HPLC-ELSD法测定麦芽糖中葡萄糖和麦芽三糖等有关物质的含量

药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2007，27(8) HPLC—ELSD法测定麦芽糖中葡萄糖和麦芽三糖等有关物质的含量 牛秀华，岳志华，张启明 (中国药品生物制品检定所，北京 100050) 摘要 目的：建立 HPLC—ELSD测定麦芽糖中葡萄糖和麦芽三糖等有关物质的方法。方法：采用 SHISEIDO CAPCELL NH，柱 (4．6 mm×150 mm，5 pin)色谱柱；流动相：乙腈 一水 (65：35)；流速：1．0 mL·min～；检测器 ：蒸发光散射检测器检测 ；柱温：室 温。结果：麦芽糖和葡萄糖及麦芽三糖等有关物质分离度良好，葡萄糖和麦芽三糖的最低检出限分别为 0．047 Ixg和 0．042 g。结论：本法简便、准确，专属性好，灵敏度高，可用于麦芽糖中葡萄糖及麦芽三糖等有关物质的检查。 关键词：高效液相色谱；蒸发光散射检测；麦芽糖 ；葡萄糖；麦芽三糖；有关物质 中图分类号：R917 文献标识码：A 文章编号：0254—1793(2007)08—1261—03 HPLC —ELSD determination of glucose，maltotriose and other related substances in maltose NIU Xiu—hua，YUE Zhi—hua，ZHANG Qi—ming (National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products，Beijing 100050，China) Abstract Objective：To establish an HPLC—ELSD method to determine glucose，maltotriose and Other related substances in maltose．Method：The HPLC method was conducted on a SHISEIDO CAPCELL NH，column(4．6 mm ×1 50 mm，5 m)and coupled with evaporative light—scattering detection(ELSD)，with acetonitrile—water(65： 35 as mobile phase．Th e flow rate was 1．0 mL ·min～ an d the column temperature was room temperature．Results： Th e resolution between glucose．mahotriose and malrose was satisfactory，an d the LOD of glucose and maltotriose were 0．047 g and 0．042 txg，respectively．Conclution：A simple，accurate an d sensitive HPLC method to deter- mine glucose．mahotriose an d other related substan ces in maltose iS established． Key words：HPLC；evaporative light—scattering detection(ELsD)；maltose；glucose；maltotriose；related substances 麦芽糖(maltose)是由2 mol葡萄糖分子脱去 1 mol水分子缩合而成的双糖。麦芽糖甜度低，口感 较好，不会影响胰岛素分泌，对糖尿病患者或肥胖人 群是良好的甜味剂。麦芽糖可以制成静脉注射液， 其渗透压比葡萄糖低，在生物体内需先水解再吸收， 用于糖尿病和高血压患者补充能量⋯。制备结晶 麦芽糖的关键技术包括淀粉经多种酶协同水解后， 制得麦芽糖含量较高的糖浆，再通过一系列精制步 骤去除各类杂质。为得到高纯度的麦芽糖结晶，必 须尽可能提高水解液中麦芽糖的纯度，减少葡萄糖、 麦芽三糖等低聚糖的生成量。麦芽糖的检测方法在 美国药典(USP)29版 和 日本药局方(JP 2001) 中均有收载，但均用 HPLC示差折光检测器检查有 关物质，存在检测灵敏度低的缺点，本文首次建立用 第一作者 Tel：(010)67095342；E—mail：zhihuaamt@163．com HPLC—ELSD检查麦芽糖中葡萄糖和麦芽三糖等有 关物质的方法，方法简便且灵敏度高，为更好地控制 麦芽糖的纯度和质量提供了依据。 1 仪器与试药 Waters 2695高效液相色谱仪，Alhech 2000蒸 发光散射检测器，Waters 2414示差折光检测器(美 国 Waters公司生产 )。 D一无水葡萄糖对照品(由中国药品生物制品 检定所提供，批号为：110833—200503，室温减压干 燥 12 h使用)，麦芽糖(珠海联邦制药股份有限公司 提供 ，批号为 050301)，麦芽三糖(Sigma试剂，HPLC 纯度大于 95．O％)；乙腈为色谱纯(Fisher chemi— cals)，去离子水(Millipore超纯水系统制备)，磷酸、 磷酸二氢钠均为化学纯。 维普资讯 http://www.cqvip.com 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2007，27(8) 2 色谱条件 色谱柱：SHISEIDO CAPCELL NH2柱(4．6 mln x 150 mln，5 txm)；流动相：乙腈 一水(65：35)；流速：1．0 mL·min ；ELSD参数为漂移管温度：100 oC；空气流 速：2．2 mL·min～；柱温：室温；进样量：20 。 3 方法专属性考察 采用上述液相色谱条件对麦芽糖、葡萄糖、麦芽 三糖的混合溶液(各取麦芽糖、葡萄糖和麦芽三糖 对照品适量，加水制成每 1 mL含麦芽糖约 20 mg、 葡萄糖0．1 mg和麦芽三糖 0．1 mg的混合溶液)进 行检测，结果明麦芽糖和葡萄糖及麦芽三糖峰得 到了很好的分离，葡萄糖和麦芽糖、麦芽糖和麦芽三 糖之间的分离度分别为 1．8和 3．0。色谱图见图1。 说明采用本 HPLC法测定麦芽糖中葡萄糖和麦芽三 糖的方法专属性良好。 图1 HPLC专属性考察色谱图 Fig 1 HPLC chromatogram of the exclusion inspection 1．葡萄糖(glucose) 2．麦芽糖(mahose) 3．麦芽三糖(maltotriose) 4 溶液的制备 4．1 葡萄糖对照品溶液 精密称取葡萄糖对照品 适量，加水溶解后制成浓度为 0．04 mg·mL 的对 照品储备液。精密量取对照品储备液 5．0，4．0， 3．0，2．0，1．0 mL分别置 10 mL量瓶中，用水稀释至 刻度，摇匀，即得。 4．2 麦芽三糖对照品溶液 精密称取麦芽三糖适 量，加水溶解后制成浓度为0．2 mg·mL 的对照品 储备液。精密量取对照品储备液 10．0，5．0，4．0， 2．0，1．0 mL分别置 10 mL量瓶 中，用水稀释至刻 度，摇匀，即得。 5 线性关系 在本文色谱条件下，精密量取葡萄糖对照品溶 液和麦芽三糖对照品溶液各 20 进样，以对照品 峰面积的 Lg值 y为纵坐标，对照品浓度的 Lg值 为横坐标，绘制标准曲线，葡萄糖和麦芽三糖的回归 方程分别为： Y = 1．0722 X + 6．52l4 r=0．9989 Y = 1．1289 X + 6．5278 r=0．9991 葡萄糖和麦芽三糖分别在0．004一h0．02 mg·mL 和0．02—0．2 mg·mL 浓度范围内线性良好。 6 回收率试验 精密称取已知杂质含量的麦芽糖样品适量，分 别精密加入高、中、低 3个浓度的葡萄糖 (0．04， 0．02，0．01 mg·mL )溶液和麦芽三糖对照品溶液 (0．2，0．1，0．05 mg·mL )各 3份，按“10“项下葡 萄糖和麦芽三糖测定的步骤操作，测定回收率，结果 葡萄糖的回收率分别为：99．9％，101．8％，101．2％， RSD为 1．2％，0．8％，1．1％；麦芽三糖的回收率分 别 为：99．6％，101．3％，101．6％，RSD 为 1．1％， 1．4％ ，1．2％ 。 7 精密度试验 分别取葡萄糖和麦芽三糖对照品溶液(浓度分 别为 10，100 txg·mL )，依本文方法重复进样 5 次，葡萄糖、麦芽三糖的峰面积 RSD(Tt,=5)分别为 1．3％，0．38％，表明本法精密度良好。 8 重复性试验 取麦芽糖样品5份，按“10“项下方法制备供试 品溶液，依本文前述色谱条件测得葡萄糖含量的 RSD为 1．8％，麦芽三糖含量的RSD为 1．5％，表明 本法重复性良好。 9 检测限和定量限考察 将葡萄糖、麦芽三糖对照品储备液稀释后测定， 在信噪比SIN约为3时测得检测限，分别为0．047， 0．042 txg；在信噪比S／N约为10时测得定量限，分 别为0．142，0．140 txg。 1O 样品的测定 取麦芽糖约0．2 g，精密称定，置 10 mL量瓶中， 加水溶解后加至刻度，摇匀，制成浓度为 20 mg· mL 的溶液作为供试品溶液；另取葡萄糖、麦芽三 糖对照品适量，加水配制成浓度分别为20 g· mL 的溶液作为对照品溶液；精密量取供试品溶液 20 L注入液相色谱仪，色谱图至主成分色谱 图保留时间的 3倍，见图2。供试品溶液色谱图中 如出现与对照品溶液中葡萄糖和麦芽三糖相应的色 谱峰，按外标法计算葡萄糖和麦芽三糖的含量，面积 归一化法计算其他杂质的含量。结果测得样品葡萄 糖和麦芽三糖的含量分别为0．03％，0．64％，其他 杂质含量为0．05％。 11 讨论 11．1 麦芽糖在美国药典和 日本药局方中均有收 维普资讯 http://www.cqvip.com 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2007，27(8) 图2 麦芽糖有关物质检查色谱图 Fig2 HPLC ehromatogram of the determination of related substances in maltose 1．葡萄糖(glucose) 2．麦芽糖(maltose) 3．麦芽三糖(maltotriose) 载，但均用 HPLC示差折光检测器检查有关物质。 我们分别采用了 SmSEID0 CAPCELL NH2柱(4．6 mm×150mm，5Ixm)和TOSOHTSK—GEL阳离子 交换柱 (7．8 mm×300 mm，5urn)，应用示差折光检 测器对麦芽糖中葡萄糖和麦芽三糖的量进行了检查 试验，并把所测含量结果和 LOD与本文方法所测结 果进行比较，见表 1。从表 1结果可以看到，应用美 国药典和日本药局方方法所得葡萄糖和麦芽三糖的 结果和本文方法所测结果相比均偏低。这可能和应 用示差折光检测器测定葡萄糖和麦芽三糖的灵敏度 均较低有关。可见，用 ELSD检查麦芽糖中的葡萄 糖和麦芽三糖灵敏度得到了很大提高。由于 ELSD 对挥发性低于流动相的样品响应因子相同，故葡萄 糖和麦芽三糖所得 LOD和 LOQ都是基本一致的。 试验中还发现：用阳离子交换柱时葡萄糖、麦芽糖和 麦芽三糖三者的出峰顺序与氨基柱不同，依次为麦 芽三糖、麦芽糖和葡萄糖。 表 1 本文方法、USP及 31'方法所测结果的比较 Tab 1 Comparison of results of ELSD method，USP RI method and JP RI method 11．2 考察了雾化器气体流速对检测灵敏度的影 响。流速如果过小，流动相挥发不完全，背景噪声 大；流速过大，雾化形成的物质微粒小，散射能力弱， 灵敏度降低。当空气流速为 2．2 mL·min 时，麦 芽糖的信噪比最大且噪音小。同时考察了漂移管温 度对检测灵敏度的影响，温度过低时，流动相蒸发不 完全，噪声大，杂峰多，信噪比小；温度过高时，可能 导致麦芽糖部分挥发，也会引起检测灵敏度降低。 当温度为 100 oC时麦芽糖信噪比最大，所以选择漂 移管温度 100 cC为宜。 11．3 本法操作简便，重复性好，较已有方法灵敏度 有很大提高，有利于对麦芽糖的纯度和质量进行控 制。 参考文献 1 XU Yi—sa(徐以撒)，ZHOU Guo—ping(周国平)，~ANG Lu—xin (杨柳新 )．Study on preparation of pharmaceutical srade crystalline maltose(医药级结晶麦芽糖的试制)．Pharm Biotechnol(药物生物 技术)，2004，11(3)：178 2 USP 29．20o6．815 3 JP 14．XIV．2001．586 (本文于2007年2月5日收到) 维普资讯 http://www.cqvip.com