RNA的琼脂糖凝胶电泳

RNA的琼脂糖凝胶电泳(图） 点击次数： 4325  发于：2008-08-11 00:00　转载请注明来自丁香园 来源：网络   一、实验目的 掌握植物总RNA非变性胶电泳的原理和方法。 二、实验原理 RNA电泳可以在变性及非变性两种条件下进行。非变性电泳使用1.0%--1.4%的凝胶，不同的RNA条带也能分开，但无法判断其分子量。只有在完全变性的条件下，RNA的泳动率才与分子量的对数呈线性关系。因此要测定RNA分子量时，一定要用变性凝胶。在需快速检测所提总RNA样品完整性时，配制普通的1%琼脂糖凝胶即可。 三、实验、器具及药品 蘑菇的总RNA溶液。 电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波炉，紫外透射检测仪等。 琼脂糖，1XTAE电泳缓冲液，0.5μg/ml溴化乙锭（EB）10X载样缓冲液。 四、实验步骤 （1）用1×TAE电泳缓冲液制作琼脂糖凝胶，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶。 （2）在超净工作台上，用移液器吸取总RNA样品4μl于封口膜上。在实验台上再加入5μl 1×TAE电泳缓冲液及1μl 的10X载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。 （3）打开电源开关，调节电压至100V，使RNA由负极向正极电泳，约30min后将凝胶放入EB染液中染色5min,用清水稍微漂洗。在紫外透射检测仪上观察RNA电泳结果。 RNA的变性琼脂糖凝胶检测 试剂： （1）MOPS缓冲液（10*）:0.4mol/L 吗啉代丙烷磺酸（MOPS）(Ph7.0)，0.1mol/L NaAc, 10mol/L EDTA。 （2）上样染料：50%甘油，1mmol/L EDTA ,0.4%溴酚蓝，0.4%二甲苯蓝。 （3）甲醛。 （4）去离子甲酰胺。v电泳槽清洗：去污剂洗干净（一般浸泡过夜）——水冲洗——乙醇干燥——3%H2O2灌满——室温放置10分钟——0.1%DEPC水冲洗。 操作： （1） 将制胶用具用70%乙醇冲冼一遍，晾干备用。 （2） 配制琼脂糖凝胶。 ①称取0.5g琼脂糖，置干净的100ml 锥形瓶中，加入40ml蒸馏水，微波炉内加热使琼脂糖彻底溶化均匀。 ②待胶凉至60--70 ℃，依次向其中加入9ml甲醛、5ml 10X MOPS缓冲液和0.5μ|溴化乙锭，混合均匀。 ③灌制琼脂糖凝胶。 （3） 样品准备： ① 取DEPC处理过的500μ|小离心管，依次加入如下试剂： 10x MOPS缓冲液2ul，甲醛3.5μ|,甲酰胺（去离子）10μ|，RNA 样品4.5μ|,混匀。 ② 将离心管置于60℃水浴中保10分钟，再置冰上2分钟。 ③ 向管中加入3μ| 上样染料，混匀。 （4）上样。 （5）电泳：电泳槽内加入1XMOPS缓冲液，于7.5V/ml 的电压下电泳。 （6）电泳结束后，在紫外灯下检查结果 总 RNA 的电泳检测，原来我使用 Lambda DNA/EcoR I （或者 Hind III）酶切 Marker，现在基本上不再用 Marker 了。指示剂一定是溴酚蓝加二甲苯氰，胶浓度 1-1.2%。加样后，开始电泳 (电压的选择的唯一依据是，我后面的时间安排。)。 溴酚蓝出孔 2-3cm 后终止电泳，紫外观察。首先能吸引我的一定是非常亮的位置(是否上样过量)，然后观察溴酚蓝到二甲苯氰之间的条带情况 (降解情况)，再就是加样孔 (杂质残留情况)，最后是 23kb 处是否有条带 (基因组 DNA 残留情况)。如果同时抽提的样品是多个，而且类似，在具体分析某一个问题样品前，要先综合一下该批次抽提的总的成败。如果全部有某现象，可能与试剂有关，也可能与样品有关，还可能与操作有关；如果只有部分有该现象，更可能与操作有关，少部分与样品有关 (先做的和后做的可能也有区别)。只有在宏观上有了一个概念，微观分析才有价值，才准确。 微观分析重点要看如下几个位置： 1    溴酚蓝偏下一点点。这个位置提供的是小片段 rRNA (5S 等)的信息及降解的辅助指标。有可能有，也可能没有。没有不是问题，因为柱子抽提方法及 TRIzol 的高盐沉淀方法，都会去除大部分小的 RNA 片段。 问题一：特别亮，宽度甚至超过了加样孔的宽度。特别亮首先提示上样量过大，而过大的上样量是很容易掩盖一些信息的，导致判读错误。不管能否看见大片段 RNA，也不管带型如何，碰到小片段非常亮的情况，最好大大降低上样量重新跑一次，再判读。 2    指示剂溴酚蓝到二甲苯氰之间或者上面一点点。这个位置提供的是大片段的 rRNA (28S/18S 等)完整性的信息。条带清晰弥散轻微，表示完整性好；否则表示完整性差。 问题一：比例达不到 2:1。条带亮度比例，没有必要太放在心上，因为比例不是非变性电泳的结论；同时，有些物种本身就不具备这样的比例 (从 DXY 上战友处首次学到)。关键是条带是否清晰，弥散少。 问题二：有多条带。多条带也不是问题，有些物种 – 如植物 – 本身就是有多条带。即使本身只“应该”有两条带的出现了多条带，也不要放在心上，因为这只是 RNA 的二级结构的一种体现 (如同质粒的构型)；同时，它不会对后续实验产生任何影响。 问题三：看不见条带。如果能看见小的片段 (或者其它泳道能看见)，以及小的片段不是非常亮，多提示降解；如果小片段非常亮，见 1。 问题四：有弥散。如果小片段不是非常亮，多提示降解；如果小片段非常亮，见 1。如果弥散同时也向加样孔方向发生，则还需要考虑电泳的问题和盐残留的问题，因为单纯的降解是不可能发生向上的弥散的。 问题五：非常亮的一大团，不成条带状。几乎都与上样过量有关，降低上样量重新跑一次，再判读。 许多人喜欢与精确的 DNA Marker 比对大小，来判断 RNA 的条带大小。这是有问题的，可能产生误导；我自己就碰到过 28S 在接近 2kb 位置，也有接近 1kb 位置的情况，这与胶浓度以及胶的生产厂家有关。你可以继续比对，但只是多一个参照物，多一个不严谨的参照物；更应该参照的是：如果在 1kb 左右有条带出现，理论上只有两种情况，一是 RNA 条带，二是凋亡的 DNA Ladder – 后者几乎碰不到。 3    23kb 处。这个位置提供的是基因组 DNA 残留量的信息。如果不使用 DNase I 处理，任何方法抽提的总 RNA 都残留有基因组 DNA，只是残留量的多少有区别。 问题一：条带可见，且无弥散。基因组 DNA 的残留，主要与方法/试剂有关，其次与样品使用量有关。柱子抽提方式，如果过程中没有使用苯酚，基因组 DNA 的残留量都是比较高的。TRIzol 及其它原理为酸性酚的方法/试剂出现基因组 DNA 的残留，多与样品过量有关；同时也与吸取上清的操作不当有关。 问题二：条带清晰，但有弥散。首先肯定是有基因组 DNA 的残留，但为什么会弥散？如果非常亮，弥散可以由上样过量导致。如果不是很亮，则看加样孔：加样孔不亮，提示高盐残留；加样孔很亮，则见下面。 4    加样孔。这个位置提供的是杂质残留的信息。导致加样孔发亮的原因非常多，其中最主要的是非蛋白质/非核酸类的大分子杂质 (如多糖、多酚) 的残留以及蛋白质和核酸的同步残留。大分子杂质的残留，首先与样品本身有关 (如植物、菌、动物肝脏、肺等)，其次与所使用的方法/试剂去除这些杂质的能力有关。蛋白质和核酸的同步残留，少量与样品有关 (如肌肉)，大部分则与所使用的方法/试剂，以及操作不当有关。另外，样品使用过量，也是一个重要原因。 5    弥散问题。这个问题可以出现在胶体的任何位置。一般讲，降解是向下弥散的；向上的弥散 (即拖尾) 多与上样核酸中的杂质有关。如果向下的弥散和拖尾同时出现，更可能的还是杂质残留的问题。当然，如果电泳体系出了问题，也会出现这样的现象的。 判读电泳照片，必须综合考虑，方能找准问题的方向。不要看了照片，像降解的就认为是降解；孔一亮，就认为是蛋白残留。总之，照片判读，是一个经验的活，有时候说都说不清楚。但是，多研读结果不好的照片，一定会对你今后带去很大的好处的。 RNA凝胶电泳试验 点击次数： 1047  发表于：2008-08-11 00:00　转载请注明来自丁香园 来源：丁香园   实验基本原理 RNA可以使用非变性或变性凝胶电泳进行检测。在非变性电泳中，可以分离混合物中不同分子量的RNA分子，凡是无法确定分子量。只有在变性情况下，RNA分子完全伸展，其泳动率才与分子量成正比。 判断RNA提取物的完整性是进行电泳的主要目的之一。完整的未降解的RNA制品的电泳图谱应可清晰看到18s rRNA、28s rRNA、5s rRNA的三条带，且28s rRNA的亮度应为18s rRNA的两倍。 实验试剂 1、0.1%DEPC水：200ml双蒸去离子水加0.2mlDEPC焦炭酸、二乙酯混匀，室温放置过夜，高压灭菌。 2、10x电泳缓冲液：吗啉代丙烷磺酸（MOPS）0.4mol/L（pH 7.0）；NaAc 0.1mol/L；乙二胺四乙酸(EDTA) 10mmol/L； 3、50mL变性琼脂糖凝胶（1%）：10x电泳缓冲液5 mL；琼脂糖0.5 g；0.1%DEPC水36.5 mL；加热溶解，稍冷却，加入8.5 ml 37%甲醛。 4、上样缓冲液：50%甘油，1mmol/LEDTA，0.4% 溴酚兰，0.4%二甲苯蓝。 5、甲酰胺（去离子）。 操作步骤 1、将制胶用具用70%乙醇冲洗一遍，晾干备用。 2、制胶：称取0.5g琼脂糖粉末，加入放有36.5mL的DEPC水的锥形瓶中，加热使琼脂糖完全溶解。稍冷却后加入5ml的10x电泳缓冲液、8.5ml的甲醛。然后在胶槽中灌制凝胶，插好梳子，水平放置待凝固后使用。 3、加样：在一个洁净的小离心管中混合以下试剂：电泳缓冲液（10x）2μl、甲醛3.5ml、甲酰胺10ml、RNA样品3.5μl。混匀，置60℃保温10min，冰上速冷。加入3μl的上样缓冲液混匀，取适量加样于凝胶点样孔内。同时点RNA样品。 4、电泳：打开电泳仪，稳压7.5V/cm电泳。 5、电泳结束后通过紫外透视仪观察。 注意事项 本实验中必须保持RNase污染以免RNA降解。所有试剂用DEPC水配制，用具也用DEPC水冲洗，并灭菌。 D603 10×Loading Buffer 制品说明本制品是用于琼脂糖凝胶电泳的10倍浓度的核酸样品用Loading Buffer。制品中含有SDS，可即刻停止各种酶促反应。向酶促反应液中加入1/10量的本制品，即可停止反应，此溶液可直接用于琼脂糖凝胶电泳。本制品中含有色素溴酚蓝（Bromophenol Blue），可以观察电泳的进行情况。溴酚蓝在琼脂糖凝胶（0.5%～1.4%）中约与300 bp的双链线状DNA的迁移速度相同（在0.5×TBE中）。本缓冲液配制组成合理，缓冲液中不含核酸酶（DNase或RNase），特别适用于各种酶促反应的停止以及各种酶促反应后的琼脂糖凝胶电泳。一般来说，各种限制酶、修饰酶的酶促反应后电泳时，常使用本制品。使用方法 向9 ul酶促反应液中加入1 ul的10×Loading Buffer，可以即刻停止反应，此溶液可直接用于琼脂糖凝胶电泳 D604 6×Loading Buffer 制品说明本制品是琼脂糖/聚丙烯酰胺凝胶电泳用的6倍浓度的核酸样品用Loading Buffer。向电泳样品溶液中加入1/5量即可进行凝胶电泳。本制品中含有色素溴酚蓝（Bromophenol Blue）、二甲苯胺蓝（Xylene Cyanol FF），可以观察电泳的进行情况。溴酚蓝在琼脂糖凝胶（0.5%～1.4%）中约与300 bp的双链线状DNA的迁移速率相同（在0.5×TBE中），而二甲苯胺蓝FF则与4 kbp的双链线状DNA的迁移速率相等。溴酚蓝与二甲苯胺蓝在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速率则随凝胶浓度的改变而不同. 本缓冲液配制组成合理，缓冲液中不含核酸酶（DNase或RNase），泳带清晰，是实验室常用的凝胶电泳上样用缓冲液。一般来说，PCR反应后的琼脂糖凝胶电泳以及短链DNA的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，常使用本制品。使用方法 向5ul的电泳样品溶液中加入1 ul的6×Loading Buffer，即可进行凝胶电泳。 A164 A165　CA181-1是产品的lot NO.你看一下是哪一种Loading Buffer。 宝生物没有用于SDS-PAGE凝胶电泳,蛋白质上样用的loading buffer出售，配方你可以参看公司2004-2005年产品目录的N-5内容。