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蛋白质的结构

2010-11-11 50页 ppt 7MB 141阅读

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蛋白质的结构nullnull 蛋白质的结构蛋白质是由一条或多条多肽(polypeptide)链以特殊方式结合而成的生物大分子。 蛋白质与多肽并无严格的界线,通常是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。 蛋白质分子量变化范围很大, 从大约6000到1000000道尔顿甚至更大。null一 級 構 造四、蛋白质的结构四 級 構 造二 級 構 造三 級 構 造Nelson & Cox (2000) Lehninger Principles of Biochemistry (3e) p.129null蛋白质的一级结构又称初级...
蛋白质的结构
nullnull 蛋白质的结构蛋白质是由一条或多条多肽(polypeptide)链以特殊方式结合而成的生物大分子。 蛋白质与多肽并无严格的界线,通常是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。 蛋白质分子量变化范围很大, 从大约6000到1000000道尔顿甚至更大。null一 級 構 造四、蛋白质的结构四 級 構 造二 級 構 造三 級 構 造Nelson & Cox (2000) Lehninger Principles of Biochemistry (3e) p.129null蛋白质的一级结构又称初级结构,是指氨基酸的种类,连接方式以及氨基酸在肽链中的排列顺序,如: H2N-CH-CO ─NH-CH-CO─ NH-CH-CO---------NH-CH-COOH | | | | R1 R2 R3 Rn氨基-末端羧基-末端氨基酸残基 (w=120)null --------S--------S------ A链:HGly.Ile.Val.Glu.Gln.Cys.Cys.Ala.Ser.Val.Cys.Ser.Leu.-Tyr.Gln.---Cys.AsnOH 1 | 8 11 | 21 S S | | S S | | B链HPhe.Val.Asn.Gln.His.Leu.Cys.Gly.Ser.His.Leu.Val.Glu.Ala.-------Cys---AlaOH 1 7 19 30 二硫键二硫键2、一级结构或氨基酸顺序测定 (1)一般步骤:测定蛋白质分子中多肽链的数目,即根据蛋白质末端残基的摩尔数和蛋白质分子量确定多肽链数目;拆分蛋白质分子中的多肽链;测定每一条多肽链的氨基酸组成;测定N-端和C-端;打开链内二硫键;用不同的方法降解多肽链以得到不同的肽段;测定不同肽段的氨基酸顺序;重叠拼凑出肽链的顺序;确定二硫键的位置。nullF. Sanger (1951, Cambridge U) Insulin 胰岛素 (A, B chains)以传统氨基酸定序法決定蛋白质序列Nelson & Cox (2000) Principles of Biochemistry (3e) p.142 B-chain A-chainnulla、样品必需纯(>97%以上); b、知道蛋白质的分子量; c、知道蛋白质由几个亚基组成;(1)测定蛋白质一级结构的要求null (2) 测定步骤A.测定蛋白质分子中多肽链的数目。 通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系,即可确定多肽链的数目。蛋白质一级结构的测定null (2)测定步骤B.多肽链的拆分。 由多条多肽链组成的蛋白质分子,必须先进行拆分。 蛋白质一级结构的测定null ( 2) 测定步骤B.多肽链的拆分。 几条多肽链借助非共价键连接在一起,称为寡聚蛋白质,如,血红蛋白为四聚体,烯醇化酶为二聚体;可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理,即可分开多肽链(亚基). 蛋白质一级结构的测定null (2) 测定步骤C.二硫键的断裂 几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下,用过量的-巯基乙醇(还原法)处理,使二硫键还原为巯基,然后用烷基化试剂(ICH2COOH)保护生成的巯基,以防止它重新被氧化。 蛋白质一级结构的测定SH-CH2-CH2-OHnull (2) 测定步骤可以通过加入盐酸胍方法解离多肽链之间的非共价力;应用过甲酸氧化法拆分多肽链间的二硫键。蛋白质一级结构的测定ssHcoooHSO3HSO3Hnull 作用:这些反应可用于巯基的保护。巯基(-SH)的保护nullSSSSSS胰岛素HO-CH2-CH2-SHSHSHSHSHSHSHSCH2C00HSCH2C00HSCH2C00HSCH2C00HSCH2C00HSCH2C00HICH2COOHnull (2) 测定步骤 D.分析多肽链的N-末端和C-末端。 多肽链端基氨基酸分为两类:N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸。 在肽链氨基酸顺序分析中,最重要的是N-端氨基酸分析法。 蛋白质一级结构的测定nullSanger法。2,4-二硝基氟苯在碱性条件下,能够与肽链N-端的游离氨基作用,生成二硝基苯衍生物(DNP)。 在酸性条件下水解,得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。 末端基氨基酸测定二硝基氟苯(DNFB)法null在碱性条件下,丹磺酰氯(二甲氨基萘磺酰氯)可以与N-端氨基酸的游离氨基作用,得到丹磺酰-氨基酸。 此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质,检测灵敏度可以达到110-9mol。 末端基氨基酸测定丹磺酰氯法null(2)蛋白质N-末端和C-末端的测定 用于N-末端测定的方法很多,下面介绍几种最常用的方法: 二硝基氟苯(DNFB或FDNB)法:多肽链或蛋白质的游离氨基与该试剂反应生成DNP-多肽或DNP-蛋白质。经降解可产生黄色的DNP-氨基酸和游离的氨基酸,只要鉴别DNP-氨基酸就可确定氨基末端。 丹磺酰氯(DNS)法:丹磺酰氯是二甲氨基萘磺酰氯 (dimethylaminonaphthalene sulfonyl chloride)的简称,缩写为DNS。方法的原理与DNFB法相同,只是用DNS代替DNFB试剂。此法的灵敏度比前者高100倍,并且降解后的DNS-氨基酸不需要提取,可直接用纸上电泳加以鉴定。 异硫氰酸苯酯(PITC)法:原理与前面的基本相同。即反应后产生的PTH-氨基酸可用不同的方法加以鉴定。 氨肽酶法:根据不同的反应时间测出酶水解所释放的氨基酸种类和数量,按反应时间和残基释放量作动力学曲线,就可知道该蛋白质的N-末端残基顺序。实际上此法有许多困难,因为酶对各种肽键的敏感性不一样,常常难以判断哪个残基在前,哪个在后。null氨肽酶是一种肽链外切酶,它能从多肽链的N-端逐个的向里水解。 根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量,按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线,从而知道蛋白质的N-末端残基顺序。 最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶,水解以亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。末端基氨基酸测定氨肽酶(amino peptidases)法nullC-末端测定法 肼解法:它是目前测定C-末端残基最重要的方法。蛋白质或多肽与无水肼加热发生肼解,反应中除C末端氨基酸以游离形式存在外,其它的氨基酸都转变为相应的氨基酸酰肼化物。 此产物可与苯甲醛作用变为水不溶性的二苯基衍生物而沉淀。上清液中的游离氨基酸借助于FDNB或DNS法加以鉴定。肼解过程中,谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸等被破坏不易测出,C末端的精氨酸转变为鸟氨酸。反应如下: H2N—CH—C—NH……C—NH—CH—C—NH—CH—COOH O O O R1 R(n-1) Rn无水NH2NH2100℃H2N—CH—C—NHNH2+H2N—CH—C—NHNH2+H2N—CH—COOH OO R1 R(n-1) Rn(n-1)个氨基酸酰肼 C-末端氨基酸null还原法:C末端也可以用硼氢化锂还原成相应的α-氨基醇。肽链完全水解后,代表原来C末端氨基酸的α-氨基醇可用层析法加以鉴别。 羧肽酶法:此法最常用。它是外切酶,它专一地从肽链的C端逐个水解,释放出游离氨基酸。释放的游离氨基酸数目与种类随反应时间而变化。根据释放的氨基酸量(摩尔数)与反应时间的关系便可以知道该肽链的C末端氨基酸顺序。当然有时判断也存在困难。 羧肽酶有四种,A、B、C和Y。应用较多的是A和B,A能作用于Pro、Arg、Lys之外的所有C-末端残基;B只水解以碱性氨基酸为末端残基的肽键。氨基酸的释放量反应时间Gly Ser Val羧肽酶测定C末端残基及C末端顺序的示意图解: Val-Ser-Glynull二硫键的断裂和多肽链的分离 含多条肽链的寡聚蛋白:可用变性剂如8摩尔/L尿素或6摩尔/L盐酸胍处理即可拆开,如血红蛋白等。 含二硫键的蛋白质:可用过量的β-巯基乙醇处理(PH8-9,室温放置数小时),可以使—S—S—定量还原为—SH。与此同时反应系统中还必须有8摩尔/L尿素或6摩尔/L盐酸胍存在,而使蛋白质变性。最后用烷基化试剂保护还原时生成的半胱氨酸上面的巯基,以防止它重新被氧化。如胰岛素经还原后用碘乙酸保护,即可得到A链和B链的羧甲基衍生物。 氨基酸组成的测定 用于蛋白质的氨基酸组成测定的水解方法主要是酸水解,同时辅以碱水解。酸水解使用最广泛的是盐酸,一般用6摩尔/L 盐酸于110℃在真空的或充氮的安培瓶内进行水解10-24小时,水解后除去盐酸。此种方法可破坏全部的色氨酸,部分的丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸;同时天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被水解下来,生成相应的游离氨基酸和铵离子。为测定色氨酸含量可用碱水解(5摩尔/L的氢氧化钠,110 ℃,20小时)定量色氨酸。 近几年来用甲基磺酸代替盐酸水解蛋白质已被广泛应用。null (2)测定步骤E.多肽链断裂成多个肽段,可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片,并将其分离开来。 蛋白质一级结构的测定多肽链断裂法:酶解法和化学法 裂解时的要求:断裂点少,专一性高,反应产率高。nullTrypsinase :R1=Lys和Arg侧链(专一性较强,水解速度快)。R2=Pro 水解受抑。肽链水解位点胰蛋白酶null或胰凝乳蛋白酶(Chymotrypsin):R1=Phe, Trp,Tyr时水解快; R1= Leu,Met和His水解稍慢。 R2=Pro 水解受抑。肽链水解位点糜蛋白酶nullPepsin:R1和R2=Phe, Trp, Tyr; Leu以及其它疏水性氨基酸水解速度较快。 R1=Pro 水解受抑。肽链水解位点胃蛋白酶nullthermolysin:R2=Phe, Trp, Tyr; Leu,Ile, Met以及其它疏水性强的氨基酸水解速度较快。 R1或R3=Pro 水解受抑。 R2=Pro或Gly 水解受抑。肽链水解位点嗜热菌蛋白酶null谷氨酸蛋白酶: R1=Glu、Asp(磷酸缓冲液); R1=Glu (磷酸缓冲液或醋酸缓冲液) 精氨酸蛋白酶: R1=Arg肽链水解位点谷氨酸蛋白酶和精氨酸蛋白酶null 化学法:可获得较大的肽段 溴化氰(Cyanogen bromide)水解法,它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。 多肽链的选择性降解null 化学法:可获得较大的肽段 羟胺(NH2OH):专一性断裂-Asn-Gly-之间的肽键。也能部分裂解-Asn-Leu-之间的肽键以及-Asn-Ala-之间的肽键。 多肽链的选择性降解null经断裂得到的肽段可用凝胶过滤、凝胶电泳、离子交换、液相色谱等方法分离提纯。null肽段的氨基酸顺序测定 肽的氨基酸测定主要使用Edman降解法,此外还有酶解法、酶解-肽谱重叠法以及气谱-质谱联用法等。 Edman化学降解法:此法是P. Edman于1950年首先提出来的,最初用于N-端分析,即异硫氰酸苯酯(PITC)法。 Edman降解试剂(PITC)与多肽链的游离末端氨基作用,降解反应可分三步: 苯环-N=C=S+H2N—CH—C—NH—肽 PITC R1 O ↓(PH=9) 苯环-NH—C—NH—CH—C—NH—肽 (PTC-肽:苯氨基硫甲酰肽) S R1 O 反应在弱碱性介质中进行,因为PITC只能与未质子化的—NH2起作用。 第二步是环化断裂反应: 第一步反应中形成的PTC-肽在无水强酸介质如三氟乙酸中,最靠近PTC基的肽键将发生断裂,同时PTC-氨基酸残基环化成噻唑啉酮苯胺衍生物:null CF3COOH(无水) PTC-肽————————→苯环-NH—C——S + H3N+—HC—C—NH—肽 R O HN+ C=O (减少一个残基的肽) CH R1 (ATZ:噻唑啉酮苯胺) ATZ不稳定,难于用来鉴定氨基酸,因此在酸性水溶液中将它转变为PTH-氨基酸。转化过程实际又分两步进行,首先水解生成PTC-氨基酸,然后环化成PTH氨基酸: ATZ(在1M/L 盐酸中) →苯环—NH—C—NH—CH—C—OH S R1 O ← (PTC—氨基酸) ↓( 1M/L 盐酸) 苯环—N——C=S O=C NH PTH—氨基酸(苯乙内酰 CH—R1 硫脲氨基酸)nullEdman (苯异硫氰酸酯法)氨基酸顺序分析法实际上也是一种N-端分析法。此法的特点是能够不断重复循环,将肽链N-端氨基酸残基逐一进行解离。 Edman氨基酸顺序分析法PTH—氨基酸null PTH—氨基酸是一个非常稳定的化合物。所有的PTH—氨基酸在紫外区有强吸收,最大值在268nm处。PTH—氨基酸可利用各种层析技术分离。由于PITC与肽链的游离α末端氨基结合后,只是减弱紧挨PTC基的末端残基羧基侧的肽键,因此在无水酸作用下,只切下与PITC反应的那个氨基酸残基。这时剩下的减少了一个残基的肽链便在它的N端暴露出一个新的游离α末端氨基,又可参加第二轮反应,然后再切下第二个残基,依此循环。进行n轮反应就可测出n个残基的顺序。 Edman降解法现已有多种改进形式(如DNS-Edaman测定法),这里不再阐述。 Edman降解法测定顺序操作程序非常麻烦,工作量大。蛋白质顺序仪的出现即免除了手工测定的麻烦,又满足了蛋白质微量顺序分析的需要。该仪器灵敏度极高。 酶解法 利用外切酶。可跟随酶水解的过程分别定量测出释放的氨基酸,便能确定肽的顺序。然而这种方法实际上有许多困难,局限性很大,它只能用来测定末端附近很少几个残基的顺序。 气谱—质谱联用法:是一种很有发展前途的方法。 另现在用测定核酸的顺序推测蛋白质的顺序也是当前很有发展前途的一种方法。null 测定每条多肽链的氨基酸组成蛋白质一级结构的测定nullnull肽段在多肽链中次序的决定 一般采用的是重叠拼凑法(举例:10肽)。 二硫键位置的确定 一般采用的是用胃蛋白酶水解原来的含二硫键的蛋白质。这是因为它的专一性比较低,切点多,这样生成的肽段包括含二硫键的肽段都比较小,对后面的分离、鉴定比较容易;再就是胃蛋白酶的作用PH在酸性范围(2左右)这有利于防止二硫键发生交换反应而造成的麻烦。所得到的肽段混合物可以用Brown和Hartlay的对角线电泳技术进行分离。对角线电泳是:水解后的肽段点在滤纸的中央,在PH6.5的条件下进行第一向电泳,肽段将按其大小及电荷的不同而分离开。然后将滤纸暴露在过甲酸蒸气中,使 —S—S—断裂。此时每个含二硫键的肽段被氧化成一对含半胱氨磺酸的肽。滤纸旋转90度角进行第二向电泳。因大多数肽段的迁移率未变,并将位于滤纸的一条对角线上,而含半胱氨磺酸的成对肽段比原来含二硫键的肽小而负电荷增加,结果它们偏离了对角线。肽斑可用茚三酮显色确定。将每对含半胱氨磺酸的肽段(未显色的)分别取下,进行氨基酸的顺序分析,然后与多肽链的氨基酸顺序比较,即可推断出二硫键在肽链间或肽链内的位置 null+——+第一向第二向AB一个含二硫键的肽断裂产生的肽段对角线电泳图解null由核酸序列推出蛋白質序列核酸序列閱讀方向Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p.506null(二)蛋白质的二级结构与纤维状蛋白 构型与构象 1.构型(configuration):指在立体异构体中取代原子或基团在空间的取向。两种构型间的转变需要共价键的断裂和重组。 COOH COOH H2N C H H C NH2 R R 2.构象(conformation):指取代原子或基团当单键旋转时可能形成的不同立体结构。这种空间位置的改变不涉及共价键的断裂。nullHHHHHHHHHHHH纽曼透视结构式null 研究构象的方法 目前还没有一种工具能够用来直接观察蛋白质分子的原子和基团的排列。现取得的成就主要是利用X-射线衍射法(X-ray diffraction method)取得的。 X-射线衍射技术与光学显微镜或电子显微镜技术的基本原理是相似的。但存在着差别:(1)光源不是可见光而是波长很短的X-射线(=0.154nm)(2)经物体散射后的衍射波,没有一种透镜能把它收集重组成物体的图像,而直接得到的是一张衍射图案(djffraction pattern)。衍射图案需用数学方法(如电子null计算机)代替透镜进行重组,绘出电子密度图,从中构建出三维分子图像——=分子结构模型。 X-射线衍射法只能用于测定晶体结构,并且不能直接测定单个分子的结构,因为要想获得蛋白质的三维图像,就必须从所有可能的角度对蛋白质进行观测。 其它方法:利用重氢交换法可以测定蛋白质分子中α-螺旋的含量;核磁共振光谱法可以测定蛋白质分子中哪个氨基酸残基发生构象变化;圆二色性可用来测定α-螺旋和β-折叠片的含量;荧光偏振可测定疏水微区、色氨酸或酪氨酸微区;喇曼光谱用于研究主链构象等。3.多肽链折叠的空间限制 肽键的实际结构是一个共振杂化体。由于氧电子离域形成了包括肽键的羰基氧、羰基碳和酰胺氮在内的O—C—N 轨道系统,因此主链肽键C—N具有双键性质而不能自由旋转,结果肽键的所有4个原子和与之相连的两个α-碳原子都处于同一个平面内,此刚性的结构平面称肽平面或酰胺平面(见下页图)。 null蛋白质多肽链空间折叠的限制因素:Pauling和Corey在利用X-射线衍射技术研究多肽链结构时发现: 1.肽键具有部分双键性质:C-N单键键长0.149nm C=N双键键长0.127nm 肽键键长0.132nm 2.肽键不能自由旋转 3.组成肽键的四个原子和与之相连的两个碳原子 (C)都处于同一个平面内,此刚性结构的平面叫肽平面(peptide plane)或酰胺平面(amide plane)。 null 兩個胜肽平面之間不能任意轉動Garrett & Grisham (1999) Biochemistry (2e) p.161Nelson & Cox (2000) Lehninger Principles of Biochemistry (3e) p.165+-nullΨ角Φ角null肽主链上的重复结构称肽单位或肽基,每一个肽单位实际上就是肽平面。肽平面内的C=O与N—H呈反式排列,各原子间的键长和键角都是固定的。在平面中,Cα—N1键和Cα—C2键是单键,能自由旋转。绕Cα—N1键旋转的角度称φ角,绕Cα—C2 旋转的角度称ψ角(下图)。原则上, φ和 ψ可以取-1800—+1800之间的任一值,这样,多肽链的所有可能的构象都能用这两个构象角(称二面角)来描述。 null二面角的概念角角二面角(构象角)null 当φ的旋转键N1-Cα两侧的N1-C1和Cα -C2呈顺式时,规定φ=00,同样, ψ的旋转键Cα -C2两侧的Cα-N1和C2-N2呈顺式时,规定ψ =00。从Cα向N1看,沿顺时针方向旋转Cα-N1键所形成的φ角度规定为正值,反时针旋转为负值;从Cα向C2看,沿顺时针方向旋转Cα -C2键所形成的ψ角度规定为正值,反时针旋转为负值。N2C2OOC1N1HHRH相当于φ=00,ψ =00时的构象。其实,此图像并不存在,因为相邻平面的H原子和O原子之间的空间重叠。若同时旋转1800,则转变为完全伸展的构象。 Φ角Ψ角为α碳原子null蛋白质中非键合原子之间的最小接触距离(A) CNOHCNOH 3.20 (3.00) 2.9 (2.80) 2.8 (2.70) 2.4 (2.20) 2.7 (2.60) 2.7 (2.60) 2.4 (2.20) 2.7 (2.60) 2.4 (2.20) 2.00 (1.90)o
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