为了正常的体验网站,请在浏览器设置里面开启Javascript功能!
首页 > 细胞培养用液的配制与消毒

细胞培养用液的配制与消毒

2010-11-19 9页 doc 54KB 242阅读

用户头像

is_704079

暂无简介

举报
细胞培养用液的配制与消毒一、器材与试剂:   干粉型培养基、胰蛋白酶,青霉素、链霉素.纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器。   具体步骤:   (1)水的制备:   细胞培养用水必须非常纯净,不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水.   (2)PBS的制备与消毒(也可用于其它BSS(balanced salt solution 平衡盐溶液),如:Hanks,D-Hanks液的配制):   1.溶解定容:将药品(NaCl8.0g,KCl0.2g,Na2HPO4·H2O1.56g,KH2PO40.2g)倒入盛有双蒸水的烧杯中,玻...
细胞培养用液的配制与消毒
一、器材与试剂:   干粉型培养基、胰蛋白酶,青霉素、链霉素.纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器。   具体步骤:   (1)水的制备:   细胞培养用水必须非常纯净,不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水.   (2)PBS的制备与消毒(也可用于其它BSS(balanced salt solution 平衡盐溶液),如:Hanks,D-Hanks液的配制):   1.溶解定容:将药品(NaCl8.0g,KCl0.2g,Na2HPO4·H2O1.56g,KH2PO40.2g)倒入盛有双蒸水的烧杯中,玻璃棒搅动,充分溶解,然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml,摇匀即成新配制的PBS溶液。   2.移入溶液瓶内待消毒:将PBS倒入溶液瓶(大的吊针瓶)内,盖上胶帽,并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。   (3)胰蛋白酶溶液的配制与消毒:   胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关,在pH为8.0、温度为37℃时,胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时,应把握好浓度、温度和时间,以免消化过度造成细胞损伤。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性,所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS,如:D-Hanks液。终止消化时,可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。   1.称取胰蛋白酶:按胰蛋白酶液浓度为0.25%,用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水(若用双蒸水需要调PH到7.2左右)或PBS(D-hanks)液中。搅拌混匀,置于4℃内过夜。   2.用注射滤器抽滤消毒:配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器(0.22微米微孔滤膜)抽滤除菌。然后分装成小瓶于-20℃保存以备使用。   (4)青、链霉素溶液的配制于消毒   1.所用纯净水(双蒸水)需要15磅高压20分钟灭菌。   2.具体操作均在超净台内完成。青霉素是80万单位/瓶,用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万单位/瓶,加5ml灭菌双蒸水,即每毫升各为20万单位。   3.使用时溶入培养液中,使青链霉素的浓度最终为100单位/ml。1单位=1微克   (5)RPMI1640的制备与消毒:   1.溶解、调PH值、定容:先将培养基粉剂加入培养液体积2/3的双蒸水中,并用双蒸水冲洗包装袋2-3次(冲洗液一并加入培养基中),充分搅拌至粉剂全部溶解,并按照包装说明添加一定的药品.然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各0.5ml,使青链霉素的浓度最终各为100单位/ml。然后用一个当量的盐酸和NaOH调PH到7.2左右。最后定容至1000ml,摇匀。   2.安装蔡式滤器:安装时先装好支架,按放好滤膜,用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。   3.抽滤:配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。   4.分装:将过滤好的培养液分装入小瓶内置于4℃冰箱内待用。   5.使用前要向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液(4℃时两周有效)。   (6)血清的灭活:   细胞培养常用的是小牛血清,新买来的血清要在56℃水浴中灭活30分钟后,再经过抽滤方可加入培养基中使用。   (7)HEPES溶液:   HEPES的化学全称位羟乙基呱嗪乙硫磺酸(N’-a-hydroxythylpiperazine-N’-ethanesulfanicacid)。对细胞无毒性作用。它是一种氢离子缓冲剂,能较长时间控制恒定的pH范围。使用终浓度为10-50mmol/L,一般培养液内含20mmol/LHEPES即可达到缓冲能力。   1mol/LHEPE缓冲液配制方法如下:   准确称取HEPTS238.3g,加入新鲜三蒸水定容至1L。过滤除菌,分装后4℃保存。   注意:因为现在市售HEPES为约10g包装的小瓶,所以可根据实际情况灵活配制,但是要保证培养液内HEPES的终浓度仍然为20mmol/L。如:称取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中,过滤除菌后可完全(20ml)加入1L培养液中,或者每100ml培养液中加入2ml即可。   (8)谷氨酰胺:   合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺,其作用非常重要,细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质,谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应该补加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定,4℃下放置1周可分解50%,故应单独配制,置于-20℃冰箱中保存,用前加入培养液。加有谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2周以上时,应重新加入原来的谷氨酰胺。   一般培养液中谷氨酰胺的含量为1~4mmol/L。可以配制200mmol/L谷氨酰胺液贮存,用时加入培养液。配制方法为,谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液,充分搅拌溶解后,过滤除菌,分装小瓶,-20℃保存,使用时可向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液。   (9)肝素溶液的配制:   含有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高,肝素加入全培养液中最终浓度为50ug/ml。因为现在市售的多为肝素钠,包装为约为0.56克/瓶,配制时,可将其溶于100ml三蒸水中,定容,过夜,然后过滤除菌,分装小瓶,保存温度为​​℃。使用时,向100ml培养液中加入1ml(精确可加入0.9ml)即可。   (10)Ⅰ型胶原酶:   0.1%Ⅰ型胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制和消毒灭菌。注意:因为Ⅰ型胶原酶分子颗粒比胰酶大,不容易过滤,因此可以用蔡式滤器过滤除菌。分装入10ml小瓶-20℃保存。   (11)明胶溶液:   因为明胶难于过滤,所以配制0.1%明胶溶液必须用无菌的PBS配制。所以制备过程中必须要注意无菌操作。首要的问题是如何无菌准确称量0.1克(配成100ml溶液)—即解决无菌分装药品的问题。其次要注意即使是0.1%的溶液,明胶也难溶,因此要充分摇匀,过夜放置,然后无菌分装入50ml小瓶中,4℃保存。   (12)其他培养用液的配制:   20ug/ml内皮生长因子,   注意事项:   1.配制溶液时必须用新鲜的蒸馏水。   2.安装蔡式滤器时通常使用孔径0.45微米和0.22微米滤膜各一张,放置位置为0.45的位于0.22微米的滤膜上方,并且要特别注意滤膜光面朝上。   3.配制RPMI1640培养基时因为还要加入小牛血清,而小牛血清略偏酸性,为了保证培养液PH值最终为7.2,可在配制时调PH至7.4。   五.细胞传代培养(消化法)   具体操作:   (1)传代前准备:   1.预热培养用液:把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。   2.用75%酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。   3.正确摆放使用的器械:保证足够的操作空间,不仅便于操作而且可减少污染。   4.点燃酒精灯:注意火焰不能太小。   5.准备好将要使用的消毒后的空培养瓶,放入微波炉内高火,8分钟再次消毒。   6.取出预热好的培养用液:取出已经预热好的培养用液,用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。   7.从培养箱内取出细胞:注意取出细胞时要旋紧瓶盖,用酒精棉球擦拭显微镜的台面,再在镜下观察细胞。   8.打开瓶口:将各瓶口一一打开,同时要在酒精灯上烧口消毒。   (2)胰蛋白酶消化;   1.加入消化液:小心吸出旧培养液,用PBS清洗(冲洗),加入适量消化液(胰蛋白酶液),注意消化液的量以盖住细胞最好,最佳消化温度是37℃。   2.显微镜下观察细胞:倒置显微镜下观察消化细胞,若胞质回缩,细胞之间不再连接成片,明此时细胞消化适度。   3.吸弃消化液加入培养液:弃去胰蛋白酶液,注意更换吸管,加入新鲜的培养液。   (3)吹打分散细胞:   1.吹打制悬:用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。   2.吸细胞悬液入离心管:将细胞悬液吸入10ml离心管中。   3.平衡离心:平衡后将离心管放入台式离心机中,以1000转/分钟离心6~8分钟。   4.弃上清液,加入新培养液:弃去上清液,加入2ml培养液,用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。   (4)分装稀释细胞:   1.分装:将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中,加入适量培养基旋紧瓶盖。   2.显微镜下观察细胞:倒置显微镜下观察细胞量,必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长,传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。最后要做好标记。   (5)继续培养:   用酒精棉球擦拭培养瓶,适当旋松瓶盖,放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25%时为一个+,占50%为++,占75%时为+++。   传代细胞培养注意事项:   1.严格的无菌操作   2.适度消化:消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响,消化过程中应该注意培养细胞形态的变化,一旦胞质回缩,连接变松散,或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。   附:EDTA(0.02%乙二胺四乙酸二钠)消化液配方:   EDTA0.20g,NaCl8.00g,KCl0.20g,KH2PO40.02g,葡萄糖2.00g,0.5%酚红4ml,加入蒸馏水定容至1000ml。10磅20min高压灭菌,使用时调节PH值到7.4。注意EDTA不能被血清中和,使用后培养瓶要彻底清洗,否则再培养时细胞容易脱壁。   六.细胞的复苏   细胞复苏的原则-快速融化:必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃,使细胞外冻存时的冰晶迅速融化,避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶,对细胞造成损害。   具体操作   (1)实验前准备:   1.将水浴锅预热至37℃   2.用75%酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。   3.在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。   (2)取出冻存管:   1.根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。   2.从液氮罐中取出细胞盒,取出所需的细胞,同时核对管外的编号。   (3)迅速解冻:   1.迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻,并要不断的摇动,使管中的液体迅速融化。   2.约1-2min后冻存管内液体完全溶解,取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁,再拿入超净台内。   (4)平衡离心:   用架盘天平平衡后,放入离心机中3000r/min离心3min   (5)制备细胞悬液:   1.吸弃上清液。   2.向离心管内加入10ml培养液,吹打制成细胞悬液。   (6)细胞计数:   细胞浓度以5×105/ml为宜。   (7)培养细胞   将复合细胞计数的细胞悬液分装入培养瓶内,将培养瓶放入37℃和5%CO2的培养箱内2-4小时(或者24-48小时)后换液继续培养,换液的时间由细胞情况而定。   初学者易犯错误:   1水浴锅未预热或者未预热到37℃。   2.水浴锅内冻存管太多,导致传热不佳,使融化时间延长。   3.离心前忘记平衡,导致离心机损坏和细胞丢失。   4.一次复苏细胞过多,忘记更换吸头和吸管,导致细胞交叉污染。 附:平衡盐溶液(balanced salt solution,BSS)的配制   BSS是在Rringer生理盐水基础上发展起来的。它是人工合成培养基的基础用液,又常用来洗涤组织细胞。其主要成分是无机盐和葡萄糖。无机离子是细胞的重要成分,维持细胞渗透压及其生存环境的稳定;葡萄糖供给细胞生存所需的能量。BSS液中少量酚红是作为溶液酸碱度变化的指示剂,溶液变酸时呈黄色,溶液弱碱性(pH7.2—7.4)时呈深红色,pH值升高到7.6以上时为紫红色。在碳酸盐缓冲系统中,NaHCO3具有调节CO2浓度的作用。   Hanks液和Earle液是多数培养基的基础溶液,两者的主要区别是缓冲能力不同。Hanks液的NaHCO3含量较低(0.35克/升),其缓冲能力较弱,一般用空气平衡,即利用空气中的CO2使溶液pH值平衡。   Earle含有高浓度的NaHCO3(2.2克/升),其缓冲能力较强,溶液pH值需在5%的CO2培养箱中才能达到平衡。 1.BSS液的配制方法(以Hanks液为例) 甲液:Na2HPO4·2H2O 0.06克 KH2PO4 0.06克 MgSO4·7H2O 0.20克 葡萄糖 1.00克 NaCl 8.00克 三蒸水 750毫升 乙液:CaCl2 0.14克 三蒸水 100毫升 ①将乙液徐徐加入甲液中。②将0.35克NaHCO3溶解在37℃ 100毫升三蒸水中。③用数滴NaHCO3液溶解0.02克酚红。④将②、③液移入①液中。⑤用三蒸水定容至1000毫升,充分混匀,4℃冰箱过夜。⑥滤过消毒,小瓶分装,冷藏。 注意:酚红对细胞有一定毒性,目前实验中的用量除0.02克外,还有0.01克和0.005克,也有BSS液中不加酚红的。酚红量不同,BSS颜色也不同。 2.配制BSS液的要求 ①BSS液中各试剂规格为一级GR试剂或二级AR试剂。 ②配制后液体呈桃红色,pH 7.4左右,没有混浊和沉淀。 ③含钙离子、镁离子的物质要单独溶解。 ④可配制10倍浓度的贮存液,滤过消毒,分装,每瓶10毫升,冰箱保存。使用时每瓶加三蒸水至100毫升。 ⑤钙离子、镁离子是细胞膜的重要组分,有使细胞凝聚的作用。因此,用于分离细胞的消化液宜用无钙离子、镁离子离子的D-Hanks液或PBS液配制。
/
本文档为【细胞培养用液的配制与消毒】,请使用软件OFFICE或WPS软件打开。作品中的文字与图均可以修改和编辑, 图片更改请在作品中右键图片并更换,文字修改请直接点击文字进行修改,也可以新增和删除文档中的内容。
[版权声明] 本站所有资料为用户分享产生,若发现您的权利被侵害,请联系客服邮件isharekefu@iask.cn,我们尽快处理。 本作品所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用。 网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽..)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。

历史搜索

    清空历史搜索