法；破碎组织采用液氮研磨法和机械匀浆法。循环冻融法操作简便，比较适合提取培养细胞的稳定蛋白，我们后期实验对培养细胞主要采取这种破碎方式。使用超声破碎必须注意的是控制强度在一定限度，即刚好低于溶液产生泡沫的水平。因为产生泡沫会导致蛋白质变性，同时要注意散热。匀浆是机体软组织破碎最常用的方法之一。由于匀浆过程中蛋白质被蛋白酶降解的可能性较小，所以匀浆是简便、迅速和风险小的组织破碎方法，我们实验室在破碎脑和脊髓组织时常用此法；由于神经组织比较柔软，液氮研磨法也很适合，本实验中我们使用了这一方法破碎大鼠脊髓组织，中枢神经组织由于富含脂类，沉淀法和高速离心法可以使蛋白和脂类干扰物质有效分离，但沉淀法的缺点是再溶解时蛋白损失严重。高速离心的缺点是需要样品量大，如Beckman L7- 65超速离心机的离心管容量为8 ml，不适用小量样品的制备。 在众多的裂解液配方中，我们主要采用9 M 尿素, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% 两性电解质加蛋白酶抑制剂混合物，原因是这一配方经长期使用很稳定，裂解效率也较高，非常适合小量细胞蛋白提取要求。针对富脂的中枢神经组织中脂类物质与蛋白相互作用，高浓度的尿素可以造成强变性条件(但如果再提高尿素浓度，尿素就容易析出，影响蛋白的溶解)，过量的去污剂也可以减少脂类的污染，两性电解质可以提高蛋白的溶解度，同时有利于等待聚焦。早期我们加入Tris碱以防止蛋白的水解，但是由于盐离子的引入，导致IEF电压过低，影响聚焦。 为了防止蛋白的酶解，我们使用了一种广谱的蛋白酶抑制剂混合物，成分见本实验1.1.4。 第二部分 第一向等电聚焦 (IEF) 等电聚焦（isoelectrofocusing, IEF）是60年代建立起来的蛋白质电泳分离技术，无论是载体两性电解质，还是固相pH梯度技术，其基本原理都是利用蛋白质分子或其他两性分子的等电点的不同，在一个稳定、连续和线性的pH梯度中进行分离和分析。 1. 材料与方法 1.1 仪器设备 仪器设备 生产商 IPGphor™等电聚焦仪 IPG凝胶条槽 Immobiline DryStrip 3-10L, 3-10NL DryStrip覆盖液 Amersham Pharmacia Biotech Amersham Pharmacia Biotech Amersham Pharmacia Biotech Amersham Pharmacia Biotech 1.2 试剂 试剂 尿素 CHAPS IPG缓冲液 DryStrip覆盖液 DTT Tris 溴酚蓝 甘油 叠氮钠 IPG凝胶条槽清洁液 1.3溶液配制 (1) 水合储液 (8 M urea, 2% CHAPS, 0.4% DTT and 0.5 % IPG buffer). 成分 终浓度 用量 尿素 (FW60.06) 8 M 12 g CHAPS 2% (w/v) 0.5 g 溴酚蓝 痕量 数粒 用纯水配成25 ml溶液，1 ml分装–20℃保存 以下的试剂在临用前加入 IPG buffer 0.5% (v/v) 2.5 μl (500 μl) DTT 0.4% 13 μl (500 μl) (2) SDS平衡缓冲液(50 mM Tris-Cl pH 8.8, 6 M尿素, 30% 甘油, 2% SDS, 溴酚蓝, 200 ml) 终浓度 用量 1.5 M Tris-Cl, pH 8.8 50 mM 6.7 ml 尿素 (FW 60.06) 6 M 72.07 g 甘油 (87% v/v) 30% 69 ml SDS (FW 288.38) 2% 4.0 g 溴酚蓝 痕量 数粒 加纯水至200 ml，10 ml分装–20℃保存 1.4方法 (1)​ 首先清洗凝胶条槽。先用清洗液清洗，再用纯水彻底冲洗，用棉拭子或无纤维纸擦干凝胶条槽或置于空气中或37℃烤箱中至干，整个过程需戴手套持凝胶条槽以避免污染（凝胶条槽在使用前必须是完全干燥的）； (2)​ 用棉球蘸纯水擦拭IPGphor冷却电极板, 再用干棉球揩干，检查仪器的电源接触和水平； (3)​ 取出-20℃保存的再水合液和-75℃保存的蛋白样品，置室温缓慢融化； (4)​ 用再水合液稀释样品。18 cm胶条终体积350 μl，11 cm胶条终体积200 μl。此步骤中需加入0.4%的DTT和0.5%的IPG buffer； (5)​ 在开始水合前10 min 取出干胶条使在室温中平衡； (6)​ 把凝胶条槽置于衬有滤纸的水平板上，加入含有样品的再水合液，戴上乳胶手套，轻轻揭去干胶条上覆盖膜，胶面朝下置槽中，反复提放，前后移动，使胶条与水合液充分接触，并排除气泡，滴加DryStrip覆盖液覆盖(11 cm 凝胶条槽 加1.5 ml, 18 cm 凝胶条槽加 2 ml)，加塑料盖，用滤纸吸去溢出的覆盖液，置凝胶条槽于IPGphor电极板上，注意电极接触并用直尺或三角尺调整方向使凝胶条槽与电极方向平行； (7)​ 盖下安全盖, 开启仪器, 检查程序设置，执行。我们在实验中使用的两种程序(18 cm pH3-10L胶条)如下 Table1. The running conditions of IPGhor A B Voltage (V) Time (h) Rehydration 30V 6:00 60V 6:00 200 (step & hold) 1:00 500 (step & hold) 1:00 1000 (step & hold) 0:30 8000 (gradient) 0:30 8000 (step & hold) 4:00 Voltage (V) Time (h) Rehydration 30 V 12:00 200 (step & hold) 1:00 500 (step & hold) 1:00 1000 (step & hold) 1:00 8000 (gradient) 0:30 8000 (step&hold) 4:00 (8)​ 等电聚焦完成后，IPG凝胶条可直接平衡后进行第二向电泳或置-75 ℃，可保存6个月。 2.​ 讨论 本实验室采用Amersham Pharmacia Biotech的IPGphor进行等电聚焦，凝胶条的水合和等电聚焦在同一容器中进行，内置8000V电源和恒温装置，是新一代的专用等电聚焦设备。由于采用分体的陶瓷条状电泳槽，节省了再水合液，而在采用再水合时同时上样（in-gel sample application）的技术，避免了样品杯的使用，从而避免在胶面某一点加样所致的蛋白沉淀，使分辨率、重复性和上样量都有很大的提高[4,5]。此外，电压升至8000伏，为原等电聚焦设备（MultiphorII）的2~3倍，聚焦时间也缩短为原来的1/3，提高了工作效率。 IPG-IEF已被证明有很好的分辨力和重复性，而且，这一技术在分辨力损失很小的情况下使更大量的微制备分离成为可能，这是过去的载体两性电解质等电聚焦做不到的。但是这些优秀的特性只对可溶性蛋白或是可溶性蛋白占多数的全细胞提取物有效，溶解性不佳的蛋白如膜蛋白会有严重的损失，主要的原因是这些蛋白对胶基质的吸附。同时带有游离巯基DTT在电场中带电，特别是在碱性pH处，在聚焦时DTT会迁移出梯度胶，起不到还原作用，导致一些蛋白特别是碱性蛋白的溶解性的降低。[6] 以下是Gorg推荐的IPGphor电泳条件，经实践证明效果很好。 Table 2. Running conditions using the IPGphor Gel length 180 mm Temp 20℃ Current max. 0.05 mA per IPG strip Voltage max. 8000V I Analytical IEF Reswelling 30V, 12-16 h Initial IEF 200V, 1h; 500 V, 1h; 1000V, 1h IEF to the steady state Gradient from 1000 V to 8000 V within 30 min; 8000 V to the steady state, depending on the pH interval used 1-1.5 pH units e.g. IPG 5-6… 8 h e.g. IPG 4-5.5 .. 8 h 3 pH units IPG 4-7 …4 h 4 pH units IPG 4-8 …4 h 5-6 pH units IPG 4-9 …4 h 7 pH units IPG 3-10 L … 3 h IPG 3-10 NL … 3 h 8-9 pH units IPG 3-12 … 3 h IPG 4-12 … 3 h II Micropreparative IEF Reswelling 30V, 12-16h IEF to the steady state focusing time of analytical IEF + additional 50% (approx.) 第三部分 第二向SDS-PAGE SDS电泳技术首先在1967年由Shapiro[Shapiro AL, Vinuela E, Maizel JV Jr. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1967 28: 815]等建立，其原理是在样品和聚丙烯酰胺凝胶中加入SDS和强还原剂如β-巯基乙醇后，破坏了蛋白质分子的二、三级结构，多肽链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束（protein-SDS micelles），所带负电荷远超过蛋白质分子原有的电荷量，从而消除了不同分子之间原有的电荷差异，同时胶束的长轴长度与蛋白亚基分子量的大小成正比。因此胶束的电泳迁移率主要取决于蛋白质或亚基分子量的大小。 1. 材料与方法 1.1设备和试剂 1.1.​ 1仪器设备 仪器设备 生产商 梯度混合器(2 × 15 ml) 0.5 mm厚带U形框的玻璃板 (200 × 260 mm2 ,125×260 mm2) 玻璃板 (200 × 260 mm2 、 125×260 mm2) 模具夹 GelBond®支持膜 (200 × 260 mm2) 长玻璃试管 (长度200 mm, 直径20 mm) 封口膜 水平摇床 Multiphor II水平电泳设备 EPS 3500 XL电源（最高 电压 3500 V） Multitemp II恒温循环器 Hoefor凝胶自动染色仪 Amersham Pharmacia Biotech Amersham Pharmacia Biotech Amersham Pharmacia Biotech Amersham Pharmacia Biotech 国产 美国 Parafilm 国产 Amersham Pharmacia Biotech Amersham Pharmacia Biotech Amersham Pharmacia Biotech 1.1.​ 2试剂 试剂 生产商 Repel silane 丙烯酰胺 甲叉双丙烯酰胺 Tris SDS TEMED 过硫酸铵 甘油 叠氮钠 DTT 碘乙酰胺 溴酚蓝 Amersham Pharmacia Biotech Sigma Sigma Sigma Sigma Fluka LTI 国产分析纯 Sigma Sigma Fluka 国产分析纯 1.1.3溶液配制 (1) 丙烯酰胺单体储液 (30% T, 3% C) 丙烯酰胺29.1 g，甲叉双丙烯酰胺0.9 g；加入60ml纯水搅拌完全溶解后，用纯水定容至100 ml，过滤置4℃可保存2周； (2) 浓缩胶储液: (0.5 M Tris-HCl, pH 6.8和 0.4 % (w/v) SDS (Laemmli 1970)) 6.05 g Tris，溶于80 ml纯水中，再加入0.4 g SDS，10 mg叠氮钠，用4N HCl调pH至pH 6.8，用纯水定容至100。此溶液可在4°C保存1月； 注: 浓缩缓冲液也可用分离缓冲液替代. (3) 分离胶储液: (1.5 M Tris-HCl, pH 8.8和 0.4% (w/v) SDS (Laemmli 1970)) 45.5 g of Tris，1g SDS，溶于200 ml纯水中，用4N HCl调节pH至8.8，用纯水定容至250 ml，加25 mg叠氮钠过滤后置4°C可保存1月； (4) 过硫酸铵: (40% (w/v)) 0.4 g过硫酸铵，加1ml纯水溶解。(此溶液须在临用前配制) (5) SDS平衡缓冲液 (50 mM Tris-Cl pH 8.8, 6 M尿素, 30% 甘油, 2% SDS, 痕量溴酚蓝, 200 ml) 终浓度 用 量 1.5 M Tris-Cl, pH 8.8 50 mM 6.7 ml 尿素 (FW 60.06) 6 M 72.07 g 甘油 (87% v/v) 30% 69 ml SDS (FW 288.38) 2% 4.0 g 溴酚蓝 痕量 数粒 加纯水至200 ml 10 ml分装，-20℃保存。 (6) SDS样品缓冲液 成分 用量 分离胶缓冲液 2 ml 溴酚蓝 0.1 mg 加纯水至20 ml 1.2方法 1.2.1 SDS凝胶的灌制 Figure 3. Casting gel 1.2.1.1模具的组装 (1)​ 用清洁剂清洗灌胶模具玻璃板，纯水淋洗后以一定倾角放在实验台上晾干； (2)​ 在带U形框的玻璃板上用擦镜纸均匀涂Repel-Silane ES，放置5-10 min； (3)​ 用滤纸吸去多余的Repel-Siliane ES (4)​ 先用无水乙醇后用纯水淋洗此玻璃板 (5)​ 用滤纸吸去水珠 (6)​ 在另一玻璃板上加少量纯水（大玻璃板加3.5 ml, 小玻璃板加2 ml），将GelBond支持膜疏水面向下铺在玻璃板上，上覆衬纸，用滚筒反复滚压使支持膜和玻璃板密切接触没有气泡，用滤纸吸去玻璃板上多余水分 (7)​ 将带U形框的玻璃板与覆支持膜的玻璃板合在一起，用模具夹固定（图），如此模具组合完毕，置4℃备用。 1.2.1.2灌制过程 (1)​ 先检查确认混合器的阀门和出液管的弹簧夹都处于关闭状态 (2)​ 按下配制溶液 a 水平SDS 13%T均一胶: 250×110×0.5 mm 成分 浓缩胶 T=6% 分离胶 T=13% 丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺 (ml) 1.2 7.8 分离胶缓冲液 (ml) 1. 5 4.5 87% 甘油 (ml) 2.4 (40%) 0.9 (5%) 纯水 (ml) 0.9 4.8 终体积 (ml) 6 18 在灌胶前加入下面两种成分 TEMED (μl) 3 9 40% APS (μl) 7.2 21.6 b 水平SDS 13%T均一胶: 250×180×0.5 mm 成分 浓缩胶 T=6% 分离胶 T=13% 丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺 (ml) 1.6 11.7 分离胶缓冲液 (ml) 2 6.75 甘油 (87%) (ml) 3.2 (40%) 1.35 (5%) 纯水(ml) 1.2 7.2 终体积 (ml) 8 27 在灌胶前加入下面两种成分 TEMED (μl) 4 13.5 40% APS (μl) 9.6 32.4 (3)​ 将分离胶缓冲液加入梯度混合器的混合腔，灌制大凝胶需27 ml，小凝胶需18 ml，加入转子置磁力搅拌器上轻微搅拌； (4)​ 在浓缩胶和分离胶溶液中分别加入TEMED (5)​ 在浓缩胶溶液中加入过硫酸铵，用玻璃棒混合均匀。 (6)​ 用尖嘴移液管吸取凝胶溶液加入预冷的模具中。大规格凝胶需6 ml (浓缩胶高度大约40 mm)，小规格凝胶需4.5 ml (浓缩胶高度大约30 mm)。 (7)​ 加入浓缩胶后，迅速在分离胶溶液中加入APS，用转子在混合腔中搅拌均匀。 (8)​ 将出液管口插入模具上缘中间的槽口 (9)​ 待转子搅拌充分混匀后，打开出液管弹簧夹，开始灌入分离胶溶液。搅拌的速度要尽量低以免含有SDS的溶液产生泡沫和气泡。此过程应在10 min内完成。在灌胶过程中凝胶溶液中出现的气泡可用剪成2 mm宽180 mm长的GelBond支持膜拨动，使其上浮，在灌胶期间的这种操作不影响凝胶的聚合。 (10)​ 灌胶完成后，迅速用巴氏滴管通过3个槽口在液面上滴加纯水覆盖，让膜具在室温静置15 min，然后移入50°C恒温孵箱中聚合30 min。聚合后的SDS凝胶可留在模具中或1 h后打开模具取出，置湿盒中室温过夜后使用。 1.2.3 IPG凝胶条的平衡 SDS 缓冲胶条 胶基质 规格 缓冲系统 阳极SDS缓冲胶条(100 ml, 15 ml×6) 阴极SDS缓冲胶条(100 ml, 15 ml**6) 聚合条件 聚丙烯酰胺（T-12%, C=3%） 长245 mm, 高 4.5 mm 5.45 g Tris ((FW: 121.14)) 0.4 g SDS 0.005 g 橙黄G 冰醋酸调pH 6.6 加纯水至60 ml，与40 ml 单体储液混合，加入50 ul TEMED, 120 ul APS, 灌制 9.7 g Tris (FW: 121.14) 14.3 g Tricine (FW: 179.20) 0.6 g SDS HCl调pH 7.1 加纯水至60 ml，与40 ml 单体储液混合，加入50 ul TEMED, 120 ul APS, 灌制 室温过夜 1.2.3 IPG凝胶条的平衡 (1)​ 将100 mg DTT溶于10 ml 平衡缓冲液中 即为平衡缓冲液I； (2)​ 将250 mg碘乙酰胺溶于10 ml 平衡缓冲液中 是为平衡缓冲液II； (3)​ 将完成聚焦或从-75℃取出的凝胶条置加入10 ml 平衡缓冲液I的试管中，用封口膜封住试管口，水平放置在摇床上振摇15 min。打开管口，取出凝胶条用纯水快速淋洗后置加入10 ml 平衡缓冲液I的另一试管中，同样方法振摇15 min； (4)​ 两步平衡完成后，用纯水快速淋洗胶面，侧放在提前润湿的滤纸上5-10分钟让多余的平衡液被滤纸吸收； 1.2.4 SDS-PAGE (1)​ 设定MultiTemp III恒温循环器的温度为15℃，清洁电极和冷却陶瓷板，检查并调节仪器水平； (2)​ 在IPG凝胶条平衡的第一步进行的同时，如SDS凝胶保存在模具中，此时可卸去夹子，将玻璃板平放，用分样匙铲形端插入支持玻璃板和支持膜之间小心撬动打开模具； (3)​ 此时凝胶与带U形框的玻璃板连在一起，捉住支持膜一角，将带支持膜的凝胶揭下；在MultiphorII冷却板上加煤油（小凝胶需1 ml；大凝胶需要2.5-3.0 ml），将凝胶铺在冷却板上，让胶面干燥5-10 min。注：避免凝胶支持膜和冷却板之间留有气泡，避免煤油污染凝胶表面。 (4)​ 此时平衡大约进行到第二步，撕开ExcelGel SDS缓冲条的包装，戴上一次性PE手套小心取出缓冲条。首先将黄色的阳性缓冲条放置在阳极侧（缓冲条长度与基本一致，约250 mm），缓冲条与凝胶表面应完全接触，没有气泡。阳极缓冲条阳极侧应在180 mm处；同法将放置阴极缓冲条，其阴极侧应与浓缩胶边缘平齐，左右两端也要与阳极缓冲调对齐 (5)​ 此时IPG凝胶条平衡已经完毕，用滤纸吸干胶条背面多余的水分，将胶面朝下将胶条放置距阴极胶条2-3 mm处（注意胶面接触处不可有气泡），酸性端距SDS凝胶右侧边缘30 mm，碱性端距左侧边缘40 mm。 (6)​ 将两张IEF上样滤纸片插入IPG胶酸碱性末端支持膜形成的间隙中，滤纸片应垂直IPG凝胶条垂直，与SDS凝胶表面接触良好，分别以一侧与IPG凝胶的酸碱性末端充分接触。 (7)​ 将剪去一半的IEF上样滤纸片放在距胶条碱性端10 mm处，加入10 μl SDS蛋白 (8)​ 预置带电极的玻璃板，调整正负电极位置分别在相应缓冲条的正下方，放置电极使与缓冲条接触。 (9)​ 盖上安全盖，打开电源，检查程序设置，执行第一步。当第一步完成时，溴酚蓝前沿一般离开IPG凝胶条8-10 mm。此时移去IPG凝胶条和所有的上样滤纸片，将阴极缓冲条前移至正好覆盖原IPG凝胶条所在处，然后开始第二步电泳，在溴酚蓝前沿抵达阳极缓冲条时再电泳10-20分钟结束。 Table 3. Running conditions of laboratory-made SDS homogenuous gels (13% T, 3% C) Small size SDS gel (250 × 110 × 0.5 mm) Voltage (V) Current(mA) Power (W) Time (h) Step1 100 20 30 0:20 Step2 400 30 30 2:00 Large size SDS gel (250 × 180 × 0.5 mm) Voltage (V) Current(mA) Power (W) Time (h) Step1 150 20 30 0:30 Step2 600 30 30 3:00 1.2.5染色 我们的染色是在自动染色仪上进行，溶液配制完成后，染胶工作完全自动。 Table 4. Silver staining Step Solution Step In Out Status Time (min) Fixing ethanol 400 ml (40%) acetic acid 100 ml(10%) add pure water up to 1000 ml 1 1 7 hold beep rock 60 Incubation 75 ml ethanol* 17 g Na-acetate Na2S2O3·5H2O 0.5 g or 0.4 g add pure water to 250ml or 200 ml 2 2 8 30 Washing pure water 3-5 0 7 5×3 Silvering AgNO3 0.5 g or 0.4 g add pure water to 250ml or 200 ml 6 3 9 20 Washing pure water 7-8 0 7 beep 1×2 Development 6.25 g Na2CO3 Formaldehyed 100 μl or 80 μl (1/10000) add pure water to 250ml or 200 ml 9 4 8 hold rock beep 6 -10 Stopping 100 ml acetic acid add pure water to 250ml or 200 ml 10 5 7 10 Washing pure water 11- 13 0 7 5×3 Preserving 87 ml glycerol add pure water to 250ml or 200 ml 14 6 7 hold 30 注:　*add Na-acetate first，then ethanol.； 2. 结果和讨论 2.1 SDS聚丙烯酰胺凝胶的灌制 在我们建立方法的早期，我们最先开始的就是灌制SDS聚丙烯酰胺凝胶，因为双向分离最终体现在第二向上，尽管有商品的预制胶但价格昂贵，每张18CM的预制胶市场价格可达60美圆。但实验室自制凝胶只需要简单的设备，使实验成本大大降低，我们的重复性实验使用自制的聚丙烯酰胺凝胶，仍旧得到很高的重复匹配率。 第二向APB公司推荐两种规格的小孔梯度SDS凝胶，ExcelGel 8-18和ExcelGel XL SDS 12-14，我们在实验早期灌制的就是小孔梯度胶。这是最早的小孔梯度胶配方[11]。 Table 5 . Recipes for the preparation of pore gradient gel (8-18%T) (C=3%, T=4%) Resolving gel (C=3%, T=8~18%) Dense Solution Light Solution Acrylamide/Bis 0.65 2.7 6 Gel Buffer 1.25 - - Gel Buffer - 2.5 2.5 87% Glycerol 1.4 2.8 - Ultrapure H2O (mL) 1.7 2.0 1.5 Final volume (mL) 4/16 9/36 9/36 TEMED (μL) 5 10 10 40% APS (μL) 3 5 5 我们在使用这一配方遇到的问题是，聚合后的凝胶在浓缩胶和分离胶接触的两侧出现弧线，开始认为原因是未预冷模具，导致浓缩胶过快聚合，最后与其他配方比较表明表明是浓缩胶的甘油浓度不够(24.4%)，导致浓缩胶液面在分离胶液体因重力作用的冲击形成弧形后没有足够的张力恢复到水平状态，因此我们提高了浓缩胶甘油含量。正当我们打算使用小孔梯度凝胶做第二向时，2000年11月APB公司在北京组织了一次双向电泳的讨论会，期间Dr. Reiner Westermeier向我们推荐使用SDS均一凝胶作第二向，同时指出使用小孔梯度凝胶，蛋白点过于集中阴极侧和中间，这和我们遇到的问题是一样的，这可能就是由于小孔梯度凝胶过强的分子筛效应造成的。后来我们改成均一凝胶。 根据样品的不同，可以调整T值，大鼠脊髓组织样品T=10%蛋白点分布较均匀，但一些小分子蛋白距前沿过近容易损失，我们一般采用T=12.5%和T=13%，这样的总百分浓度也适合于绝大多数的组织细胞样品。均一胶的配方在小孔梯度胶的基础上改进： a)​ 增加了浓缩胶甘油浓度，确定分离胶甘油浓度； b)​ 调整APS和TEMED的量； c)​ 将浓缩胶T值升至6，增加浓缩胶的分子筛效应； d)​ 灌制完成后分离胶上覆盖纯水，避免了外界空气对聚合的影响，同时消除了分离胶上聚合后出现的波浪状不平整现象。 使用改进后的配方灌制的SDS均一凝胶浓缩胶与分离胶分界平直，分离效果好，后期染色背景浅，蛋白点锐利。 2.2 IPG凝胶条的平衡 平衡的目的是用SDS和DTT覆盖和去除多肽的折叠，为第二向作准备，甘油和尿素的使用可以减小电内渗效应，多余的DTT被碘乙酰胺除去以阻止点的脱尾。 离液剂已知减弱SDS和蛋白的相互作用，可能是当存在于平衡液时，干扰蛋白与SDS结合的饱和度。 尿素-硫脲溶液是很有效的变性剂，但是在平衡时离液剂会削弱SDS和蛋白的相互作用[12]，特别是硫脲，所以硫脲的浓度不能超过2M 两步平衡时是造成蛋白损失的主要原因，大约7-10%的蛋白蛋白在此过程中损失，其中第一步的损失更大，凝胶条中的载体两性电解质可以有助于减少蛋白的损失。 Figure 4. Equilibration 2.3 硝酸银染色 在染色方面，考马斯亮蓝和硝酸银染色比较常见，后者的灵敏度比前者高50倍，但步骤较多，主要用于分析，而前者主要用于微制备，银染的强度存在不稳定的问题[13]，最近有人提出荧光染色可以解决这一问题[14] 第四部分 质谱鉴定 1. 材料与方法 1.1材料 银染脱色储存液 A: 100 mM硫代硫酸钠 银染脱色储存液 B: 30 mM铁氰化钾 10 ng/μl胰蛋白酶 50 mM碳酸氢铵 肽片断抽提液：5%三氟乙酸（TFA）, 50%乙腈（CAN） 2. 方法 2.1 脱色 2.1.​ 1考马斯兰染脱色 用解剖刀片沿染色边缘切下选定的蛋白点，用含50%乙腈，25mM碳酸氢氨的溶液50-100l浸泡胶片，涡旋混合器振荡20min，弃去溶液，重复1-2遍至胶片中的蓝色褪尽。胶片真空离心干燥。 2.1.2银染脱色 储存液A: 100 mM硫代硫酸钠，储存液B: 30 mM铁氰化钾 工作液：使用前1:1 混合储存液A:B 1.​ 按50 μl/蛋白点加入工作液，振摇； 2.​ 脱色至棕色消失，用纯水漂洗数次终止反应； 3.​ 加入100 μl 200mM碳酸氢铵，20 min后吸弃溶液； 4.​ 纯水漂洗数次终止反应，反复加入乙腈脱水至白色； 5.​ 凝胶真空干燥30 min。 2.2 胶内胰蛋白酶消化 a)​ 加入5-8 μl适量5-10 ng/μl 胰蛋白酶和50 mM 碳酸氢铵，37℃孵育过夜； b)​ 10-20 μl of 5%三氟乙酸50%乙腈溶液抽提肽片断，将抽提液真空干燥浓缩至4-5 μl 。 c)​ (可选) 使用美国Millipore公司的10 μlZipTipTMC18移液器吸嘴脱盐。操作如下:首先用50%的乙腈湿润吸嘴，然后用0.1%的TFA水溶液平衡两次，将萃取后冻干的样品用20 μl 0.1%TFA水溶液溶解，用吸嘴反复在样品液中吸进压出，进行多次循环操作，然后用0.1%TFA水溶液洗涤两次，另取一干净的小EP管吸入5 μl CCA饱和基质溶液(用50%CAN 0.1%TFA=1:1配制)，再将带有样品的吸嘴在其中反复洗脱, 取2 μl点于不锈钢点样板上，置空气中自然风干。｡ 胰酶用25mM碳酸氢氨溶液配成0.05-0.01l的溶液，分别加入样品5-8l，37℃保温反应20小时。 2.3.2肽混合物的提取 5%TFA 溶液120l于40℃保温1小时，吸出上清液，2.5% TFA、50%ACN溶液120l于30℃保温1小时，吸出上清液，合并上清液冰冻干燥。 2.3.3肽混合物的质谱分析 冰冻干燥后的样品管中加5l 0.5% TFA溶液，混匀后取1l 进行质谱分析。 2.3.4数据库检索 使用国际互联网上的蛋白质数据库检索程序：ExPASy Molecular Biology Server网站提供的PeptIdent。 英文缩略词表 英文 缩写 英文名称 中文名称 2-DE Two-dimensional gel electrophoresis 双向电泳 APS Ammonium persulfate 过硫酸铵 Bis N,N’-methylenebisacrylamide 甲叉双丙烯酰胺 BSA Bovine serum albumin 牛血清白蛋白 CA Carrier ampholyte 载体两性电解质 CHAPS 3-(3-cholamidopropyl)dimethyla- mmonio-1-propane sulfonate 3-[（3-胆酰胺丙基）-二乙胺]-丙磺酸 DPI Dot per inch 每英寸点数 DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇 FW Formula weight 分子量 IEF Isoelectric focusing 等电聚焦 IPG Immobilized pH gradient 固相pH梯度 LMW Low molecular weight 低分子量 kDa Kilodalton 千道尔顿 MALDI- TOF-MS Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry 基质辅助激光解析/电离—飞行时间质谱 OD Optical density 光密度 PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis 聚丙烯酰胺 凝胶电泳 PBS Phosphate buffered saline 磷酸盐缓冲液 pI Relative isoelectric point 相对等电点 PMF Peptide mass fingerprint 肽质量指纹谱 PMSF Phenylmethan-sulfonyl fluorid 苯甲基磺酰氟 SDS Sodium dodecyl sulfate 十二烷基磺酸钠 TCA Trichloroacetic acid 三氯醋酸 TEMED N,N,N’,N’-tetra- methylethylene-diamine 四甲基乙二胺 Vh Voltage hours 电压伏小时