刺参酸性粘多糖的分离及鉴定

烟台师范学院学报(自然科学敝) Yantai Teachers University Journal(Natural Science) 2B一2ff 刺参酸性粘多糖的分离及鉴定 王旭珍墨堑 徐士良 尺 Z (烟台师范学院化学系 ．烟台 264025) 摘要 将刺参体壁用 0．5 mol／L K2CO3抽提，胰酶水解，乙醇沉淀得多糖粗品，再经过氧化氢 脱色、萃取脱蛋白质、透析除盐等工艺制得多糖纯品．此多糖纯品经凝胶电泳和醋纤薄膜电泳 证明为均一性多糖．红外光谱分析表明，样品具有典型的多糖吸收蜂．薄层色谱分析确定其单 糖组成为葡萄糖醛酸、氨基半乳糖和岩藻糖．此外．样品富舍硫酸基团，属典型的酸性杂多糖， HPLC测定其平均相对分子量为 51)000． 关键词 刺参，酸性粘多糖， 离，鉴定 中图法分类号 O656 刺参是我国北方海出产的唯一食用参，药用价值很高，自古被视为佐膳珍品，其滋补 强身作用在历代医著中多有记载．研究表明，蒯参的有效生理活性物质为酸性粘多糖 ，具 有抗肿瘤、抗衰老、抗凝血等作用，对皮肤癌的疗效可达 5O ～6O％ ．此外，刺参多糖 作为天然高分子化合物，其聚阴离子与水有较强的亲和力，能进行高度水化作用而使水分 滞留，从而具有优良的保湿功能0 ，用于化妆品中，能给予皮肤、毛发适度的弹力，改善皮 肤含水量，起到防皱抗衰老的作用．有鉴于此，我们拟开发刺参，使之酸性粘多糖作为化妆 品的天然营养添加剂．本文主要研究刺参多糖的提取、分离及性质鉴定，有关其应用研究 已另文报道 u． 1 实验部分 1．1 主要仪器、材料与试剂 主要仪器有高速组织捣碎机、台式高速离心机、电泳仪、MAGNA-550型红外分光光 度计(美国尼高力公司生产)及 Water一510型高压液相色谱仪(美国Water公司生产)．鲜 剌参购 自山东蓬莱，去内脏，冷冻保存，试剂有胰蛋白酶(1：25(1，3．6 u／rag，进口分装)、 甘露糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸、氨基半乳糖(上海试剂厂生产)、岩藻糖(Fluaka试剂)． 1．2 实验方法 1)剌参多糖的提取 将解冻后的刺参洗净、绞碎，用高速组织捣碎机匀浆，加少量 * 山东省教委科研基盒资助课题． 收稿 日期 L999—04—13 维普资讯 http://www.cqvip.com 烟台师范学院学报(自然科学版) 第 15卷 水，加人研碎的固体K c 使终浓度为 0．5 mol／L，于 ∞c水浴搅拌提取 2～3 h．用 6 mol／L Ha调到pH 8．5左右，加入胰蛋白酶(重量分数为0．4 )，在 52土1℃水浴中搅拌 酶解 4～5 h，保持 pH 8．5士0．3．速冷至 3O c以下，保持 30rain终止反应．回调 pH值至 6．8～7．2，高速离心分离，收集母液．在不断搅拌下，缓缓加人乙醇，低温过夜，即生成大量 絮状沉淀．次 日离心收集沉淀．依次用乙醇洗涤，丙酮脱水，55℃真空干燥 ，即得到浅褐色 多糖粗品，收率为鲜重的2．8 ． 2)刺参多糖的纯化 将多糖粗品配成 5 的水溶液，离心去不溶物，用稀 NaOH调 pH至 9．0，滴加30％的H Oz(与待测液的体积比为1：10)，于 5O℃保温2 h左右，溶液由 褐色转为浅黄色半透明．冷至室温 ，调pH至 7．0，用 Sevag法0 萃取脱蛋 白(萃取剂与氯 仿一戊醇的体积比为 5：1，用量为糖液体积的1／5)，后置透析袋 中流水透析一昼夜 ，蒸馏 水透析一 日．将透析液减压浓缩至原体积的1／3，反复酵析，即得 白色刺参多糖 ，收率为鲜 重的 0．25％． 1．3 测试方法 1)琼脂糖凝胶电泳 用 0．7 琼脂糖溶液制板(5 cm×10 cm)，缓冲液为 0．05 mol／L乙二胺溶液(pH8．5)，固定电压 150 V，电泳 1～1．5 h，以 0．1 十六烷基三 甲基溴 化铵固定，0．1 甲苯胺蓝染色． 2)醋酸纤维薄膜电泳“ 醋纤薄膜 2 cm×8 cm，缓冲液为 0．025 mol／L硼砂溶液 (pH 12．5)，电压为 250V，时间 35 min，0．5 甲苯胺蓝染色． 3)红外光谱及多糖组成测定 取干燥多糖样品 2 mg，KBr压片，在 4 000~400 cm 内进行扫描，测特征吸收峰．取多糖样品 10 mg，加 4 mol／L H。SO。2 mL，封管，于 100"C下水解 10 h．水解液用BaC'O~中和，过滤，滤液浓缩后进行薄层色谱分析．以 0．1 mol／L磷酸二氢钠溶液和硅胶 G制板(10 cm×20 cm)，100 C下括化 2h．展开系统为正丁 醇 ：乙酸乙酯 ：吡啶 ：醋酸 ：水一4：4：1．5：l：1(体积 比)，上行展开约 110 min．显 色剂为苯胺一邻苯二 甲酸． 4)分子量测定 将糖样装入 ㈣ c层析柱，用重蒸馏水洗脱，流速为 1 mL／mln，由 示差折光仪检测 ，查标准曲线确定其相对分子量． 2 结果与讨论 1)刺参多糖的理化性质 刺参多糖为白色无定形粉末 ，无臭无味，有吸湿性 ，水溶性 良好，先胀后溶 ，溶液呈粘性，特性粘度[∞ =64．7 mL／g(0．1 mol／L NaCI溶液)，以 1 水溶液测定比旋光度[ =--56。；不溶于乙醇、丙酮、氯仿等有机溶剂，其水溶液可被十 六烷基三甲基溴化铵(cTAB)和氯化十六烷基吡啶(cPC)络合沉淀，并可与K ，Na 等金 属离子形成盐类沉淀析出，具有高聚阴离子的性质． 2)纯度鉴定 琼脂糖电泳和醋纤薄膜 电泳测定结果表明，样品皆向阳极泳动，显示 单一带 ，清晰集中无拖尾现象，证明样品为均一性多糖． 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 3期 王旭珍等：刺参酸性牯多糖的分离及鉴定 215 3)红外光谱分析 样品红外光谱分析结果见图 1．由图 1可见，样品显示如下特征 吸 收峰 ：3 440 cm 附近 的羟基伸 缩振动峰(分子问氢键)，2 930 cm ．2 860 cm-。的 G—H 伸缩振动峰 ；1 645 cm 附近吸收峰归属于羧基 的伸缩振动，1 568 cnl 可能为 N—H 的变角振动；1 400 cm_1的强吸收表明样品中有离子型羧基存在，1 250 cm 处强 吸收归属于 S==O 伸缩振动；1 166，1 130 cm 吸收为吡喃环的羟基上 (’_O 伸缩振 动，1 050，1 030 cm (强)吸收峰由糖环 卜 C 伸缩振动引起．指纹区 960，930 cnl_1 显示环的骨架振动．850，820 cm_1处有较强的吸收峰 ，而在 900 cm_1处无吸收带，提示糖 链中氨基半乳糖上硫酸基的位置及构象可能为 a构型0 ．总之，刺参多糖样品 IR谱图与 文献报道基本一致，表明样品为纯组分． 4)多糖组成与分子量测定 多糖样品经酸水解和薄层层析，结果如图 2所示．与 5 种标准单糖相对照，仅检出葡萄糖醛酸(褂 一O．05)、氨基半乳糖(PJ一0．20)和岩藻糖(褂 一 0．38)，这表明该刺参多糖由以上几种单糖组成．I-IPLC柱层析结果与 由已知分子量多 糖制备标准曲线对照．得其相对分子量为 50 000． ⋯‘ 图 2 多糖水解产物的 TLC谱 图 图 i 刺参多糖的红外光谱图 s样品}R标准单糖混台物}1葡醛酸}2氮基 a文[2]谱图；b多糖纯品}c多精粗品 半乳糖}3葡萄糖}4甘露精 }5岩藻糖样品 5)颜色反应 0．2 多糖水溶液各取 20阻 ，点样于滤纸上，用Sch酐试剂染色呈玫 瑰红色斑点 ，用甲苯胺兰染色呈蓝色，与酚一硫酸反应出现棕色环，与 Fehling试剂、碘一碘 化钾反应呈阴性． 6)硫酸基的鉴别 样品加 6 mol／L盐酸溶解后 ，置沸水浴封管水解 1h．滴加 Baclz 试剂 ，立即生成白色沉淀，表明含有硫酸基团，印证了 IR谱图中 1250 cm_1处强吸收峰的 归属． 综上所述，采用碱解和酶解两步提取、过氧化氢脱色、萃取脱蛋白、乙醇分级沉淀等技 术进行分离纯化获得的刺参多糖，经电泳分析和IR分析，初步认为是单一多糖成分．TLc 分析确定其单糖组成为葡萄糖醛酸、氨基半乳糖、岩藻糖及硫酸基 团，具有高聚阴离子的 性质，相对分子量为 50 000．至于多糖精细结构的确定，还有待于进～步研究． 维普资讯 http://www.cqvip.com 218 烟台师范学院学报(自然科学版) 第 l5卷 参 考 文 献 1 马同江，周清凯，蔡云见．海参的药理作用及应用．海洋药物，1982，2(2)：9～13 2 樊绘曾，胨菊娣，林克忠．刺参酸性粘多糖的理化性质、毒性丑抗肿瘤研究．药学学报 ，1980，15(5) 263～ 269 8 赵维蓉．刺参营养穰的制备及在化妆品中的应用韧探．化妆 品学．台肥 ：安徽科学技术出版社，1990． 376～ 381 4 王旭珍等．刺参营养液的制备及在化妆品中的应用初探 ．日用化学工业(待发表) 5 方积年．多糖的分离纯化及其纯度鉴别与分子量测定．药学通报，1984，19(10)：46~49 6 张惟杰．复舍 多糖生化研究技术．上海：上海科学技术出版社，1981．73~74 · 7 吴东儒，塘类的生物化学．北京 ：高等教育出版社，1987．814~858 第一作者筒舟：王旭珍，女，30岁，硕士．讲师．巳发表的有 褐煤超临界柚提产物的结构研究” “GC／MS分析煤抽出物中的音硫多环芳香化台物”，“催他动力学光度法测定微量钴 莓． Isolation and identificaion of the acidic polysaccharide in Stichopus japonicus Wang Xuzhen Zhang Xiuxiang Xu Shiliang (Depemment of Chemistry·Yanmi Teachers Universe,．Yantai 264025) Abstract After extraction with K2C03 and hydrolysls wi th enzyme，the body wall 0f Sticho- ires细研l m was fractionally precipitated with alcohol，then decoloufized with H2 and fur- ther purified by Sevag method，the acidic polysaccharide(．42S)was obtained．The APS is shown to be pure by agaroge gel electrophoresis and cellulose acetate film electrophoresis． e arialysis of IR spectrum scanning shows a characteristic absorption bands of polysaccha— ride．Its monosaccharide composition is identified by thin—layer chromatography． The results ind icate that the APS consists of D-galactose．rhamnose galacturonic acid and abundant sul— fate．Its average relative molecular weight is estimated to be 5O 000 by HPLC． Key words St／chopus 户∞zf ，acidic polysaccharide，isolation ，identification (责任编辑 司丽琴) 维普资讯 http://www.cqvip.com