食品微生物快速检测技术研究进展

!""# 年第 $ 期 % 月出版 食品微生物快速检测技术研究进展 唐春林 &’ 车振明 （西华大学生物工程学院，成都 #()"%*） +,-./012’ 3/’ 4.25’ ,1510563/’ 5107 /6891’ 34’433,’:60;33;<./ 62:2 摘 要 从食品安全的角度出发，介绍了几种快速 检测方法，同时，较系统的介绍了利用生物化学、 免疫学和分子生物学的技术手段快速检测病原菌的 技术和方法。 关键词 微生物 快速检测技术 食品 +=25;.05 ’’’’ >762’?.?1;，6/’ 51;:2’34’433,’2.415@，;1-61A2’ 21-1;.B’4.25’,1510563/’:1573,2’34’433,’:60;33;<./62:2CD5’ .B23’2@251:1560.BB@’76<7B6<752’2907’’,1510563/’5107/68912’ ./,’:1573,2’.2’=63071:625;@，6::9/3B3<@’./,’:3B109B.;’ =63B3<@’.??;3.0712’34’4.25’,151056/<’?.573<1/2’C E1@A3;,2’’’’ F60;33;<./62:’’’’ G.25’ ,1510563/’ 5107/6891 G33, 食物病原微生物是食品安全的重要，而对 其的快速检测（验）一直是相关研究的热点。近年 来，微生物的快速检测和自动化研究进展迅速。依 靠培养基进行培养、分离及生化鉴定的传统方法费 时费力。快速检测及其自动化则综合引用微生物 学、化学、分子生物学、生物物理学、免疫学以及 血清学试验技术对微生物进行分离、检测、鉴定和 计数。和传统方法比较，更快、更方便、更灵敏。 因此，在医学、食品、农业、工业和环境等方面得 到了广泛了应用，下面介绍几种食品微生物快速检 测技术。 $’ 气相色谱法 其原理是将微生物细胞经过水解、甲醇分解、 提取以及硅烷化、甲基化等衍生化处理后，使之分 离尽可能多的化学组分供气相色谱仪进行分析。不 同的微生物所得到的色谱图中，通常大多数的峰是 共性的，只有少数的峰具有特征性，可被用来进行 微生物鉴定，分析检测各种常见细菌、酵母菌、霉 菌等。 !’“既用胶”测定法 把 $’:H食物样品倾入一盛有无菌液体培养基 的试管中，混匀后再将混合物倒入一个装有胶质的 特殊培养皿中。混合物与胶质接触后便形成琼脂相 似的复合物。经培养后便可计数菌种及数量。 该系统是包装好的产品，用时不需灭菌，极适 合野外测定。目前，这种系统正在受到美国 +I+J 的鉴定。 %’ 以生物化学手段建立的快速检测 技术 %C$’ 微生物专有酶快速反应系统的检测技术 微生物专有酶快速反应是根据细菌在其生长繁 殖过程中可合成和释放某些特异性的酶，按酶的特 性，选用相应的底物和指示剂，将他们配制在相关 的培养基中。根据细菌反应后出现的明显的颜色变 化，确定待分离的可疑菌株，反应的测定结果有助 于细菌的快速诊断。这种技术将传统的细菌分离与 生化反应有机地结合起来，并使得检测结果直观， 正成为今后微生物检测发展的一个主要发展方向。 %C!’ 常规的致病微生物检测技术 不同病原体的化学组成或所产生的代谢产物各 异，利用微生物（主要是细菌）的不同生化和生理 特性，可以对细菌进行鉴定。生化鉴定是检测细菌 & 唐春林，男，$*K* 年出生，西华大学生物工程学院在读硕 士研究生。 收稿日期：!))#L)(L )* >./<’J79LB6/ &’ J71’M71/L:6/< （N635107/3B3<@’03BB1<1’34’O679.’9/6-1;265@，J71/<,9’’#$))%*，J76/.） 食 品 工 程 GIIP’’QRSDRQQTDRS U! !""# 年第 $ 期 % 月出版 唐春林，等：食品微生物快速检测技术研究进展 最常用的方法。细菌检验中的微量化和自动化，是 微生物学诊断中的发展方向，经过多年的研究和不 断改进，常规的临床细菌学诊断己由系列的试剂盒 商品成套供应，来替代各检验部门自行配制试剂、 手工操作的缓慢和繁琐工作。 另外，气相色谱和高效液相色谱的分析也应用 到致病微生物的检测中，主要是依据不同病原体的 化学组成或所产生的代谢产物各异，利用上述色谱 检查可直接分析各种体液中的细菌代谢产物、细胞 中的脂肪酸、蛋白、氨基酸、多肽、多糖等，以确 定病原微生物的特异性化学标志成分，协助病原诊 断和检测，其中以气相色谱应用较多，该法简单、 快速。 &’ 以免疫学方法建立的快速检测技术 免疫检测的基本原理是抗原抗体反应。抗原抗 体反应是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结 合反应。不同的微生物有其特异的抗原，并能激发 机体产生相应的特异性抗体。在免疫检测中，可利 用单克隆抗体检测微生物的特异抗原，也可利用微 生物抗原检测体内产生的特异抗体，两种方法均能 判断机体的感染状况。 &($’ 免疫荧光技术 免疫荧光技术（)**+,-./+-01231,31’4135,)6+1） 是用荧光素标记的抗体检测抗原或抗体的免疫学标 记技术，又称荧光抗体技术。所用的荧光素标记抗 体通称为荧光抗体，免疫荧光技术在实际应用上主 要有直接法和间接法。直接法是在检测样品上直接 滴加己知特异性荧光标记的抗血清，经洗涤后在荧 光显微镜下观察结果。间接法是在检样上滴加己知 的细菌特异性抗体，待作用后经洗涤，再加入荧光 标记的第二抗体。如研制成的抗沙门氏茵荧光抗 体，用于 789 例食品样品的检测，结果表明与常规 培养法符合率基本一致。免疫荧光直接法可清楚地 观察抗原并用于定位标记观察。 &(!: 酶免疫测定技术 酶免疫测定（1,;<*1’)**+,-=22=<，>?@）根据 抗原抗体反应是否需要分离结合的和游离的酶标记 物而分为均相和非均相两种类型。非均相法较常 用，包括液相免疫测定法与固相免疫测定法。固相 免疫测定法的代表技术是 >A?B@。>A?B@技术是抗 原或抗体吸附到固相载体上作为一种试剂来检测标 本中抗体或抗原的一种方法。根据反应原理，加入 某种酶标记的抗体或抗原，洗涤除去未结合物，加 入该酶的底物，酶催化底物生成有色产物，产物的 量与标本中受检物的量有关，根据反应颜色的深浅 可定量测定。 >?@在微生物学领域中可用于病原的检测、抗 体检测和细菌代谢产物的检测。>?@具有高度的特 异性和敏感性，几乎所有可溶性的抗体抗原反应系 统均可检测。与放射免疫方法相比较，>?@的标记 试剂较稳定，且无放射性危害；与免疫荧光技术相 比，>?@敏感性高，不需特殊设备，结果观察简便。 &(%: 免疫印迹技术 免疫印迹（)**+,-C/-D）法分三个步骤：第一， BEB聚丙烯酞胺凝胶电泳（BEB:F: G@H>）。将蛋白 质抗原按分子大小和所带电荷的不同分成不同的区 带。第二，电转移。目的是将凝胶中己分离的条带 转移至硝酸纤维素膜上。第三，酶免疫定位，该步 的意义是将前两步中己分离，但肉眼不能见到的抗 原带显示出来。将印有蛋白抗原条带的硝酸纤维素 膜依次与特异性抗体和酶标记的第二抗体反应后， 再与能形成不溶性显色物的酶反应底物作用，最终 使区带染色。本法综合了 BEB:I’ G@H>的高分辨率 及 >A?B@的高敏感性和高特异性，是一种有效的分 析手段。 &J&’ 免疫组织化学方法 是应用免疫学中的抗原抗体反应，借助可见的 标记物，在组织原位显示抗原或抗体的方法。常用 的免疫组织化学方法有荧光免疫和酶免疫组化技 术、金标免疫组织化学技术和免疫电镜，该技术特 点是对细胞涂片、印片、组织切片进行处理和染色 镜检。免疫组化技术弥补了上述血清学诊断方法的 不足，使得在细胞或组织内检测病原微生物成分成 为可能。对于在宿主组织液中微量表达或不表达抗 原、抗体的微生物，免疫组化具有较好的辅助诊断 价值。利用免疫组化技术，还能观察被侵犯组织致 病微生物繁殖和对组织破坏情况。 8’ 估计微生物数量和菌量的新方法 通过微生物生长所引起的物理、生物化学、生 物物理指标的变化来对样品中的微生物量进行估 计，其中有 @4G水平、阻抗和导电、接触酶的测定 等。 8% !""# 年第 $ 期 % 月出版 化学发光的原理：利用可发光化学物质测定被 分析物质的浓度。所有生物体的磷酸核苷酸（&’(） 含量是相对固定的，当萤火虫酶系统和 &’(接触 时，发生光生物学反应，就会发光。在荧光素和荧 光酶过量时，荧光强度与 &’(含量成正比关系。用 &’(生物发光确定细菌总数的准确程度依赖于从食 品样品中细菌分离的效果和实验前将样品本身的 &’(消除的程度。 阻抗测定的原理：当细菌生长时，将大分子物 质降解成小的带高电荷的粒子，从而改变周围培养 基的导电性能。通过测定阻抗或电导变化，可以了 解生物活动情况。当微生物含量达到某一值时，阻 抗的变化与微生物含量呈相关性，即与污染程度呈 相关性。 微热量计法（)*+,-+./-,*012,3）：利用细菌生长 而产生热量的原理而成。微生物在生长过程中 产生热量，虽然产生的量很小，但仍能通过敏感的 微热量计进行测量。用微热量计对微生物计数时， 温谱图必须与绝对微生物细胞数呈相关性，一旦建 立了参考温谱图，食品样品温谱图便可与之相比较 而得到微生物的绝对数量。 放射测量法（4.5*-012,*+）：利用细菌代谢碳水 化合物而产生 67!的原理，把微量的放射性标记引 入葡萄糖或其他糖类分子中，细菌生长时，糖被利 用并放出含放射标记的 67!。有一种仪器（8.+21+） 可用来测定放射性 67!，放射量与菌数成正比。这 一方法适用于测定食品中的细菌 接触酶实验：利用接触酶反应来估计食品中微 生物含量。由这一原理设计出的仪器称为接触酶测 定仪（6.2./.90121,）。其原理是通过计算一个含有 接触酶的纸盘，在盛有 :!7! 的试管中的漂浮时间 来估计菌数。当样品中接触酶含量高时（表明接触 酶阳性细菌含量高），纸盘上浮的时间短（以 9 计）；反之，接触酶的浓度低，纸盘上浮的时间长 （以 /;"<9<=?&探针（@1A1?&探针共有两种 类型：一种是含有放射性标记的探针；另一种是无 放射性标记的探针。放射性标记的核酸探针的特异 性非常强，检测病原微生物速度比常规法快得多。 非放射性标记的核酸探针类型很多，应用较广泛的 有用生物素 D 抗生物素蛋白系统标记的非放射性核 酸探针。生物素 D 抗生物素蛋白系统标记的探针已 在沙门氏菌、产肠毒素大肠杆菌及乙型肝炎病毒检 测中得到了应用。 (64（(-E301,.91<6F.A*A<41.+2*-A）是聚合酶链 式反应的简称。利用 (64检测食品中的致病菌，可 以对那些人工难以培养的微生物进行检测。由于在 所有细菌中编码 ,4?&的一些基因保守性很强，因 此可用 (64扩增其相应的 >?&片断，来快速、灵 敏地检测样品中是否存在某些细菌或致病菌，尤其 是那些人工无法培养的微生物。 最近又设计了一种 >?&指纹图谱自动分析系 统———4*G-< (,*A21,’)（ >HI-A2< 51< ?10-H,9 公 司 产 品）。具体操作是从细菌细胞中提取 >?&，接着用 限制性酶将 >?&降解成片段，>?&片段通过电泳 得到分开，再转移至杂交膜上与 >?&探针杂交。 由于引入了化学发光标记物，杂交片段发出的光线 被相机捕获，得到的核酸图谱与其他贮存的 >?& 核酸碱基序列进行比较，通过核酸匹配分析可以对 微生物进行鉴定。 J< 活细胞计数检测 自动旋转平板和激光菌落扫描计数法，在均匀 薄层琼脂营养基表面，以阿基米德螺旋线方式将液 体样品从中心到边缘均匀涂在平板上。经过培养在 计数格区间内计数，或用激光计数器来扫描平板， 以透过光的强度来检测菌落的存在。 (12,*K*H0’)系统（%<)6-LM2L(.H/，)*AAL）用可 重新水化的营养成分取代琼脂倾注平板。把这种营 养成分和一种胶态试剂一起嵌入在一系列薄膜上。 取 E<0N液体样品滴于膜系统中央，重新水化的培 养基便可作为微生物生长的支持物，经过培养后， 便可像常规平皿计数一样直接在膜系统上对菌落进 行计数。(12,*K*/0O!;;; 系列从菌群鉴定到结束只需 培养 P标准

excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载