Tempol对UVB所致无毛鼠皮肤光老化的防护作用

Tempol抗UVB所致无毛鼠皮肤光老化的病理研究 Tempol对UVB所致无毛鼠皮肤光老化的防护作用 薛小文1 陈宏泉2* 王桂芝2 周淑佩3 赵秀峰2 【摘要】 目的:从病理学角度探讨氮氧化物Tempol 对紫外线所致无毛鼠皮肤光老化的防护作用。方法: 72只无毛小鼠随机分成正常对照组（A组）、UVB照射对照组（B组）、外用Tempol 1h后照射UVB实验组（C组）、外用Tempol 2h后照射UVB实验组（D组）、外用Tempol 4h后照射UVB实验组（E组）和外用Tempol 8h后照射UVB实验组（F组）。结果: B、C、E和F组真皮内胶原纤维及弹力纤维均增粗、断裂、排列紊乱，同时其皮肤MDA含量均显著升高，与A和D组比较差异有统计学意义（P<0.01），其皮肤HYP含量均显著下降，与A和D组比较差异有统计学意义（P<0.01）。结论:Tempol对UVB照射所致无毛小鼠的皮肤光老化具有防护作用。 【关键词】光老化; UVB; Tempol; 胶原纤维; 弹力纤维; 丙二醛; 羟脯氨酸 Pathological study of Tempol against UVB- induced skin photoaging in hairless mice [ABSTRACT] Objective : To investigate the protective effects of Tempol on skin Phtoaging caused by ultraviolet B in hairless mice from the view of pathology. Methods : Seventy-two hairless mice were divided into control group （Group A）、UVB radiation contro group (Group B)、extenal used with tempol and radiated after an hour group（Group C）、extenal used with tempol and radiated after two hours group（Group D）、extenal used with tempol and radiated after four hours group （Group E）and extenal used with tempol and radiated after eight hours（Group F）. Results : The collagen and elastic fibers in the dermis of hairless micein group B、C 、E and F became thicker, fragmented and disarranged. The MDA content was significant increased in group B、C 、E and F. The differences between group B、C、E、F and group A、D was significant （P<0.01）. The HYP content was significant decreased in group B、C、E and F. The differences between group B、C、E、F and group A、D was significant （P<0.01）. Conclusion : Tempol has a protective effect on skin photoaging caused by ultravioletB . [ KEY WORDS] Photoaging; UVB; Tempol; Collagen; Elastic fiber; MDA; HYP 近年来，随着全球臭氧层变薄，到达地球表面的紫外线(UV)逐年增多。过量的UV照射可导致皮肤晒伤、晒黑及免疫抑制，长期的UV照射还可引起皮肤光老化，并提高皮肤癌的发病率。UV引起的皮肤损伤主要与UVA及UVB有关，其中UVB 是造成皮肤损伤的主要原因[1,2]。为减轻UVB对皮肤的多种损伤, 抗氧化剂的应用已成为人们防护皮肤和治疗皮肤病的有效选择。氮氧化物4-羟基-2,2,6,6-四甲基氧基哌啶（Tempol，分子式C9H18NO2）是20 世纪80 年代发现的一组新的抗氧化剂,它具有相对分子质量小、性质稳定、细胞通透性好、无毒性、有类似超氧化物歧化酶(SOD) 的抗氧化作用等特点,可直接清除组织细胞内的自由基。既往的研究结果表明Tempol具有明显的光保护作用。[3] 本实验从病理学角度研究Tempol对UVB所致无毛鼠皮肤光老化的影响，来探讨Tempol对UVB所致无毛鼠皮肤光老化防护作用及其可能的机制。 材料和方法 一、材料 1. 试剂和仪器: Tempol(美国Sigma公司)；HYP、MDA测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；中波紫外灯(北京东升玻璃光源厂生产)； UVB型紫外辐照计(北京师范大学光电仪器厂生产)。 2. 动物: 昆明种无毛小白鼠72只（北京大学医学部实验动物科学部提供）。 二、方法 1. Tempol溶液的配制 按说明书配制：在无菌条件下，将0.1gTempol标准品溶于三蒸水中，配制成0.36%的终浓度，4℃避光保存，2周内使用。 2. 动物分组：昆明种无毛小白鼠72只，随机分成6组：每组12只，分别标记为A、B、C、D、E、F组。A组：为正常对照组，外用三蒸水，不照射UVB；B组：为UVB照射对照组，外用三蒸水，照射UVB；C组：为外用Tempol 1h后照射UVB实验组；D组：为外用Tempol 2h后照射UVB实验组；E组：为外用Tempol 4h后照射UVB实验组；F组：为外用Tempol 8h后照射UVB实验组。 3. UVB照射：将动物暴露背部皮肤，置UVB光源正下方50cm处[2]，把照射后24h无毛小鼠背部皮肤出现肉眼可见红斑所测得的UVB剂量0.111J/cm2, 定为每次UVB照射剂量[3]。除正常对照组外，其余五组均隔日照射UVB一次，共14周，总剂量为5.45J/cm2。 4. 组织学观察 末次UVB照射结束后，颈椎脱臼法将各组动物处死，取其背部皮肤组织，经固定、脱水、包埋、切片、HE及间苯二酚品红法染色，在显微镜下观察真皮内胶原纤维和弹力纤维含量的变化及病理形态学改变。 5.MDA和HYP含量的检测 取各组无毛小鼠背部照射区皮肤，以生化分析方法测定HYP及MDA含量。 三、统计学处理：实验结果以均数±标准差表示，由SPSS13.0软件包完成数据分析，两组均数间比较采用LSD检验，多组间均数间比较采用One-way ANOVA分析，统计结果以P<0.05为具有统计学意义。 结果 1.组织学改变 A和D组，真皮内胶原纤维以不同方向呈束状排列，粗细较均匀，没有明显断裂及排列紊乱现象；B和F组表皮角化过度，乳头层变平；真皮内胶原纤维增粗、断裂、排列紊乱。C和E组，其组织学改变位于A、D组及B、F组之间。（见图1-6）。弹力纤维染色示, A和D组，弹力纤维数量相对少，粗细较均匀，没有明显断裂及排列紊乱现象；B和F组真皮内弹力纤维数目增多，粗细不等，排列紊乱、断裂；C和E组，其组织学改变位于A、D组及B、F组之间。（见图7-12）。 图1　　A组（HE×40） 图2　　B组（HE×40） 　 图3　　C组（HE×40） 图4　　D组（HE×40） 图5　　E组（HE×40） 图6　　F组（HE×40） 图7 A组（弹力纤维染色×40） 图8 B组（弹力纤维染色×40） 图9 C组（弹力纤维染色×40） 图10 D（弹力纤维染色×40） 图11 E（弹力纤维染色×40） 图12 F组（弹力纤维染色×40） 2. MDA和HYP含量的变化 MDA含量：B、C、E和F组无毛小鼠皮肤的MDA含量均显著升高，与A和D组比较差异有统计学意义（P<0.01）；其中B与F组皮肤MDA含量升高最明显，C与E组皮肤MDA含量升高次之，而A与D组比较、B与F组比较差异无统计学意义（P>0.05）。HYP含量：B、C、E和F组无毛小鼠皮肤的HYP含量均显著下降，与A和D组比较差异有统计学意义（P<0.01）；其中B与F组皮肤HYP含量下降最明显，C与E组皮肤HYP含量下降次之，而A与D组比较、B与F组比较、C与E组比较差异无统计学意义（P>0.05）。（见表1） 表1 无毛小鼠皮肤MDA和HYP含量变化的检测( ) 组别 (n) MDA（nmol/mgprot） HYP（ug/mg） A　 (11)　　　　 14.91 ± 5.52—^# 1341.01 ± 168.56—^# B (9) 142.54 ± 57.00*—+^ 762.76 ± 207.27*—+^ C (10) 37.61 ± 17.59*+# ^ 1018.76 ± 176.73*+# ^ D (11) 14.87 ± 4.52—^# 1264.63 ± 120.24—^# E (10) 69.24 ± 41.17*—+# 1030.68 ± 168.57*—+# F　 (10) 105.76 ±44.21*—+^ 753.65 ± 111.09*—+^ F值 50.166 23.767 其它组与A组比较：* P<0.01；其它组与B组比较： P<0.01； 其它组与C组比较：— P<0.01；其它组与D组比较：+ P<0.01； 其它组与E组比较：^ P<0.01；其它组与F组比较：# P<0.01。 讨论 真皮中最主要的结构蛋白是胶原纤维，由成纤维细胞合成和分泌，占皮肤干重的70％～80％。UVB照射可引起人体皮肤组织的光老化[4]。光老化皮肤在组织学主要表现为：真皮层炎性细胞浸润，弹性纤维增粗、排列紊乱或聚集成团，真皮上层胶原退行性变明显、最后成为无定形物质[5]。文献报道，UVB在胶原的损伤方面起重要的作用，这种改变是皮肤光老化的中晚期改变 [6,7] 。本研究结果显示A和D组，真皮内胶原纤维以不同方向呈束状排列，胶原纤维的粗细较均匀，没有明显断裂及排列紊乱现象；B和F组表皮角化过度，乳头层变平；真皮内胶原纤维增粗、断裂、排列紊乱。C和E组，其组织学改变位于A、D组及B、F组之间。这表明，UVB长期照射可致无毛小鼠皮肤胶原纤维增粗、断裂、排列紊乱，外用Tempol对UVB所致无毛小鼠皮肤胶原纤维结构的光老化变化具有明显防护作用。 　　弹性纤维由弹性蛋白和微丝组成，具有特异的弹性和张力，尽管弹性纤维只占皮肤干重的1 %～2 %，但对皮肤的弹性和顺应性起着重要的作用。在人类皮肤的自然老化过程中，弹性纤维进行性降解、片段化，直至消失。日光中UV照射可使弹性纤维变性并团块状堆积，其弹性和顺应性则随之丧失，皮肤出现松弛、皱纹，过度伸展后出现裂纹等光老化变化。文献报道UVB在弹性纤维的损伤方面起着极其重要的作用[8]。本研究结果显示： A和D组真皮内，弹力纤维数量相对少，粗细较均匀，没有明显断裂及排列紊乱现象； B和F组真皮内，弹力纤维数目增多，粗细不等，排列紊乱、断裂；C和E组，其组织学改变位于A、D组及B、F组之间。这表明，UVB长期照射可致无毛小鼠皮肤弹力纤维均增粗、断裂、排列紊乱，外用Tempol对UVB所致无毛小鼠的皮肤弹力纤维结构变化具有明显防护作用。 表皮细胞的细胞膜中含有大量多不饱和脂肪酸, UV照射后产生的自由基能够使多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应,破坏细胞膜,在此过程中形成许多脂质过氧化物以及新的自由基。新生成的自由基再与脂质作用,产生更多的自由基,形成循环链式反应,不断产生脂质过氧化物,使自由基损伤反应扩大,最终引起细胞结构损伤、代谢紊乱、功能障碍,甚至导致细胞死亡[9]。其中MDA是最常见的脂质过氧化物,在UV照射皮肤损伤的动物模型中,通过测定MDA 的含量,可以了解皮肤在自由基作用下发生脂质过氧化反应的程度。胶原蛋白是构成真皮内胶原纤维的主要成分,在自然老化过程中, 胶原蛋白含量随年龄增长而发生变化。生命早期其含量较丰富, 以后随年龄增长,皮肤组织中胶原蛋白多肽链间共价交链程度增加,致胶原纤维溶解性及可塑性降低, 胶原蛋白含量降低。HYP是皮肤胶原纤维中特有的、相对恒定的氨基酸, 占胶原蛋白的12%～ 14% , 故常用其含量代表胶原蛋白的含量。 本实验中，通过分析MDA含量、HYP含量表达的情况，我们发现D组的各检测数据仅有有轻微的改变，其改变程度与A组相比较，差别无统计学意义（p>0.05）；C和E组各检测数据改变的程度次之；F组各检测数据改变的程度最明显，其改变程度与B组相比较，差别无统计学意义（p>0.05）；C、E和F组各检测数据改变的程度与A组相比较，均有显著性差别（p<0.01）。这表明，外用Tempol后，1-4小时之内对UVB所致无毛小鼠皮肤光老化具有一定的防护作用，用药后2小时左右的防护作用更好，8小时之后已无防护作用，说明外用Tempol对UVB所致无毛小鼠皮肤光老化的有效防护时段可能在用药后1-4小时之间。 实验结果表明， Tempol对UVB照射所致无毛小鼠皮肤光老化的作用机制可能与抑制真皮胶原纤维及弹力纤维降解、变性，抑制皮肤脂质过氧化反应，提高胶原蛋白含量有关。外用Tempol对UVB照射所致无毛小鼠的皮肤光老化具有明显的防护作用，其防护作用受时间因素影响，有效防护时段在用药后1-4小时之间，最佳防护时段在用药后2小时左右。Tempol 具有分子量小、稳定、膜通透性好且无毒等优点,将Tempol 应用于预防光老化,具有广泛的开发前景。 参考文献 1. 王国英, 陈宏泉, 刘信桥. 氮氧化物对紫外线诱导豚鼠皮肤光老化的保护作用.山东医药.2006,46(19):24-25. 4. Peter EM, Butler FRCS, Salvaldore G, et al. Quantitative and qualitative effects of chemical peeling on photo-aged skin: An experimental study. Plast Reconstr Surg. 2001; 107: 222-228. 5. 朱彦君, 冯光珍，孟宇宏，等. 皮肤光老化动物模型的建立.中国体视学与图 像分析. 2004; 9(1): 51-54. 2. 丁振华, 范建中. 紫外辐射生物学与医学. 北京: 人民军医出版社, 2000; 202-206. 3. 朱彦君, 孟宇宏, 冯光珍, 等. 紫外线照射后无毛鼠皮肤纹理的变化及其定量分析. 中华医学美学美容杂志, 2005; 11( 6 ) : 358-360. 4．Jurkiewicz BA，Buettner GR．EPR detection of free radicals in UV irradiated skin ：mouse versus human. Photochem Photobid,1996，64(6)：918—922． 5.刘仲荣．皮肤光老化的诊断．国外医学皮肤性病学分册，2000,26(3)：138． 　 6. Oikarnen A. The aging of skin: chronoaging versus photoaing. Photodermatol Photoimmunol Photomed. 1990; 78: 3-4. 7. 朱彦君, 孟宇宏, 冯光珍, 等. 紫外线照射后无毛鼠皮肤胶原的变化及其定量分析. 中华医学美学美容杂志. 2005; 11(3): 159-162. 8. 朱彦君, 孟宇宏, 冯光珍, 等. 紫外线照射后无毛鼠皮肤弹性纤维的变化及其定量分析. 中华医学美学美容杂志. 2007; 13(5): 295-298. 9. McQuarrie IG, Saint LL , Scherer PB. Treatment of normal pressure hydrocephalus with low versus medium pressure cerebrospinal fluid shunts . Neurosurgery , 1984 , 15 (4) ;484-488.