肾移植中的系统生物学研究

国际泌尿系统杂志 2007年3月第 27卷第2期 International Journal ofUrology and Nephrology。Mar2007，Vo1．27 NO．2 171 肾移植中的系统生物学研究‘ 杨浩” 综述 陈江华 审校 【摘要l 近几年来，系统生物学在移植领域中的应用掀起了一轮热潮。特别是借助高通量的生物芯 片技术。我们能够对移植物各种病理状态进行快速、定量的研究。本文就系统生物学中在肾移植领域应用较 多的转录组学及蛋白组学作一综述。 【关键词】 肾移植；蛋白质类 【中图分类号]R699．2 【文献标识码] A 【文章编号]1673-4416(2007l02-0171-03 l 关于系统生物学 以前在器官移植领域的研究大多集中在单个基 · 综 述 · 因、单个蛋白的研究，但是，疾病的过程往往是多基 因、多蛋白参与的复杂过程，所以上升到系统的水 组织芯片技术在肿瘤研究中应用较多，在肾移植的 研究中还处于起步阶段。但组织芯片技术为研究肾 移植排斥反应提供了一个崭新的平台，有着广泛的 临床应用前景。 3 结语 生物芯片技术是20世纪9o年代中期以来影响 最深远的重大科技进展之一，该技术将极其大量的 探针同时固定于支持物上，具有高通量和微型化等 特点，所以一次可以对大量的生物分子进行检测分 析，从而解决了传统技术复杂、自动化程度低、检测 目的分子数量少、低通量 (1ow through—put)等不 足。 肾移植排斥反应机制复杂，影响因素众多，诊断 方法单一，治疗不，疗效差异大，这些均迫切需 要对排斥反应机制进行全面深入的研究。而生物芯 片这一新兴、高效率的技术则成为研究肾移植排斥 反应的强有力工具。可以大胆预测，通过生物芯片 技术的研究在不远的将来，早期诊断肾移植排斥反 应的基因或蛋白标志物将应用于临床，通过血液、尿 液进行无创性诊断将成为可能、免疫抑制药物个性 化会得到突破。 参 考 文 献 i Merrill JP．Murray JE，Harrison JH，et a1．Successful homotrans- plantation of the human kidney between identical twins．JAMA，1956， 160(4)：277—282． 2 Sijpkens YW．Doxiadis n。Mallat 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、转录水平、蛋白质水平、代谢水平等)或同一水 平的分子之间的联系或特殊的相互作用，从而建立 能够显示突现性行为、突现性规律的复杂系统，这 种复杂系统会出现一些一个单独系统所不能反映的 新行为。系统生物学的这些优点使它在医学领域发 挥着巨大的作用。 建立在印迹和杂交技术基础上的高通量生物芯 片的应用，使得我们能够对转录组(mRNA水平)、 蛋白组(蛋白质水平)以及代谢组(代谢水平)的信 息进行整体的监测。并且把这些信息整合起来，从 宏观的角度了解疾病的发生、发展和转归。在移植 领域，系统生物学的研究主要集中在转录组学和蛋 白组学两个方面。代谢组学在移植领域的研究相对 于转录组和蛋白组相对较新。但是随着毛细管电 泳、高效液相色谱、高通量核磁共振分光计及各种软 件技术的发展，使我们能够同时对成百上千种代谢 产物进行测量 ¨ ，代谢组学的研究也有了很大的 发展。代谢产物在生理或病理状态下的改变能够在 几分钟甚至几秒钟反映出来，所以有着相当大的应 用价值，但是免疫抑制药物的使用和慢性感染对代 谢产物的影响较大以及对许多代谢产物的认识不够 深入 J，也一定程度上阻碍了它在移植中的应用。 2 转录组学与肾移植 转录组学的研究主要是通过基因芯片来实现。 基因芯片技术是在分子杂交和印迹技术上发展起来 的。把多种已知序列的 DNA排列在固体支持物 (如玻片)上，利用碱基配对原理，与样品中的核酸 分子进行杂交，可以同时对样品中多种类核酸进行 检测和分析。而这一优点是其他技术无法比拟的。 基因芯片一般分为两大类：以 Affymetrix GeneChips (Affymetrix inc)、Genomesystems、Research Genetics 等为代的基因芯片公司，利用照相平板印刷技术 (photolithographic techniques)合 成 的 寡 核 甘 酸 (25mer)微阵列以及以 PCR产物为基础的 cDNA (200～1000碱基对)微阵列。因为寡核甘酸在杂交 反应中能有很好的特异性和较高的信号强度，近来 寡核甘酸微阵列(30～70碱基对)的微阵列的应用 有取代 cDNA微阵列趋势。 基因芯片研究中具有代表性的研究是 Sarwal 等l4 67例儿童肾移植患者的基因表达谱的研究，他 们发现以往没有认识到的分子异质性可能提示了肾 移植排斥反应过程以及对治疗反应的多样性。值得 注意的是，有三个截然不同的分子标记被确定了对 超过 1300个基因的表达产生了影响，并根据聚类分 析结果把发生急性排斥反应的病例分为三个亚群 (AR—I、AR—II、AR—IⅡ)。I类急性排斥反应的特 点是大量的T细胞 、B细胞、巨噬细胞以及 NK细胞 在组织中激活、浸润以及 INF—r、NFkB的激活。相 比之下，Ⅱ类排斥反应程度相对缓和，其基因表达谱 特点与移植后药物中毒及感染相似。"Ill类排斥反 应是一种免疫静息的排斥反应，并且有自愈的倾向， 尽管病理提示其属于急性排斥反应。他们还发现在 排斥反应中除了穿孔素、颗粒酶、白介素 一2表达上 调外，RANTES、GRANULYSIN、CD20等表达亦上调， 并且 CD20阳性的排斥患者对激素的疗效差，肾功 能预后也较差。 Mei—Sze Chua等 利用标有 9OOO个 cDNA克 隆(代表7469个独立基因)的DNA微阵列对4例儿 童I肾移植发生急性排斥反应并发贫血的患者的外周 血淋巴细胞基因表达谱分析发现，在这些样本当中， 1 1个下调基因的“促红细胞生成素聚类”能够被区 分出来，这其中包括血红蛋白转录与合成、铁和叶酸 结合及运输相关的基因。另外，一些和同种异体免 疫相关的基因也发生下调。他们对 36例(一部分 发生急性排斥反应没有并发贫血，另一部分发生急 性排斥反应并发贫血)独立的外周血淋巴细胞数据 也进行分析，试图找出急性排斥反应与贫血间的关 系。他们的研究显示与血红蛋白合成和／或促红细 胞生成素相关的基因在移植肾功能正常同排斥的患 维普资讯 http://www.cqvip.com 国际泌尿系统杂志 2007年 3月第27卷第 2期 International Journal of Urology and Nephmlogy，Mar2007，Vo1．27 NO．2 173 者中表达谱有明显差异。 对早期移植后肾功能的判断，也能通过对转录 组的研究获得有用的信息。Peter Hauser等将36例 供肾的穿刺标本分为三组 ，活体供肾移植肾功能 正常组、尸肾移植后肾功能正常组以及尸肾移植后 发生急性肾功能衰竭组。通过对 132个基因表达变 化的观察，活体供肾与尸体供肾完全区分开来 ，并且 通过48个基因根据移植后的移植肾状况对供肾进 行分级。这些基因主要是一些与细胞问传导、凋亡 以及炎症相关的基因。另外，补体级联系统在尸体 供肾中被激活，而在活体供肾中并不出现。因此，在 尸体肾移植中对炎症的抑制可能成为对肾移植缺血 再灌注急性肾衰竭的经济而有前途的干预手段。 另外，基因芯片在组织配型 、移植肾功能监 测 以及免疫耐受 等诸多方面发挥着相当重要 的作用。但是基因芯片的价格相对昂贵，并且一些 小 RNA并不能被检测到，只能联合免疫组化的方法 检测 引¨，这些不足还有待生物技术的发展来弥补。 3 蛋白质组学与肾移植 蛋白质组学是指对一种细胞或一种组织在某种 正常或异常条件下存在的所有蛋白质的定性和定量 分析的研究思路。总的说，蛋白质组学包括两个方 面的工作：一个方面是高效的将细胞或组织 中的 “所有”蛋白质进行分离；另外一个方面是对高效分 离的每种蛋白质分子进行定性和定量。现在越来越 多的学者认为，体液中的蛋白质包含了整个人体的 大多数蛋白质，并且疾病过程中新产生的或性状改 变的蛋白质也会在体液中出现。这激起了研究者应 用各种蛋白质组学研究方法对体液(如血液 、尿液 等)中的蛋 白质进行研究，寻找它们与疾病的关 系⋯ 。双向凝胶电泳(two—dimensional gel elec— trophoI'eSiS)是蛋白质分离的常用方法，但是双向凝 胶电泳实验的重复性较差并且等电点很大或很小 (如大 于 8和小于 4的)，分子量很 大 (如大 于 100Da)以及疏水性蛋白质很难被分离开来，这些不 足限制了它的应用。而表面增强激光解析电离化 (SELDI)蛋白芯片与飞行时间(TOF)质谱分析的结 合能够弥补双向凝胶电泳的这些不足 ¨ j，分离鉴 定一些特殊的蛋白质。另外，毛细管电泳在分离蛋 白质方面具有灵敏度高、稳定性好 、快速 、分离自动 化、成本消耗少等优点，被认为是双向电泳理想的分 离分析替代方法。基于以上优点，这两项技术在肾 移植领域都有较多的应用。 Edmond ORiordan等 ¨对 23例肾活检证实为 急性排斥、22例移植肾功能稳定和 20例健康志愿 者的尿液蛋白应用蛋白芯片和 SELDI—TOF技术进 行分析发现，排斥组和移植肾功能稳定组能够被明 显区分开来，敏感性和特异性分别为90．5％ ～91． 3％及 77．2％ ～83．3％，蛋 白质质量为 2003．0、 2802．6、4756．3、5872．4、6990．6、19018．8Da的蛋白 质在两组中有明显差别。而正常对照组和另外两组 则能够完全被区分开来，敏感性 和特异性均为 100％。而且这些差别均在患者血清肌酐明显升高 前就能发现。他们认为对移植患者尿液蛋白组学的 分析能够帮助早期诊断急性排斥反应。 Stefan等 对发生移植肾急性排斥反应、移植 肾功能稳定、急性肾小管坏死、移植肾复发性肾病患 者的尿液应用 SELDI—TOF进行研究，发现有三个 峰值族的蛋白在急性排斥反应时阳性率为94％，肾 功能稳定者的阳性率为 18％，而在其他患者和非肾 移植者未能发现；1例移植肾功能稳定者在发生急 性排斥时尿液中也出现了上述三个峰值族蛋白；发 生急性排斥反应的患者在排斥反应复转后尿液检查 的结果与肾功能稳定者相同。 Wittke等 引¨通过毛细管电泳质谱联用技术 (CE—MS)技术，对不同分级的临床和亚临床肾移 植急性排斥(29例)、尿路感染(10例)和移植肾功 能正常(19例)的患者尿液研究发现，有一种多肽在 急性小管问质性排斥反应中显著异常，而在急性血 管性排斥反应中没有这种现象。而尿路感染组的患 者尿液中的多肽峰值与移植肾功能正常组和排斥组 均有明显差别，而潜在的干扰因素如小管损伤、小管 萎缩、钙调免疫抑制药物中毒、免疫抑制治疗等 此结果没有影响。由此得出结论肾移植患者的尿中 可能存在能够反映急性排斥反应的标记物，对其的 检测可能会成为预测、早期诊断急性排斥反应及判 断患者预后的重要手段。 4 总结 目前 ，转录组学、蛋白组学已在移植领域表现出 了新价值。随着新技术的出现，研究者对基因和蛋 白质表达谱改变的分析更加全面迅速。高通量的研 究技术使我们能够发现并证实过去没有认识到的与 肾移植相关的基因和蛋白质及其相互关系。加上对 代谢组学研究的深入，我们能够把三者的信息整合 起来，让我们能够从整体的观点认识肾移植的各种 病理状态，最终制定出新的个体化治疗方案，使患者 维普资讯 http://www.cqvip.com l74 国际泌尿系统杂志 2007年3月第27卷第 2期 International Journal ofUrology and Nephrology，Mar2007，Vo1．27 NO．2 重新恢复健康，这就是系统生物学的最终目的。 参 考 文 献 l 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