不同还原性碳源对重组大肠杆菌厌氧发酵生产丁二酸的影响

2009 No．3 Serial No．204 China Brewing 丁二酸又称琥珀酸，作为一种二元羧酸，被广泛应用 于食品、医药、化工等行业，被美国能源部认为是未来12种 最有价值的生物炼制产品之一。许多厌氧微生物能够生 产丁二酸作为其能量代谢的主要末端产物[1-3]。大肠杆菌由 于具有培养条件简单、代谢网络明确、易改造、易操作等特 点，近年来成为生物法合成丁二酸的研究热点。 大肠杆菌可以利用不同碳源作为底物发酵生产丁二 酸，其中碳源经糖酵解途径被逐级氧化，同时将NAD+还原 为以NADH形式存在的还原当量，丁二酸产生途径则将NADH 再生为NAD+，以保持氧化还原的平衡。NADH是生物代谢 过程中一个重要的辅酶，在发酵过程中胞内NADH浓度将 对整个代谢网络产生极大的影响。Klebsiella pneumoniae在 厌氧条件下将甘油转化为1，3－丙二醇的过程中，胞内的 NADH浓度在很大程度上限制着1，3－丙二醇的合成浓度 及转化率，并且能提供给甘油还原途径的NADH越多，1，3－ 丙二醇的合成也越多[4]。氧化还原电位值（ORP）作为控制参 数能够反映许多有氧和厌氧微生物培养过程中发生的有 价值的代谢信息，通过对氧化还原电位的调控可以对菌体 生长以及代谢流进行调节[5-7]。姜岷等[8]考察了氧化还原电 位调控对Actinobacillus succinogenes厌氧发酵产丁二酸的 影响，发现调节发酵体系中胞外合适的氧化还原电位值可 以促进菌体生长，提高产物（丁二酸）与副产物（乙酸）的质 量浓度比，达到丁二酸高效制备。 本实验主要考察添加不同还原性碳源甘露醇、葡萄 糖和葡萄糖酸钠作为底物，研究其对E.coli NZN111（sfcA） 厌氧发酵阶段的菌体密度、代谢物浓度、NADH量及氧化还 原电位值的影响。通过选择不同还原性碳源作为底物可 以提高丁二酸产量，同时NADH和ORP的测定为进一步研 究辅酶和氧化还原电位在厌氧发酵过程中的作用机理提 供参考。 1 材料与 1.1 材料 1.1.1 菌株 E.coli NZN111（F-△pfl∷CamldhA∷Kan）/pTrc99a-sfcA： 不同还原性碳源对重组大肠杆菌厌氧发酵生产丁二酸的影响 王桂兰，王益娜，马江锋，陈可泉，姜 岷* （南京工业大学制药与生命科学学院材料化学工程国家重点实验室，江苏 南京 210009） 摘 要：以过量表达苹果酸酶的大肠杆菌NZN111为出发菌株，考察菌体对不同碳源的利用情况，并用3L发酵罐以不同还原性碳源作 为底物测定发酵过程中菌体生长、代谢物浓度以及NADH量和氧化还原电位值（ORP）的变化。结果表明，以甘露醇、葡萄糖和葡萄糖 酸钠作为碳源时，丁二酸收率分别为99.7%，83.0%和40.5%，还原性越强的碳源发酵过程产生的NADH量越多，且NADH量随着发酵 时间逐渐降低，发酵结束时ORP分别为-358mV，-367mV和-384mV。由此可知，还原性越强的碳源产生的NADH量越多，发酵结束时 丁二酸产量越高，副产物乙酸产量越低，氧化还原电位值越高。 关 键 词：大肠杆菌；还原性碳源；发酵；丁二酸 中图分类号：TQ921 文献标识码：A 文章编号：0254-5071（2009）03-0016-04 Effects of different reduced carbon sources on succinic acid production by anaerobic fermentation of recombinant Escherichia coli WANG Guilan, WANG Yina, MA Jiangfeng, CHEN Kequan, JIANG Min* (State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering, College of Life Science and Pharmaceutical Engineering, Nanjing University of Technology, Nanjing 210009, China) Abstract: The characters on carbon utilization of Escherichia coli NZN111 which over-expresses malic enzyme were investigated. The cell density, metabolite concentration, NADH amount and oxidoreduction potential（ORP）during the fermentation of E. coli NZN111 with different reduced carbon sources were determined in 3 L fermentor. The results showed that when the mannitol, glucose and sodium gluconate were used as sole carbon source, the succinic acid yields were 99.7%, 83.0% and 40.5%, respectively. More NADH would be produced when the carbon source with higher reducibility was used, and the NADH amount was gradually decreased during fermentation. At the end of fermentation, the ORP were -358 mV, -367 mV and -384 mV respectively for mannitol, glucose and sodium gluconate used as sole carbon sources. It was indicated that the stronger the reducibility of the carbon source was, the more NADH was produced, and at the end of the fermentation, the more the succinic acid yield was, the less the by-product acetate was produced and the higher the ORP was. Key words: Escherichia coli; reduced carbon source; fermentation; succinic acid 收稿日期：2008-11-13 基金项目：国家高技术发展计划（863计划）（2006AA02Z235）；国家自然科学基金（20606017）；江苏省高技术研究计划（BG2007001） 作者简介：王桂兰（1962-），女，江苏南京人，工程师，研究方向为生物化工；姜 岷 *，研究员，通讯作者。 Research Report16· · 中 国 酿 造 2009年 第 3期 总第 204期 本实验室构建并保藏。 受体菌NZN111由CLARKDP教授（Southern IllinoisU- niversity）惠赠，其中编码丙酮酸甲酸裂解酶的pfl基因和 乳酸脱氢酶的ldhA基因分别被带有氯霉素和卡那霉素抗 性基因的片断插入失活。表达载体pTrc99a-sfcA由本实验 室构建并保藏，其中带有氨卞青霉素抗性的基因。 1.1.2 主要试剂及仪器 胰蛋白胨和酵母膏：OXOID公司；抗生素：南京生兴生物 技术有限公司；其他试剂皆为国产分析纯；CO2气体：南京 上元工业气体厂；发酵罐：美国NBS公司BIOFLO110系列 3L发酵罐。 1.2 方法 1.2.1 培养基及培养条件 采用两阶段发酵模式，好氧阶段培养菌体，厌氧阶段 发酵产丁二酸。 好氧培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L， pH值为7.0。添加氨苄青霉素100μg/mL，氯霉素和卡那霉 素硫酸盐各30μg/mL。 厌氧培养基：Na2HPO4·12H2O 17.1g/L，KH2PO4 3.0g/L， NaCl 0.5g/L，NH4Cl1.0g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，CaCl20.011g/L， 无水乙酸钠 1g/L，碳酸镁18g/L。氨苄青霉素100μg/mL，氯 霉素和卡那霉素硫酸盐各30μg/mL，维生素B130μg/mL，生 物素30μg/mL，分别添加20g/L不同碳源作为底物。 发酵罐发酵培养基：酵母膏5g/L，Na2HPO4·12H2O17.1g/L， KH2PO43.0g/L，NaCl 0.5g/L，NH4Cl1.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L， CaCl2 0.011g/L，无水乙酸钠1g/L。好氧培养阶段添加抗生 素浓度同上，用2.5mol/L NaOH外部流加调节pH值。厌氧 发酵阶段添加20g/L碳源（甘露醇、葡萄糖、葡萄糖酸钠）， 维生素B130μg/mL，生物素30μg/mL，直接添加18g/L碳酸 镁内源性调节pH值。 1.2.2 培养方法 好氧活化：将保存于-80℃的菌种以1%的接种量好氧 培养（37℃、180r/min）过夜活化作为一级种子。将一级种子 以1%的接种量再次转接好氧培养（37℃、180r/min）5h～6h作 为二级种子。将二级种子于4℃、8000 r/min离心10min，菌 泥用无菌水洗匀。再将菌泥转接装液量为30mL的50mL血 清瓶中使得初始OD600值为8左右或转接装液量为1.5L的3L 发酵罐中使得初始OD600值为2左右。 厌氧发酵：菌种转接后，通入过滤除菌后的CO2气体2min， 保证血清瓶中为厌氧环境，厌氧发酵（30℃、150r/min），发 酵周期72h。 发酵罐培养：在发酵罐上采用的是先在有氧条件下通 入无菌空气来培养菌体（37℃、200r/min），待菌体OD600值 为4～5时，切断空气源换至厌氧发酵状态，以0.5L/min的 流速经过无菌过滤器通入CO2（30℃、150r/min），发酵84h （发酵时间0h定义为好氧转为厌氧发酵的起始）。 1.2.3 菌体密度的测定 紫外可见分光光度计于波长600nm处测定吸光度值。 1.2.4 糖类及有机酸的检测 高效液相色谱法（HPLC）：高效液相色谱仪Dionex Ul- timate 3000系列，色谱分析柱：Bio-Rad Aminex誖HPX-87H 型离子排斥色谱柱；检测器：Shodex RI-101型示差折光检 测器；流动相：5mmol/L H2SO4水溶液；进样体积：20μL；流 动相流速：0.6mL/min；柱温：55℃。 1.2.5 培养基氧化还原状态测定 利用氧化还原电极测定培养基的氧化还原电位（ORP）， 显示数据所用仪器为METTLER TOLEDO酸度计（PH 2100e）。 1.2.6 辅酶NADH浓度测定 由酶循环法测定，其机理： Ethanol + NAD+———→Aldehyde + NADH PESred + NAD+←———PESox + NADH PESred +MTT———→PESox + formazan（570 nm） 式中：ADH 表示乙醇脱氢酶；PES 表示吩嗪乙氧硫酸盐； MTT表示噻吩兰。 样品预处理时取1mL菌液，12000r/min离心5min，去 除上清液，添加300μLNaOH（0.2mol/L）萃取NADH，破坏掉 NAD+，50℃水浴10 min，然后迅速放在冰中冷却至0℃，接 着滴加300μL HCl（0.1mol/L）进行中和，再12000r/min离心 10min，将上清液移至另一管中待用。反应时依次添加 50μL上述的细胞提取液、0.3mL的纯水、0.6mL的混合反应 液（等体积的1.0mol/L Bicine buffer、纯乙醇、40mmol/L ED- TA、4.2mmol/L MTT和双倍体积的16.6mmol/L PES混合， 30℃水浴10min）和50μL的乙醇脱氢酶（500U/mL），迅速混 匀后，测定波长570nm处的吸光度值A570，将A570随时间变 化曲线斜率带到标准曲线，得到待测样品中NADH的浓度。 2 结果与讨论 2.1 菌体对不同碳源的利用 通过血清瓶发酵考察菌体对不同碳源的利用情况，在 厌氧培养基中分别添加20g/L的五碳糖、六碳糖、二糖等。发 酵结束时菌体密度（OD600）和丁二酸产量结果见表1。 由表1可知，甘露醇作为碳源发酵结束时丁二酸产量 最高，为16.85g/L，收率（定义为1g碳源发酵产丁二酸的质 量，）达到84.25%。其次是葡萄糖、阿拉伯糖、果糖、麦芽 糖、葡萄糖酸钠、甘露糖、半乳糖、山梨醇。菌体几乎不能 利用木糖、山梨糖、乳糖、蔗糖和纤维二糖来发酵生产丁二 酸。其中几种碳源的还原力大小比较为葡萄糖>葡萄糖酸 钠，甘露醇>甘露糖，山梨醇>山梨糖，而相应碳源发酵时 丁二酸收率比较为葡萄糖（70.95%）＞葡萄糖酸钠（48.58%）， 甘露醇（84.25%）＞甘露糖（47.20%），山梨醇（15.08%）＞山梨糖 研究报告 17· · 2009 No．3 Serial No．204 China Brewing 表2 不同还原性碳源发酵结束时结果比较 Table 2. Comparison of succinic acid fermentation with different reduced carbon sources 碳源 丁二酸 / （g·L-1） 乙酸/（g·L-1）丁二酸∶乙酸 丁二酸收率/% 甘露醇 葡萄糖 葡萄糖酸钠 17.43 15.33 8.23 2.34 4.01 5.85 7.46 3.83 1.41 99.70 83.01 40.49 表1 不同碳源对菌体生长和发酵产丁二酸的影响 Table 1. Effects of different carbon sources on the cell growth and succinic acid production 碳源 OD600 丁二酸/(g·L-1) 收率/% 阿拉伯糖 木糖 葡萄糖酸钠 葡萄糖 半乳糖 甘露糖 甘露醇 果糖 山梨糖 山梨醇 乳糖 麦芽糖 蔗糖 纤维二糖 7.58 6.57 8.23 9.74 8.44 8.46 9.00 7.76 6.82 7.26 6.88 7.79 7.03 6.46 13.84 0.38 9.72 14.19 8.91 9.44 16.85 10.89 0.38 3.02 0.38 10.27 0.39 0 69.22 1.91 48.58 70.95 44.54 47.20 84.25 54.45 1.92 15.08 1.91 51.35 1.97 0 （1.92%）。由此可见，还原性越强的碳源，发酵结束时丁二 酸产量越高。下面选择甘露醇、葡萄糖和葡萄糖酸钠分别 作为碳源在3L发酵罐上考察对丁二酸厌氧发酵的影响， 并分别测定发酵过程中NADH量和氧化还原电位值。 2.2 不同还原性碳源对丁二酸发酵的影响 在3L发酵罐上考察发酵过程中不同还原性碳源对菌 体生长，底物消耗和代谢产物分布的影响，分别以甘露醇、 葡萄糖和葡萄糖酸钠作为碳源时发酵过程曲线见图1。 由图1可知，在厌氧发酵生产丁二酸的过程中不同碳 源对菌体生长影响比较显著。甘露醇作为碳源菌体生长 比较稳定，最高时菌体密度OD600达到7.20。葡萄糖作为碳 源初始菌体迅速生长，至36h处于稳定期，最高时OD600达 到9.95，持续到60h菌体逐渐衰亡。葡萄糖酸钠是一种多羟 基羧酸钠，可以作为碳源被菌体利用，厌氧发酵菌体密度 最低，OD600仅为5.0左右。由此可知，葡萄糖作为碳源稳定 期时菌体密度最高，是菌体生长的最佳碳源。 菌体对不同碳源的消耗速率有较大差别。葡萄糖作为底 物快速被菌体利用，发酵至36h即完全耗尽。而甘露醇和葡萄 糖酸钠消耗比较缓慢，至发酵结束才能耗尽。发酵至36h甘露 醇、葡萄糖和葡萄糖酸钠的消耗速率分别为0.17g/（L·h）、 0.51g/（L·h）、0.07g/（L·h）。由此可知，葡萄糖作为快速利 用的碳源，发酵生产丁二酸的周期最短，其他碳源消耗比 较缓慢，发酵周期较长。 发酵结束时的代谢产物丁二酸、乙酸、丁二酸与乙酸 的比例及丁二酸收率见表2。 由表2可知，甘露醇作为碳源时丁二酸产量最高，葡萄 糖次之，葡萄糖酸钠最低，副产物乙酸的产量与之相反。 当以甘露醇作为碳源时丁二酸收率为最高，可以达到99.70%， 为目前此类菌种发酵产丁二酸的最高水平。HONG S等[9] 分别以20g/L山梨醇、葡萄糖和葡萄糖酸钠作为碳源，发酵 结束分别产生10.1g/L、3.4g/L和1.2g/L丁二酸。可见还原性 越强的碳源，有利于目标产物丁二酸的产生，副产物乙酸 的产量相应减少。 2.3 不同还原性碳源对辅酶NADH的影响 以过量表达苹果酸酶的E.coli NZN111为出发菌株， 不同还原性碳源作为底物厌氧发酵过程中还原力[H]的产 生和消耗见图2。 由图2可知，当以甘露醇，葡萄糖和葡萄糖酸钠作为碳 源时，在糖酵解途径上分别产生3[H]、2[H]和1[H]，而磷酸 烯醇式丙酮酸经还原途径产生丁二酸需要消耗4[H]，这样 Research Report18· · 中 国 酿 造 2009年 第 3期 总第 204期 图2 E.coli NZN111（sfcA）不同还原性碳源厌氧发酵产丁二酸的还原力 代谢图 Figure 2. Metabolism of reducing power during anaerobic succinic acid fermentation of E. coli NZN111 (sfcA) with different reduced carbon sources 糖酵解产生的NADH不足以满足后继发酵的需要。同时在 厌氧发酵的过程中会伴有乙酸、甲酸等不需要消耗NADH 合成的代谢产物，来维持胞内的氧化还原电位平衡。 NADH/mol底物随时间变化曲线见图3，在发酵过程中 NADH/mol底物浓度逐渐降低，由于丁二酸产生过程是逐 级的还原反应，由草酰乙酸和丙酮酸还原成苹果酸，富马 酸还原成丁二酸，同时伴随还原力NADH再生为NAD+。3 种碳源还原性大小为甘露醇＞葡萄糖＞葡萄糖酸钠，还 原性越强的碳源发酵产生的NADH量越多，有利于产生丁 二酸的厌氧还原途径，发酵结束时丁二酸产量提高，副产 物乙酸产量降低。 2.4 不同还原性碳源对氧化还原电位的影响 由图4可知，分别添加甘露醇、葡萄糖和葡萄糖酸钠 发酵至84h结束时，ORP分别为-358mV、-367mV和-384mV。 还原性越强的碳源发酵结束时氧化还原电位值越高，可 能由于还原性越强，产生更多的丁二酸，使得环境的还原性 降低，ORP升高，至于ORP对发酵过程的影响机理还有待 于深入的理论研究。 3 结论 由血清瓶发酵结果可知，E.coli NZN111（sfcA）可以利 用较广的碳源（如甘露醇、葡萄糖、阿拉伯糖、果糖、麦芽 糖、葡萄糖酸钠、甘露糖、半乳糖、山梨醇等）发酵生产丁二 酸。在3L发酵罐考察不同还原性碳源对发酵的影响，以 甘露醇作为碳源丁二酸对甘露醇的收率为最高，达到 99.70%，丁二酸与乙酸的比例也最高，达到7.46。葡萄糖作 为碳源菌体生长状态最好，最高时OD600可以达到9.95，是 菌体生长的最佳碳源，且发酵周期最短。葡萄糖酸钠作为 碳源丁二酸对葡萄糖酸钠的收率最低，仅为40.49%，由于 还原性较低，发酵过程中产生较少的NADH，故有利于不 消耗NADH的副产物代谢途径，导致乙酸的产量较高，丁 二酸与乙酸的比例为1.41。测定发酵过程中的NADH可 知，还原性越强的碳源，发酵过程中产生的NADH越多，且 随着发酵时间NADH浓度呈现下降的趋势。分别以甘露 醇、葡萄糖和葡萄糖酸钠作为碳源发酵至84h结束时，ORP 分别为-358mV、-367mV和-384mV，可见添加的底物还原性 越强，发酵结束时氧化还原电位值越高。 参考文献： [1] ZEIKUS J G, JAIN M K, ELANKOVAN P. 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