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质谱讲义及液质联用的实例

2010-11-18 27页 pdf 1MB 71阅读

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质谱讲义及液质联用的实例 液质联用技术在生物毒素 检测中的应用 浙江省疾病预防控制中心 任一平 生物毒素检测方法的趋势 ■ 前处理简单 ■ 低成本 ■ 高通量 ■ 高灵敏度 ■ 高选择性 ■ 高效率 ■ 提供分子结构信息 什么样的仪器设备才能达到上述 要求?只有质谱! ■ 通用型的选择性检测器。 ■ 提供分子结构信息,可以得到确证结果。 ■ SIM、MRM都具有高灵敏度。 ■ 抗干扰能力强。 ■ 色谱分离已经不是最主要问题。 质谱仪的类型和离子化的方式 • 质谱的类型:MS、MS/MS、MSn、TOF、Q-TOF、 SECTOR、 FT-I...
质谱讲义及液质联用的实例
液质联用技术在生物毒素 中的应用 浙江省疾病预防控制中心 任一平 生物毒素检测的趋势 ■ 前处理简单 ■ 低成本 ■ 高通量 ■ 高灵敏度 ■ 高选择性 ■ 高效率 ■ 提供分子结构信息 什么样的仪器设备才能达到上述 要求?只有质谱! ■ 通用型的选择性检测器。 ■ 提供分子结构信息,可以得到确证结果。 ■ SIM、MRM都具有高灵敏度。 ■ 抗干扰能力强。 ■ 色谱分离已经不是最主要问题。 质谱仪的类型和离子化的方式 • 质谱的类型:MS、MS/MS、MSn、TOF、Q-TOF、 SECTOR、 FT-ICR-MS等。 • 离子化方式:EI、NCI、PCI、APCI、ESI、 APPI(大气压光质解析电离源)、MALDI(基 值辅助激光解析离子化)。 • 可以与GC、LC、IC、CE等联接。 • 用于多残留检测的主要有GC-MS、GC-MS/MS、 GC-MSn、 LC-MS/MS、GC(LC)- TOF。 单四极质谱 离子通过改变四极杆的DC/RF电压而被扫描 DC/RF为一个常量 离子阱质谱 原理与四极杆的非常相似,离子被存储在RF和DC场中,扫描 出精确m/z的离子,可以做多极质谱,称为时间串联质谱。 飞行时间质谱 ŠŠ 所有离子同时启动所有离子同时启动 ŠŠ 小的离子移动速度快小的离子移动速度快 ŠŠ 测量已知距离下的速度测量已知距离下的速度((飞行时间飞行时间)) 磁质谱 SECTOR 离子通过变化的磁场和电场被传输 主要用于Dioxins,PCB,PBB,PBDE等检测 9未知化合物 9化合物的鉴定与确认 9谱图检索 9已知化合物 9高效、高灵敏度分析 结构确认 定量 9分子量信息 用质谱检测的目的是什么? 电子轰击源,化学源 70ev的轰击能量,硬电离方式,可以进行谱库检索 化学源是在离子源中加入缓冲气,达到软电离的目的 大气压电喷雾源 大气压化学电离源 串接四极质谱仪 碰撞诱导解离室(碰撞池 CID) 三级四极杆工作模式(一) ¾MS模式 这种模式用于分析未解离的离子 质量。扫描M1、 CID中没有引入裂解气 体,M2为射频电场模式。也可以使M1处 于射频模式,扫描M2电场实现质量测定 MS扫描采集 MS Ion Scan MS1 MS2 Collision Cell Scanning Rf only, pass all masses 在第一个四极杆做选择范围的 Scanning 。 碰撞室和第二 个四极杆设置为让所有的离子都通过到达检测器。 在第一个四极杆做选择范围的 Scanning 。 碰撞室和第二 个四极杆设置为让所有的离子都通过到达检测器。 三级四极杆工作模式(二) 前体离子(母离子)扫描 (precursor/parent ion scanning) 此模式是:扫描 M1电压,M2设定为只传输某一特定质 荷比离子,CID为碰撞室。与中性丢失扫描相似,前体离子 扫描检测离子混合物中在CID碰撞室丢失特定基团的离子。 与中性丢失扫描不同的是前体离子扫描模式直接检测断裂 的基因(报告离子, reporter ion)。检测器检测到报告离 子时,已知M1的电压,所以可以确定产生这一特定碎片的前 体离子的质量。因此前体离子扫描模式可以被用来检测肽 混合物中某些含有特定结构特征的肽段。 Monitor specific fragment ion 母离子扫描 MS1 Collision Cell MS2 StaticCIDScanning 三级四极杆工作模式(三) MS/MS模式(也称为子离子扫描法,product ion scan) 在一个给定的时间点,M1设定为仅传输某一选定质荷 比的离子,此离子进入CID后,经碰撞诱导解离,产生的碎片 离子通过扫描M2进行检测。这样得到与M1选择的初始离子 相关的碎片离子质谱图。 M1选择母离子,在CID内进行诱 导碰撞,M2分析碎片离子,这一分析过程不断循环,用以选 择分析不同质量的离子。实际上,可以设定程序自动在MS 和MS/MS模式间切换,将MS检测到的离子进行CID分析,并记 录 碎片离子的谱图,整个过程不需要用户介入这一过程称 为数据依赖的CID(data-deperkdent CID) 子离子扫描 Product Ion Scans to produce MS-MS spectra for confirmation and structural elucidation CollCell ision MS2 ScanningStatic MS1 三级四极杆工作模式(四) 中性丢失扫描模式(neutral loss scan mode) 此模式中Q1和Q3的电压同步扫描,但保持一个特定 m/z值的电压差(off set)。 Q2是碰撞室,Q1和Q3的电压 差值与Q2内碰撞消除的一个特定中性分子的质量一致。因 此,在离子混合物中,只有碰撞裂解后能丢失这一特定基 团的离子才会被Q3传输到检测器。 中性丢失 Neutral Loss/Gain to monitor loss or gain of specific moiety MS1 Collision Cell MS2 ScanningCIDScanning 三重四极 MS/MS MRM检测方式(五) MS1 Collision Cell MS2 StaticCIDStatic 多离子反应监测 Multiple Reaction Monitoring (MRM) minimises matrix interference high sensitivity accurate and reproducible quantitation 例一质谱测定: Progesterone孕酮 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 m/z0 100 % 315.1 316.1 [M+H]+ O O CH3 CH3 CH3 全扫描(M/Z200-400) MS1 MS2 Collision Cell Static (m/z 315.1) Scanning 子离子扫描 Product Ion Scan 第一个四极杆让固定 Static 荷/质比的母离子通过,而第 二个四极杆选择一个合适的质量范围作扫描 Scanning 。 第一个四极杆让固定 Static 荷/质比的母离子通过,而第 二个四极杆选择一个合适的质量范围作扫描 Scanning 。 Argon gasArgon gas PrecursorPrecursor ProductsProducts 六极杆碰撞室 氩气 • 在碰撞室里, 离子的动能转换成内能。 • 碰撞条件(断裂) 可通过控制加以改变: – 碰撞能量 (离子进入碰撞室的速度) – 碰撞的的机遇 (碰撞气的压力) O CH3 CH3 CH3 O 母离子 O CH2 CH2 H3C CH3 O CH3 子离子 孕酮的子离子产物 300 305 310 315 320 325 330 m/z0 100 % 315.1 316.1 Mass Spectrum from MS1 100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 m/z0 100 % 109.097.0 Product ion spectrum from MS2 多离子反应检测 (MRM) 第一和第二四极杆质量分析器均固定质量/电菏比 Static 第 一四极杆只让母离子通过,第二四极杆让子离子通过。 第一和第二四极杆质量分析器均固定质量/电菏比 Static 第 一四极杆只让母离子通过,第二四极杆让子离子通过。 MS1 MS2 Collision Cell Static (m/z 315.1) Static (m/z 109.0) Argon gasArgon gas Precursor(s)Precursor(s) Product(s)Product(s) MRM 子离子检测图孕酮 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 Time0 100 % 2.75 1ng/mL Progesterone m/z 315.1 > 109.0 欧盟2003/181/EC 法规 根据欧盟规定,动物用药分为两类: Group A 为禁用为药物 (Banned Drugs) 為不得检出且完全禁止使用,法規对于这类药物的 检验方法有:最低检出极限要求 (Minimum Required Performance Limit ,MRPL) 如:硝基呋喃、氯霉素、孔雀绿、兴奋剂等 Group B 为合法可使用的兽药 (Legal Medicine) 对于不同的药物规定有不同的最大允許殘留量 ( Maximum ResidueLimit , MRL) 。 如:四环素类(10种)、磺胺类(20种) 、喹诺酮类 (20种)等 欧盟法规 各种离子的鉴别点数 关于鉴别点(intentification piont) 鉴别点数的规定 欧盟2002/1657/EC 法规(质量控制) 80%-110%大于10 70%-110%1 -10 50%-120%小于等于 1 范 围真实浓度(µg/kg) 没有物质(CRM)时,准确度可以通过测定空白基质中 加入已知量分析物的回收率获得。 准确度:重复分析标准物质,测定的含量(经回收率校 正后)平均值与真值的偏差指导范围如下: 准确度测定的规定 分析过程的质量控制 精密度(变异系数) 16 1 000 µg/kg 23100 µg/kg 32*10 µg/kg 45*1 µg/kg 重现性 %CV质量分数 在重复性条件下,实验室内CV通常在上述数值的一半到三份之二 之间。在实验室内重现性条件下进行的分析,其实验室内CV不应大于 上述重现性CV。质量分数低于100 μg/kg时,用Horwitz方程给出无 法接受的高值。因此,浓度低于100 μg/kg的CV应尽可能低. 在重现性条件下,对参考标准或加标样重复分析的实验室间变异 系数(CV),不得超出Horwitz方程计算的水平。该方程如下: CV=2xE(1-0.5logC) ¾ 对于每个诊断离子,信噪比 >3:1 ¾ 测定至少一对离子丰度比 ¾ 相对离子丰度最大容许偏差 不能超过下 ±50%±50%≤10% ±30%±20%>10%到20% ±25%±15%>20%到50% ±20%±10%>50% CI-GC-MS、GC-MSn LC-MS、LC-MSn (相对) EI-GC-MS (相对) 相对丰度 (%基峰) 分析过程的质量控制对质谱确证方 法的要求 关于微囊藻分类 微囊藻(Micocystis) 是蓝藻门→蓝藻纲→色球藻目→色球藻科 →微囊藻属 微囊藻包括: 假丝微囊藻 铜绿微囊藻 具缘微囊藻 不定微囊藻 水华微囊藻 等 关于微囊藻毒素 微囊藻(Micocystis) 其中多数会产生毒素: MC-RR、-LR、-YR、-LW 、-LF、LA、LY… … 七十多种。 基本结构: 七环肽,包括5个D-型氨基酸和2个可变 的L-型氨基酸组成。两种L-型氨基酸的不同组合 构成了微囊藻毒素的不同异构体。 MC-RR和MC-LR 是其中毒性最大的两种异构体 Micocystis结构图 H OCH3 H CH3 H CH3 H H NH HN N [R2] N [R1] NHH H3C O COOHH O CH3 CH2 O H3C H O H COOHH H CH3 O H ADDA D-Glu Mdha D-Ala D-β-Me-Asp L-PhenL-LeuLF L-TryL-LeuLW L-TyrL-LeuLY L-AlaL-LeuLA L-ArgL-LeuLR L-ArgL-TyrYR L-ArgL-ArgRR R2R1Name 检测方法 1、酶联免疫法(国标GB/T20466-2006 初筛法)目前国内已建立 检出限:0.01ng/ml以下,易出现假阳性。 2、高效液相色谱法(国标GB/T20466-20 06定量法)目前国内已建立 检出限:0.1ug/ml 3、液质联用法(确认与定量法)目前国内未建立 检出限:0.01ng/ml以下 酶标板 ELISA板最常用的材料是聚苯乙烯。聚苯乙烯 具有较强的吸附蛋白质的性能,抗体或蛋白质抗原 吸附其上后仍保留原来的免疫学活性,加之它的价 格低廉,所以被普遍采用。聚苯乙烯ELISA 板由于 原料的不同和制作工艺的差别,各种产品的质量差 异很大,良好的ELISA板应该是吸附性能好,空白 值低,孔底透明度高,各板之间、同一板各孔之间 性能相近。 加 样 在ELISA中一般有3次加样,即加标本,加 酶结合物,加底物。 1、加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部,避免 加在孔壁上部,并注意不可溅出,不可产生气泡; 2、每次加标本应更换吸嘴,以免发生交叉污染; 3、酶结合物应用液和底物应用液时可用定量多道 加液器,使加液过程迅速完成。 保 温 温育常采用的温度有37℃、室温和4℃等。 37℃是实验室中常用的保温温度,也是大多数 抗原抗体结合的合适温度。在建立ELISA方法作 反应动力学研究,实验表明,两次抗原抗体反 应一般在37℃经1-2小时,产物的生成可达顶 峰。室温较37℃可避免蒸发,为加速反应,可 辅以摇床振荡。抗原抗体反应在4℃过夜反应更 为彻底。 洗 涤(决定实验的成败) ELSIA靠洗涤来分离游离的和结合的酶标 记物。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固 相抗原或抗体结合的物质,以及在反应过程中 非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。可以 说在ELISA操作中,洗涤是最主要的关键技 术,应引起操作者的高度重视,操作者应严格 按要求洗涤,不得马虎。 显 色 HRP - TMB显色系统受光照的影响不大,可在 室温中置于操作台上,边反应观察结果。但为保 证实验结果的稳定性,宜在规定的适当时间阅读 结果。TMB经HRP作用后,约40分钟显色达顶峰, 随即逐渐减弱,至2小时后即可完全消退至无色。 各类酸性终止液则会使蓝色转变成黄色,此时可 用特定的波长(450nm)测读吸光值。 常用实验试剂 包被液:磷酸盐缓冲液(PBS pH=7.4), Tris-HCl (pH=7.8),缓冲液或碳酸盐缓冲溶液 (pH=9.6),4℃保存 洗涤液: pH7.4 PBS-Tween--20 封闭液: 含1%BSA的PBS缓冲液,4℃保存 终止液::1mol/LH2SO4 计算每个标准或样品的平均OD450值,并按 以下公式算出B0 根据标准样品的B0值与对应微囊藻毒素浓度 的对数之间的关系做出标准曲线。 标准曲线的绘制 阴性对照 标准或样品 OD OD B =0 结果的计算 OD标准/样品 OD阴性对照 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 -2 -1 0 1 2 3 log(c) B0 y = -0.4674x + 0.6907 -0.4 -0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 -2 -1 0 1 2 3 log(c) B0 根据标准曲线选 取”S”曲线中的直线 部分: y = “x”表示微囊藻毒素 浓度的LOG值,再求 其反对数得到相应的 微囊藻毒素浓度 (ng/ml) (High Performance Liquid Chromatography HPLC) 高效液相色谱 仪器与设备 1、高效液相色谱仪(带梯度洗脱泵,UV检 测器,柱温箱) 2、色谱分离柱ODS C-18 5um,4.6×150mm 3、超声波细胞破碎机 4、离心机(14,000转/分,可分离1.5mL离 心管) 5、固相萃取小柱ODS C-18 Waters PN 6、旋转蒸发仪 7、其他玻璃仪器 水样样品预处理 500mL水样 1 GF/C 滤膜 2 0.45μm 醋酸纤维酯滤膜 3 直接测定或-20℃保存 SPE小柱富集纯化 90%甲醇洗脱,浓缩 H P L C 分析 藻类样品预处理 50-100mg藻样 超声破碎(适当程度) SPE小柱富集纯化 90%甲醇洗脱,浓缩 H P L C 分析 75-85%甲醇三次萃取、浓缩 分离纯化 SPE小柱再生 上 样10mL甲醇、10mL水、抽干 将样液循一次 6mL90%甲醇溶液洗脱 氮气吹干至1mL内 流动相定容至2mL 离心进样 色谱条件 • C18 柱(4.6x250mm) • 流动柱温40℃, • 流速1.0mL/min, • 流动相:A 50 mM 磷酸缓冲液,pH3.0,B 甲醇 A/B(40/60) • 进样量:20uL/次 • 检测波长: 238nm HPLC方法的操作要点 1、藻类样品的细胞壁破碎应使用超声波细胞破碎法。 2、萃取液可在5%的醋酸溶液或75-85%甲醇溶液两者之间 选择。 3、藻类样品必须萃取三次。 4、固相萃取的柱必须严格再生。 5、过SPE柱可重复过两遍,有利藻类毒素的充分吸附。 色谱图 M in u t e s 0 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4 AU 0 . 0 0 0 . 0 2 0 . 0 4 0 . 0 6 0 . 0 8 AU 0 . 0 0 0 . 0 2 0 . 0 4 0 . 0 6 0 . 0 8 LR C h a n n e l A N a m e M in u t e s 0 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4 A U - 0 . 0 0 5 0 . 0 0 0 0 . 0 0 5 0 . 0 1 0 0 . 0 1 5 0 . 0 2 0 0 . 0 2 5 A U - 0 . 0 0 5 0 . 0 0 0 0 . 0 0 5 0 . 0 1 0 0 . 0 1 5 0 . 0 2 0 0 . 0 2 5 LR C h a n n e l A N a m e 色谱图 Minutes 0 2 4 6 8 10 12 14 A U -0.02 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 A U -0.02 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 LR Channel A Name 结果计算 X = XRR + XYR + XLR C × V XXR = —————— W ×1000 式中: X — 水华样品中三种微囊藻毒素异构体的总含量mg/g XXR — 水华样品中单个微囊藻毒素异构体的含量mg/g C — HPLC测得浓度mg/mL V — 试样定容体积 mL W — 试样称重 mg LC-MS/MS法 分离纯化 由于该方法对所有的毒素灵敏度均大于国家 标准的限量值(1ug/L),所以可以将加内标后 的水样,通过0.22 um微孔滤膜过滤后,直接进 样分析。无须同HPLC法进行大容量的富集,这无 疑大大地提高了实验效率。 色谱条件 Acquity UPLC BHE130 C18柱(2.1×100 mm、粒径1.7 μm),柱温: 30℃;样品温度:室温,进样体积:10uL,流速:0.3mL/min, 洗脱梯度 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 2.5 4 4.5 4.9 5 8 时间(min) 强 洗 脱 溶 剂 比 例 (% ) 强洗脱溶剂的选择 乙腈/甲醇 (60/40) 甲醇 五种MCYST在不同流动相对离子化的影响 流动相 MCYST-RR峰面积 MCYST-YR 峰面积 MCYST-LR 峰面积 MCYST-LW 峰面积 MCYST-LF 峰面积 不含有添加 剂 19189 16226 18837 46113 133332 0.1%TFA 1961 1026 2733 25260 77599 0.1%甲酸 13932 8917 28236 72258 244521 0.2%甲酸 16468 10936 30373 88013 248804 20mM醋酸铵 10847 6613 6693 49311 152143 0.1%甲酸+ 20mM 醋酸铵 14064 12197 20054 119244 288941 0.2%甲酸+ 20mM 醋酸铵 15359 11928 18824 115541 275030 五种MCYST在不同类型色谱柱的比较 STD acquity Time 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00 5.20 % 0 100 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00 5.20 % 0 100 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00 5.20 % 0 100 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00 5.20 % 0 100 mcyst-060912-030 Sm (Mn, 2x2) MRM of 6 Channels ES+ TIC 6.21e5 mcyst-060912-016 Sm (Mn, 2x2) MRM of 6 Channels ES+ TIC 5.74e5 mcyst-060912-023 Sm (Mn, 2x2) MRM of 6 Channels ES+ TIC 4.44e5 mcyst-060912-018 Sm (Mn, 2x2) MRM of 6 Channels ES+ TIC 6.09e5 b a c d a symmetry300 C18 (4.6*75mm i.d. particle size 3.5um pore size 300 A) b symmetry300 C18 (2.1*100mm i.d. particle size 3.5um pore size 300 A) c acquity UPLC BEH130 C18 (2.1*100mm i.d. particle size 1.7um pore size 130 A) 效果最好 d acquity UPLC BEH C18 (2.1*100mm particle size 1.7um pore size A) 质谱条件 离子源参数: –电喷雾:正离子 –毛细管电压:3.50kV –锥孔电压:40V –离子源温度:120℃ –锥孔反吹气流量:55 L/hr –脱溶剂气温度:350℃ –脱溶剂气流量:600L/hr。 质量分析器参数: –低端分辨率LF Lens1:12.0V –高端分辨率HM Lens1:12.0V; –入口透镜电压:1V –碰撞梯度:0.5 –出口电压:2V; –低端分辨率LF Lens2:12.0V –高端分辨率HM Lens2:12.0V MCYST的碎片机理 (LR、YR、LA、LY、LW、LF) RR的特征离子和碎片机理 质量条件参数 注:a:所选择的母离子 b:所选择的定量子离子 60213.3 56135.0 bN.D.986.8a986.2MCYST-LF 60213.3 60135.0 bN.D.1025.8 a1025.2MCYST-LW 59213.3 59135.0bN.D.1002.3 a1002.2MCYST-LY 60213.3 57135.0 bN.D.910.9 a910.0MCYST-LA 55213.3 55135.0 b498.4995.6 a995.2MCYST-LR 55213.3 63135.0 bN.D1045.8 a1044.0MCYST-YR 30620.0 28135.0 b520.1 a1038.41038.2MCYST-RR 20397.4 23278.2bN.D.556.5a555.6亮氨酸脑腓肽 碰撞能量 (eV)特征离子[M+2] 2+离子准分子离子[M+1]+分子量名 称 标准品的总离子流色谱图 标准品定量离子色谱图 定量检出限 各标准品浓度均为1ug/L 其LOQ均在0.2ug/L左右 空白水样检测结果 标准曲线 Compound name: YR Correlation coefficient: r = 0.999178, r^2 = 0.998357 Calibration curve: 0.113707 * x + -0.0107396 Response type: Internal Std ( Ref 1 ), Area * ( IS Conc. / IS Area ) Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None Conc 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 R es po ns e 0.000 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500 0.600 0.700 0.800 0.900 Compound name: RR Correlation coefficient: r = 0.999392, r^2 = 0.998784 Calibration curve: 0.687772 * x + 0.0087244 Response type: Internal Std ( Ref 1 ), Area * ( IS Conc. / IS Area ) Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None Conc 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 R es po ns e 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 Compound name: LR Correlation coefficient: r = 0.999662, r^2 = 0.999324 Calibration curve: 0.138101 * x + -0.015116 Response type: Internal Std ( Ref 1 ), Area * ( IS Conc. / IS Area ) Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None Conc 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 R es po ns e 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 标准曲线 Compound name: LW Correlation coefficient: r = 0.996604, r^2 = 0.993220 Calibration curve: 0.102739 * x + -0.0306631 Response type: Internal Std ( Ref 1 ), Area * ( IS Conc. / IS Area ) Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None Conc 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 R es po ns e 0.000 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500 0.600 0.700 Compound name: LA Correlation coefficient: r = 0.999394, r^2 = 0.998789 Calibration curve: 0.130939 * x + -0.0101696 Response type: Internal Std ( Ref 1 ), Area * ( IS Conc. / IS Area ) Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None Conc 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 R es po ns e 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00 Compound name: LY Correlation coefficient: r = 0.996483, r^2 = 0.992978 Calibration curve: 0.158655 * x + -0.0228715 Response type: Internal Std ( Ref 1 ), Area * ( IS Conc. / IS Area ) Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None Conc 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 R es po ns e 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 Compound name: LF Correlation coefficient: r = 0.994270, r^2 = 0.988572 Calibration curve: 0.407957 * x + -0.0996584 Response type: Internal Std ( Ref 1 ), Area * ( IS Conc. / IS Area ) Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None Conc 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 R es po ns e 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 标准曲线 0.994y = 0.407957 x - 0.0996584MCYST -LF 0.997y = 0.102739 x - 0.0306631MCYST -LW 0.999y = 0.0468488 x + 0.018656MCYST -LY 0.999y = 0.130939 x - 0.0101696MCYST -LA 0.999y = 0.138101 x - 0.015116MCYST -LR 0.999y = 0.113707 x - 0.0107396MCYST -YR 0.999y = 0.687772 x - 0.0087244MCYST -RR 相关系数r标准曲线标准品 日内(表1)和日间(表2)精密度 表1(n=11) 表2(n=7) 6.896.667.886.876.116.605.79RSD(%) 1.872.151.371.841.671.602.10Conc.(ug/L) LFLWLYLALRYRRR 13.7613.4512.769.227.217.419.30RSD(%) 1.832.161.311.791.691.652.17Conc.(ug/L) LFLWLYLALRYRRR 方法回收率试验(n=3) 93.82%±5.28%8 97.94%±4.66%3 99.22%±11.51%1 LR 88.65%±4.17%8 93.43±5.33%3 86.00%±12.88%1 YR 93.80%±3.52%8 92.20%±7.42%3 97.50%±8.36%1 RR 回收率加标量(ug/L)名称 85.55%±5.59%8 82.10%±7.95%3 73.50%±9.36%1 LF 79.12%±6.66%8 79.92%±5.20%3 66.24%±14.33%1 LW 79.74%±4.23%8 72.10%±7.20%3 83.69±8.82%1 LY 82.96%±4.06%8 74.65%±4.01%3 75.73%±8.73%1 LA 回收率加标量(ug/L)名称 微囊藻检测总离子流图 慈溪梅湖水样总离子流图 慈溪梅湖水样定性定量离子流图 无锡太湖南泉水样测定结果 无锡太湖南泉水样定性定量离子流图 LC-MS/MS和ELISA两种方法比对结果 LC-MS/MS法测定结果 (μg/L) n=3 ELISA法测定结果(μg/L) 序 号 MCYST-RR MCYST-LR MCYST-LW MCYST-LF TOTAL TOTAL 1 0.529 0.114 N.D. N.D. 0.643 0.716 2 0.723 0.214 N.D. N.D. 0.937 0.903 3 0.788 0.099 N.D. N.D. 0.887 0.871 4 1.156 0.314 N.D. N.D. 1.470 1.478 5 3.123 0.766 N.D. N.D. 3.889 3.675 6 34.294 8.235 N.D. N.D. 42.529 47.635 7 49.908 9.654 N.D. N.D. 59.562 57.249 8 49.786 12.081 N.D. N.D. 61.867 64.505 9 54.091 10.007 N.D. N.D. 64.098 67.020 10 53.147 12.528 N.D. N.D. 65.675 69.252 LC-MS/MS和HPLC两种方法比对结果 水 样 序 号 LC-MS/MS (µg/L) n=3 HPLC (µg/L) n=3 RR LR RR LR 1 210.84 43.88 218.37 43.39 2 61.67 13.81 57.01 16.71 3 44.81 9.26 39.27 9.61 4 41.61 9.01 41.28 9.89 5 42.74 7.50 45.55 6.90 6 67.73 12.60 70.250 13.338 7 74.57 14.08 73.41 13.41 8 72.91 13.48 73.410 13.792 9 71.99 13.41 71.246 13.408 10 71.03 13.80 74.778 14.010 11 75.35 14.00 75.584 13.994 不同时期污染的水体的检测结果 0.000 10.000 20.000 30.000 40.000 50.000 60.000 April.29 May.17 June.2 June.21 July.5 Co nc . RR LR total 结 论 选用LC-MS/MS法的MRM方式检测水体样品中的MCYST,灵敏度高, 不须经过复杂的富集萃取过程,实验效率明显提高。 采用了UPLC分离技术,利用甲醇/乙腈/水为流动相,能在8分 钟内分离7种MCYST。 采用三重四极杆质谱的多离子反应监测(MRM)方式,分别确 定7种MCYST的[M+1]或[M+2]为母离子,经碰撞能量优化试验,确 定特征子离子,可获得极高的检测灵敏度,方法检出定量限 (LOQ)均低于1μg/L的限量5倍以上,满足了低含量MCYST样品的 检测要求。 方法学验证表明,本方法精密度高,回收率稳定,适宜作为 在自然水体中监测MCYST含量的方法。 霉菌污染的农作物 什么是霉菌毒素? “Myco”: 霉菌 “toxin”: 毒素 由霉菌产生的具有生物毒性的次级代谢产物; 由多种霉菌产生; 几乎所有的农作物都可能被污染; 已知的霉菌毒素多达300种以上; 化学性质稳定; 耐高温; 耐持久; 耐加工过程中的各种处理。 曲霉菌属 黄曲霉毒素 肝毒素,致癌物质 赭曲霉素 肾毒素,致癌物质 柄曲霉素 致癌物质 镰刀菌属 T-2毒素 皮肤坏疽,出血 呕吐毒素 引起呕吐反应 雪腐镰刀菌烯醇 皮肤坏疽,出血 玉米赤霉烯酮 雌激素综合征 伏马毒素 致癌物质 青霉菌属 橘青霉素 肾毒素 展青霉素 有毒物质,致癌物质 Rubratoxins 肝毒素 Penitrems 颤栗 Penicillic acid 致癌物质 霉菌产生毒素及其毒性 各种农作物中易污染的霉菌毒素 玉米 黄曲霉毒素, 桔霉素, 呕吐毒素, 伏马毒素, T-2毒素, 玉米赤霉烯酮 小麦 桔霉素, 伏马毒素, Moniliformin, T-2毒素, 玉米赤霉烯酮 大麦 桔霉素, 呕吐毒素, 赭曲霉素, T-2 毒素, 玉米赤霉烯酮 豆制品 赭曲霉素 咖啡 赭曲霉素 棉籽 黄曲霉毒素 水果 赭曲霉素, 棒曲霉素 花生 黄曲霉毒素, Cyclopiazonic acid 稻米 桔霉素,伏马毒素, T-2毒素 树籽 黄曲霉毒素, Tremorgens 高粱 黄豆 大麦 香料 菜籽 小麦 葵花子 燕麦 玉米 Pictures from Internet Pictures from Internet 霉菌毒素致病特点 ☆ 人、畜禽食用有霉菌毒素的食物或饲料会发生急性 中毒、慢性中毒及致癌作用. ☆ 季节性、区域性. ☆ 由于霉菌毒素是小分子有机化合物,不是复杂的蛋 白质分子,所以在机体中无法产生抗体,也不能免疫。 霉菌毒素的致癌机理 ☆ 霉菌毒素与细胞大分子结合, 如DNA, RNA 在体内进行活化的部位是细胞的微粒体,催化这种反应的 酶主要是微粒体中的混合功能氧化酶. 与DNA或RNA大分子结合,导致基因结构或表达上的异常, 从而使正常的细胞转为癌细胞 毒素与大分子特别是DNA结合的活性越高,结合量越大,则 其致癌性及致突变性就越强, Aflatoxin B1 ☆ 抑制生物体的免疫功能 ☆ 伴随着毒素的产生可将基质中的某些成分转化为致 癌物质的前体,或将无致癌性物质转化为致癌物. 从霉变的玉米面饼中可检出致癌性亚硝胺的前体物质二 级胺,亚硝酸盐和硝酸盐 ZZ1 美国、欧盟和中国主要食品霉菌毒素的限量 60ZON 1000DON 5赭曲霉毒素 A 0.5黄曲霉毒素M1 551020黄曲霉毒素B1 总黄曲霉毒素 乳制品 鲜乳婴幼儿食品 其他粮食、豆类、发酵食品 大米、植物油、(除玉米油、花生油)玉米、花生及其制品 中国 (ppb) 毒素名称 50100ZON 20010001000DON 0.55赭曲霉毒素 A 0.050.0250.5黄曲霉毒素M1 0.12黄曲霉毒素B1 2420总黄曲霉毒素 乳制品乳制品 牛奶婴幼儿食品农产品牛奶婴幼儿食品所有食品 欧盟 (ppb)美国 (ppb) 毒素名称 霉菌毒素的实验室检测方法 霉菌毒素理想的检测方法,应该是先进、 快速、灵敏、准确、经济、简单、安全的。霉菌 毒素的实验室检测方法一般分为两类: 1、快速筛选法 2、定量法 3、确证法 霉菌毒素检测方法类型 定 量 HPLC/GC/LC- MS/GC-MS 酶联免疫学法 荧光检测法 确认仲裁 TLC HPLC LC-MSMS TLC LC GC LC/GC-MS ELISA Fluorometry .... frequency of techniques 定性 / 半定量 薄层色谱法 酶联免疫学方法 荧光法 国标测定方法 ★ 薄层色谱法 (GB/T 5009.23-2006第一法) ★ 微柱筛选法 (GB/T 5009.23-2006第二法) ★ 液相色谱法 (GB/T 5009.23-2006第三法) ★ 液相色谱-质谱联用法 1. 快速筛选法 目前,国际上使用较为普遍的霉菌毒素 快速筛选法有荧光光度计法和酶联免疫法。 前者常常结合免疫亲和柱净化使用,是美国 AOAC的标准检测方法,以黄曲霉毒素检测为 例,它可以检测黄曲霉毒素总量达到2ppb以 下,符合欧盟的指令要求。 缺点:假阳性率高。 幻灯片 97 ZZ1 例如,在霉变的玉米面饼中可以检测到致癌性亚硝胺的前提物质二级胺,亚硝酸盐和硝酸盐. ZHANGZHE, 2004-11-10 微柱筛选法原理 GB/T 5009.23-2006第二法 试样提取液通过由氧化铝与硅镁吸附剂组成 的微柱层析管,杂志被氧化铝吸附,黄曲霉毒素 被硅镁吸附剂吸附,在265 nm 紫外线下呈蓝紫 色荧光,其荧光强度在一定范围内与黄曲霉毒素 的含量成正比。 本方法只能检测黄曲霉毒素的总量 2.定量法 霉菌毒素定量法一般有高效液相色谱法 (HPLC)、气相色谱法(GC)以及经典的薄层 色谱扫描法(TLC)等。其中,高效液相色谱 结合荧光或紫外检测器法(HPLC)因其灵敏 度高、检测限低、自动化程度高等优点在国 际上得到了最为广泛的使用。 薄层色谱法 GB/T 5009.23-2006第二法 原理: 样品经过提取、浓缩、薄层分离 后,在365nm紫外光下,黄曲霉毒素 B1、B2产生蓝紫色荧光,黄曲霉毒素 G1、G2产生黄绿色荧光。 HPLC法 GB/T 5009.23-2006第三法 试样经乙腈-水提取,提取液过滤后,经装有 反相离子交换吸附剂的多功能净化柱,去除脂肪、 蛋白质、色素及碳水化合物等干扰物。净化液中的 黄曲霉毒素与三氟乙酸衍生,用带有荧光检测器的 液相色谱系统分析,外标法定量。 仪器与设备 1、高效液相色谱仪-荧光检测器 2、反相色谱柱C18 3、反相离子交换净化柱 4、电动震荡器 5、旋涡混合器 6、烘干箱 7、离心机 8、氮气吹干机 样品预处理 样品用乙腈/水(84/16)提取 提取液在SPE柱中富集净化 用水/乙腈(85/15)溶解 上清液进样分析 净化液吹干后用正己烷和三氟乙酸衍生化 衍生物吹干 色谱条件 • C18 柱(12.5 X 2.1mm, 5um) • 流动柱温30℃, • 流速0.5 mL/min, • 流动相:乙腈/水 • 进样量:25 uL/次 • 激发波长:360nm 发射波长:440nm 梯度洗脱 851514 75258 83176 85150 水 (%) 乙腈 (%) 时间 (min) 标准品色谱图 A F G 2 - 7 .7 41 10 .7 56 A F G 1 - 1 2. 61 4 A F B 2 - 2 8. 40 0 A F B 1 - 3 0. 63 7 EU 0.00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 120.00 140.00 160.00 Minutes 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 花生酱阳性样品色谱图 6. 02 6 9. 43 4 11 .1 62 A F B 2 - 2 7. 60 2 EU 0.00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 120.00 140.00 160.00 Minutes 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 阴性样品色谱图 EU 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 Minutes 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 结果计算 A × V c = —————— m ×f 式中: c — 试样中每种黄曲霉毒素的浓度,ug/kg A — 试样按外标法在标准曲线中对应的浓度,ug/kg V — 试样提取过程中,提取液的体积mL m — 试样取样量 g f — 试样溶液衍生后较衍生前的浓缩倍数 3.最新的确证法 应用超高压液相色谱-电喷雾串联四极杆质谱联用技术UPLC-MS/MS, 在多反应离子检测方式下(MRM)对食品中17(22)种曲霉、青霉和镰刀菌等 霉菌毒素污染进行检测。经方法学研究验证:在ESI+电离方式下10种霉菌 毒素的最低定量限LOQ范围为0.01~0.20 μg/kg,均低于欧盟、美国和 其它各国对饲料、食品(包括儿童食品)中各种霉菌毒素的最低限量。 在ESI- 电离方式下7种霉菌毒素的最低定量限LOQ范围为0.2 ~ 0.5 μg / kg;17种霉菌毒素在各自线性定量范围内,相关系数r2均大于 0.999;低、中、高浓度添加回收率范围为70.6 ~ 119.0 %。该方法具 有预处理简单、检测速度快、灵敏度高的优点,可适用于复杂基质样品 中多组分霉菌毒素的确认和准确定量检测,能满足各国对上述霉菌毒素 的最低检出要求。 色 谱 柱:Waters ACQUITY UPLC BEH,C18柱 2.1×100 mm 粒径1.7 um。 柱 温:35℃. 样品温度:25℃ 。 进样体积:5µL。 流 速:0.3mL/min。 运行时间:10 mins 。 流 动 相A: (ESI+) 10mM 醋酸铵溶液 (ESI-) 0.1 % 氨水溶液 流动相B:甲 醇 色谱条件 620800.37.0 110000.36.5 610000.35.8 685150.35.5 120800.30 梯度变化B % A % 流 速 ml/min 时 间 min 质谱条件 离子源:ESI+; 毛细管电压:3.60k
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