2型猪链球菌毒力因子研究进展

[作者简介 ]　路玲玲 (1977 - ) ,女 ,在读博士 ,主要从事营养与食 品安全研究。3 通讯联系人 【综述 】 2型猪链球菌毒力因子研究进展 路玲玲 1, 2 , 李蓉 1 , 郑玉玲 2 , 姜永强 23 (11中国疾病预防控制中心营养与食品安全所 ,北京 　100050; 21军事医学科学院微生物流行病研究所 ,北京 　100071) [关键词 ]　猪链球菌 ;毒力因子 ;突变体 [中图分类号 ]　R37811 + 2　　　　[文献标识码 ]　A　　　　[文章编号 ]　1004 - 8685 (2008) 03 - 0570 - 03 　　猪链球菌 (S treptococcus suis)是革兰阳性兼性厌氧球菌 ,根 据其荚膜多糖抗原性的差异分为 35 个血清型 ,其中 2 型 (S treptococcus su is type 2, SS2)是毒力最强、危害最严重、流行 最广泛的血清型之一 ,可引起猪败血症、脑膜炎及急性死亡 , 并可导致人感染 ,甚至死亡。然而 , 2型猪链球菌广泛存在于 正常猪的呼吸道中 ,猪群是否会发生猪链球菌病与其带菌率 的高低无直接的关系 ,即使是 100%带菌率的猪群其发病率通 常也不高于 5% [ 1 ]。这可能是因为不同 2型菌株的致病力不 同 ,而这种差异与各菌株的毒力因子直接相关。目前 ,普遍认 为的毒力因子主要有溶菌酶释放蛋白、胞外因子、荚膜多糖、 溶血素、黏附素、44KD和 IgG结合蛋白、纤连蛋白和血纤蛋白 原的结合蛋白、谷氨酸脱氢酶等。 1　溶菌酶释放蛋白 (muram idase - released p rotein,MRP)和胞 外因子 ( extracellular factor, EF) MRP和 EF被认为是猪链球菌的两种重要的毒力因子。 Vecht等 [ 2 ]分析了 180株荷兰的 2型猪链球菌分离株 ,发现分 离自病猪的菌株含有两种蛋白 :分子量为 136 kD 的 MRP存 在于细胞面 ,分子量为 110 kD的 EF存在于培养液中 ,同时 在某些菌株培养上清中发现分子量高于 150 kD 的胞外蛋白 , 免疫印迹显示它们为 EF相关蛋白 EF3 。从病猪体内分离的 菌株有 80%为 MRP + EF +表现型 ,而从健康猪的体内分离到的 菌株仅有 2%为该型 ,而有 86%的菌株为 MRP - EF - 表现型。 由于非致病株缺少 MRP和 EF,因此这两种蛋白应为毒力标志 物。W illiam s等 [ 3 ]报道只有表现型为 MRP+ EF+的猪链球菌才 能在小鼠的巨噬细胞中存活。Baum s等 [4 ]分析猪链球菌的毒力 因子 ,结果显示表现型为 MRP+ EF+的菌株有较强的致病力。 MRP又称为 M蛋白 ,存在于细胞表面。对 MRP蛋白氨基 酸序列的分析发现 ,在其结构中有一个类似于 A群链球菌 M 蛋白基因的锚式序列 [ 5 ] ,可能通过与纤连蛋白结合而与毒力 相关。有研究以 Hep - 2细胞为模型 ,将纯化的 MRP溶液和 该细胞共孵育 ,经光镜观察 ,发现 MRP可诱导细胞发生 2种典 型的形态学变化 :一是诱导细胞融合形成多核巨细胞 ,随后巨 细胞发生凋亡 ;二是诱导单个细胞凋亡 ,凋亡率达 18%。由此 证明 MRP可单独作为 2型猪链球菌的毒力因子 [ 6 ]。 EF为细胞外蛋白 ,只能从培养上清中检测出 [ 7 ]。2001年 倪艳秀等建立了 2型猪链球菌胞外因子 ( EF)的 PCR检测方 法 ,以判定菌株毒力的强弱 ,他们检测到从健康猪体内分离的 2型猪链球菌为 EF - ,而从病猪体内分离的菌株为 EF + [ 8 ]。研 究发现 ,MRP + EF - 表现型的菌株虽缺乏 EF,却存在另外一种 在抗原性上 EF的类似物 EF3 ,序列分析无毒力菌株的 EF3 发 现 ,它不像真正的 EF蛋白 , EF3 在 N端的氨基酸与强毒株的 EF几乎一致 ,但在 C端两者有着明显的区别 , EF3 包含 76个 氨基酸的若干个重复区 , EF3 蛋白的氨基酸重复区可能通过结 合到特定配体上而使菌株毒力降低。因此 , EF蛋白中缺乏这 种氨基酸的重复区可能与毒力有关 [ 9 ]。 虽然 MRP和 EF蛋白与毒力之间有密切的关系 ,但仍然 有部分强毒株的表现型为 MRP - EF - 。Sm ith等 [ 10 ]用缺少这 两种蛋白的突变株感染猪 ,发现突变株与野生株有相同的毒 性 ,致病力相近 ,死亡率均为 100%。从攻毒后致死的动物体 内分离猪链球菌 ,发现其表现型仍为 MRP - EF - 。因此说明这 两种蛋白对 2型猪链球菌的致病性并非必不可少 ,除了 MRP 和 EF外 ,还存在其他毒力因子。 2　荚膜多糖 ( cap sular polysaccharide, CPS) W indsor[ 11 ]提出荚膜多糖决定了 2型猪链球菌的侵袭力 , 它能保护该菌在非免疫动物体内不被免疫系统的各种吞噬细 胞吞噬 ,因此是一种毒力因子。2型猪链球菌的荚膜多糖主要 由鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、N2 - 乙酰半乳糖胺和唾液酸等 5 个单糖组成 ,其糖蛋白由 231个氨基酸残基组成 ,是由位于基 因组 3846～4541 bp 之间的一段长 696 bp 基因序列编码 的 [ 12 ]。W ibawan等 [ 13 ]的研究表明荚膜的存在降低了猪链球 菌被吞噬的程度。1998年 , Segers等 [ 14 ]通过试验发现 ,与有荚 膜的猪链球菌野生株相比 ,无荚膜的突变株较容易被吞噬。 通过将缺失了荚膜多糖的突变株与野生株进行攻毒比较 ,发 现荚膜多糖的缺失可明显提高菌株的疏水性及被小鼠巨噬细 胞和猪单核细胞吞噬的可能性 ,突变株更容易从血液循环中 被清除 ,不能引起小鼠和猪发病。由此可见荚膜多糖是 2型 猪链球菌一个重要的致病因子 ,其作用途径可能是影响菌体 粘附到上皮细胞与巨噬细胞上的活性 [ 15, 16 ]。 尽管根据同源突变的研究似乎表明荚膜多糖是 2型猪链 球菌的一个重要致病因子 ,但是 , Gottschalk研究不同的分离菌 株对肺组织的粘附性试验表明 ,荚膜突变菌株与完全包裹荚 膜的菌株的粘附性没有差别 [ 17 ] ,而且还有研究显示有毒力和 无毒力的菌株具有相似大小并含有相似浓度的唾液酸的荚 膜 [ 18 ]。表明还存在其它必不可少的、重要的毒力因子。 075 中国卫生检验杂志 2008年 3月 第 18卷 第 3期　Chinese Journal of Health Laboratory Technology,Mar 2008; Vol 18　No 3 3　溶血素 ( suilysin, SLY) 猪链球菌溶血素属巯基活化的溶细胞素家族 ( TACY)溶 血素 ,以单拷贝存在 [ 19 ]。溶血素由 sly基因编码 ,分为两种类 型 :对氧敏感的链球菌溶血素 O ( SLO)和对氧稳定的链球菌溶 血素 S( SLS) ,其分子量分别为 54 kD 和 62 kD。通过对不同 来源的 1933株 2型猪链球菌的研究发现 ,溶血素基因的核苷 酸序列同源性在 9916%以上 ,而且 ,这一序列不仅在链球菌中 是保守的 ,而且在整个溶血素家族中都是保守的。体外研究 表明 ,溶血素增强了 2型猪链球菌对上皮细胞的侵袭和裂解 细胞的能力 [ 20 ]。溶血素阳性菌株黏附和损伤细胞 ,在导致脑 膜炎过程中起作用 [ 21 ]。通过对溶血素的基因突变株的研究表 明 ,与野生株相比 ,不产生溶血素的突变株溶血活性丧失 ,无 细胞毒性 ,对小鼠无毒力 ,而且对猪的致病力也较轻微 [ 22 ] ,因 此 ,溶血素被认为是主要的毒力因子。 然而 , 2型猪链球菌的溶血素基因分布具有很强的地域 性 ,来自欧洲的大多数菌株能产生溶血素 ,而来自北美的菌株 不产生溶血素 ,但仍然具有致病性。因此说明溶血素也不能 作为一个合适的毒力标志 ,还存在其他的毒力因子。 4　黏附素 ( adhesin) 猪链球菌的黏附素主要有 2种。第 1种分子量为 18 kD, 等电点为 614,是一种能被猪链球菌识别的三己糖基酰基鞘氨 醇的双糖序列 [ 23 ] ,负责猪链球菌血凝特性的结合特异性 ,存在 所有的菌株中。依据结合特异性的不同 ,可分成两种亚型 : Pn 和 Po。Pn型能被半乳糖和 N -乙酰半乳糖胺所抑制 ,而 Po型 仅能被半乳糖所抑制。纯化的 18 kD 黏附素不仅有较高的免 疫原性 ,而且能诱导小鼠体内的杀菌活性 [ 24 ]。第 2种分子量 为 39 kD,与白蛋白有结合活力。进一步研究发现 ,当给小鼠 注射时 ,发现该蛋白量增加 ,猪链球菌菌株的毒力也增加 [ 25 ]。 5　44KD和 IgG结合蛋白 Gottschalk等 [ 26 ]鉴定了 2型猪链球菌的一种 44KD的胞壁 蛋白 ,认为它是毒力因子 ,缺乏这种蛋白的突变株对猪和小鼠 丧失了致病力 ,而野生株具有很强的毒力 ,并且免疫斑点试验 证明 44KD的蛋白质有很强的免疫原性。 IgG结合蛋白属于热休克蛋白家族 ,分子量为 60 kD。其 与葡萄球菌 A蛋白一样 ,链球菌 IgG结合蛋白能非特异性地 结合猪、牛、羊等动物及人的 IgG Fc端 ,从而影响抗体的活 性 [ 27 ]。检测发现 ,所有血清型的猪链球菌均有这种蛋白 ,表明 它是一种共同抗原。但是 ,它在毒力方面的作用尚不清楚。 6　纤连蛋白 ( Fibronectin, Fn)和血纤蛋白原 ( Fibrinogen, Fgn) 的结合蛋白 ( FBPS) 纤连蛋白是一种二聚体糖蛋白 ,分子量约 440 kD,由多种 类型的细胞表达产生 ,以可溶形式存在于血浆、体液或以纤维 状存在于细胞外基质 ( ECM ) ,介导细胞与细胞外基质的相互 作用 ,可与细胞表面 Fn受体结合 ,将其连接到含有纤维状胶 原 ( I、Ⅱ、Ⅲ和 V型 )的基质 ,在细胞黏附、迁移、生长、分化和 活化过程中起重要作用。血纤蛋白原是由α、β和γ3种肽链 组成的一种糖蛋白 ,分子量为 340 kD,为血浆的一种可溶性成 分 ,血栓的一种不溶性成分 ,也是 ECM的成分。Fn和 Fgn有 多种功能域 ,与不同的底物结合 ,同时也是细菌黏附的底物 , 黏附是病菌建立定植和感染的基础。A strid de Greeff等建立 2 型猪链球菌 FBPS突变株 ,用缺乏 FBPS的突变株感染猪 ,与野 生株比较 ,仅表现为弱毒力 ,因此说明 FBPS可能是 2型猪链 球菌的一个毒力因子 [ 28 ]。 7　谷氨酸脱氢酶 ( glutamate dehydrogenase, GDH) 谷氨酸脱氢酶是新近发现的一个与猪链球菌毒力相关的 因子。猪链球菌的谷氨酸脱氢酶属于 GDH蛋白家族 ,在细胞 表面表达。活性染色表明猪链球菌 GDH活性依赖 NAD ( P) H,作用底物为 L -谷氨酸。Ogi[ 29 ]经实验证明 ,该基因在 2型 猪链球菌中保守存在。2型猪链球菌的 GDH有保守的抗原 性 ,能与感染有毒猪链球菌的猪的血清反应 ,可作为检测猪链 球菌的重要标志性抗原。用全细胞 EL ISA和免疫金标记确定 该细胞的定位 ,结果显示猪链球菌的 GDH蛋白暴露在完整细 胞的表面。有实验证明基于 GDH蛋白的检测可区分 2型猪链 球菌的强毒株、弱毒株和无毒株。 8　新发现的毒力因子 由于在毒力株、弱毒株和非致病性菌株之间的毒力差异不 能简单地用 MRP、EF和溶血素等已发现的毒力因子加以解释 , 因此推测有其他因子导致了其毒力差异。国内外对 2型猪链球 菌新的毒力因子进行了大量的发掘研究。Sm ith等用体内互补 法 ( in vivo comp lementation)从中枢神经系统中分离病原 ,发现 一段毒力相关序列 ,经计算机分析 ,其中包括两个完整的阅读 框 ,一个与已知基因有高度的同源性 ,但与致病性无关 ,另一个 与已知的基因均无同源性 ,推测其可能与致病性有关 [30 ]。 De等发现了一个基因 RevS,证明它是一个孤立的反应调 节因子 ,试验发现缺失了 RevS基因的突变株在感染猪的器官 中定居能力较野生株弱 ,说明 RevS在细菌的发病机制中起重 要作用 [ 31 ]。 2005年 2型猪链球菌病在我国暴发流行后 ,我国中科院 基因组研究所完成了 1998、2005暴发流行株的全基因精细图 (98HAH12和 05ZYH33) ,并完成了无毒株 05HAS68的草图用 作对比研究。线性基因组比较的结果发现了一个 89 kb的毒 力岛 PA I,命名为 89K, 该 PA I仅存在于中国流行株。89K毒 力岛 GC含量为 3618% ,远低于基因组的 GC含量 4113% ,密 码子使用偏性也不同于全基因组 ,暗示其很可能是通过水平 基因转移在菌株间传递。对 89K毒力岛进一步的功能注释显 示其含有 2个双组分信号转导系统 ( TCSTS) [ 32 ]。双组分信号 转导系统 ( TCSTS)是原核生物中普遍存在的信号调控系统 ,通 过调控多种毒力因子的表达参与致病过程。但目前还没有对 该基因有进一步的研究。 9　结语 猪链球菌的致病因子很复杂 ,其毒力有可能是多因子共 同作用的结果 ,欧洲分离株 MRP、EF和溶血素的存在代表了 潜在的毒力 ,但是 ,缺少这些蛋白质的菌株也不能归结为无毒 力。致病株也可能从健康猪体分离 ,而猪发病有时是因各种 原因使免疫系统平衡被破坏引起的。因此 ,虽然目前人们对 2 型猪链球菌的毒力因子有了一定的认识 ,但各毒力因子的作 用机理、相互作用、各毒力因子与疾病发展的关系等各方面内 容还有待深入研究。 175中国卫生检验杂志 2008年 3月 第 18卷 第 3期　Chinese Journal of Health Laboratory Technology,Mar 2008; Vol 18　No 3 [参考文献 ] [ 1 ] Staats JJ, Feder I, Okwumabua O, et al1S treptococcus su is: past and p resent[ J ]1Veterinary Res Communications, 1997, 21: 381 - 4071 [ 2 ] Vecht U, W isselink HJ, Jellema ML, et al1 Identification of two p ro2 teins associated with virulence of S treptococcus suis type 2 [ J ] 1 Infect Imm, 1991, 59 (9) : 3156 - 31621 [ 3 ] W illiam s AE1Relationship between intracellular survival in macropha2 ges and pathogenicity of S treptococcus suis type 2 isolates [ J ] 1M icrob Pathogenesis, 1990, 8 (3) : 189 - 1961 [ 4 ] 何孔旺 ,倪艳秀 ,王继春 ,等 1猪链球菌分子流行病学 [ J ]1中国人 畜共患病杂志 , 2002, 18 (5) : 45 - 471 [ 5 ] Sm ith HE, Vecht U, Gielkens AL, et a l1Cloning and nucleotide se2 quence of the gene encoding the 136 - kilodalton surface p rotein (mu2 ram idase - released p rotein ) of S treptococcus su is type 2 [ J ] 1 Infect Imm, 1992, 60 (6) : 2361 - 23671 [ 6 ] 曾巧英 ,陆承平 1猪链球菌 2型溶菌酶释放蛋白诱导上皮细胞融 合和凋亡 [ J ]1微生物学报 , 2003, 43 (3) : 407 - 4121 [ 7 ] 徐淑菲 ,何孔旺 ,陆承平 1猪链球菌 2型毒力因子部分片段的克隆 与表达 [ J ]1中国人兽共患病杂志 , 2004, 20 (11) : 943 - 9461 [ 8 ] 倪艳秀 ,何孔旺 ,王继春 ,等 1检测猪链球菌 2型胞外因子 ( EF)的 PCR方法的建立 [ J ]1中国人兽共患病杂志 , 2001, 17 (4) : 57 - 591 [ 9 ] H ilde E Sm ith, Frans H Reek, U ri Vecht, et a l1Repeats in an extra2 cellular p rotein of weakly pathogenic strains of S treptococcus su is type 2 are absent in pathogenic strains[ J ]1 Infect Imm, 1993, 61 (8) : 3318 - 33261 [ 10 ] Sm ith HE, VechtU, W isselink HJ, et a l1Mutants of S treptococcus su is types 1 and 2 impaired in exp ression of muram idase - released p rotein and extracellular p rotein induce disease in newborn germfree p igs [ J ]. 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