对乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的再认识

1 对乙型肝炎病毒共价闭合环状 DNA的再认识 乙型肝炎病毒共价闭合环状 DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA） 是乙肝病毒前基因组 RNA（pgRNA）的转录模板，对乙肝病毒的循环复制以及 感染状态的建立均有十分重要的意义。从 cccDNA 的角度重新认识 HBV 感染和 清除过程，有助于澄清现有的一些模糊概念，更深刻地理解 HBV 的致病机制， 更理性地确定抗病毒治疗的策略和目标，并有可能在移植后肝炎复发的防治等更 为深远的领域带来新的启迪。 1 关于 HBV cccDNA的稳定性 1.1 cccDNA池是动态更新的 通常认为，HBV感染后肝细胞核内 cccDNA池在数量上保持相对稳定；但是， 这句话不应该被误解为——组成该池的 cccDNA分子也是固定不变的。鸭肝细胞 核内 cccDNA的量受胞浆内包膜大蛋白水平调节，这是动态的负反馈平衡过程； 作为负反馈调节的前提，构成 cccDNA池的具体分子必须处于变化和更新当中， 从头合成途径是 cccDNA池补充和更新的主要方式[1]。HBV的自发突变率能够保 持在与 HIV相近的高水平、核苷类似物抗病毒治疗后的病毒变异等现象，足以 明 cccDNA池是动态更新的。 1.2 cccDNA的转录活动 成年人肝脏内肝细胞总数约为 2~3×1011个[2]，慢性感染状态下这些肝细胞受 HBV感染的比例为 5%~40%[3]；外周血病毒定量为 108~1011拷贝/毫升的 HBV感染者， 肝脏每天要向外周血释放约 1.3×10 1l~1.3×1014个病毒颗粒[4]；据此推算，每个 受感染肝细胞每天释放到外周血的病毒颗粒数量约为 3~3000 个。每合成 1 个病 毒颗粒所含的双链核酸即需要 cccDNA完整转录 1次；此外，每个病毒颗粒内尚 含有 1个病毒聚合酶，有约 180个核壳蛋白、500个表面包膜蛋白（大、中、主）， 外周血中含核酸的完整病毒颗粒与管形颗粒、小球形颗粒的比例约为 1：100：100， 000——这些数量巨大的病毒蛋白均需由核内数量有限的 cccDNA 模板转录生成 短寿命的 mRNA翻译得来。这就意味着核内 cccDNA分子其实是处于频繁转录过 程中，在 DNA 拓扑异构酶作用下经常处于去超螺旋、解双链、转录后重新形成 双链结构、再超螺旋化的动态变构过程中；HBV cccDNA作为病毒转录的模板， www.bdg365.com 广州家庭医生 ww w. bd g3 65 .c om 广 州 家 庭 医 生 2 从来就不是“一池死水”。 1.3 cccDNA池究竟有多大？ 既往认为，HBV 感染后平均每个肝细胞核内含有的 cccDNA 数量在 6～60 之间。Zhang[5]等利用后天感染 DHBV的成年鸭模型，收集从感染后第 11天到第 131天不同时点的肝脏标本，分离得到单独的肝细胞核，应用单细胞 PCR扩增方 法测出每个受感染细胞核内 cccDNA 的量。结果发现 90%受感染的鸭肝细胞核内 cccDNA数量在 1～17之间；各个细胞之间 cccDNA池含量变化较大，不符合正 态分布规律；同一个体在感染的不同时点测得 cccDNA 池含量也不相同，“平均 值”波动在 2.9～8.6之间；许多受感染肝细胞核内只有 1个或数个 cccDNA分子， 并非通常认为的“cccDNA池”那么大。 该研究因为单独分离肝细胞核并排除了未被感染的细胞，真实反应了 “cccDNA池”的大小；利用百分位数描述非正态分布数据，首次揭示了“cccDNA 池”的分布规律。该研究小组还利用传统定量验证得到类似并且更低的结果 （cccDNA池含量“平均值”波动在 1.2～6.9之间）；另一研究小组在黑猩猩急性 感染 HBV活体模型中也计算得到类似的结果（平均 10拷贝/细胞，在不同时间有 波动）。实验方法的进步可以带来学术观念的更新：cccDNA池即使在数量上也是 不稳定的——它既非以往认识的那么大，也非以往认为的那么稳，cccDNA 池的 概念及意义值得进一步探讨。 2 关于 HBV cccDNA的清除动力学 既往我们过度关注慢性 HBV 感染与 cccDNA 的关系，却忽略了一个重要事 实，即成年人感染 HBV后绝大部分（90%～95%）都是急性自限性的过程。在此 过程中，近乎 100%的肝细胞都曾经感染过 HBV，然而大部分被感染的肝细胞都 通过非溶细胞途径清除了病毒[6]，或者说，在保全宿主细胞的同时清除了 HBV cccDNA。这一过程不仅非常普遍，而且并不漫长（短于 6个月？），深入研究其 中机制，将为抗 HBV治疗带来新的思路。 2.1 急性感染中 HBV cccDNA的清除过程 Wieland 等利用急性感染 HBV 的黑猩猩模型，全程观察了肝组织内 HBV cccDNA的清除过程[7]。急性感染过程中肝细胞内 HBV cccDNA数量迅速扩增， 平均倍增时间约为 3.8～4.2天，大约第 7～9周时达峰（平均 10拷贝/细胞）；肝 www.bdg365.com 广州家庭医生 ww w. bd g3 65 .c om 广 州 家 庭 医 生 3 细胞 HBcAg 阳性率增加过程与 cccDNA基本同步或稍迟，最高可以达到 99%。 细胞内 cccDNA的清除过程可以分为 2个阶段：第一阶段为快速清除期（第 8～ 12周），此期 cccDNA清除速度远远快于 HBcAg阳性细胞减少速度，表明这是一 个非溶细胞性的 cccDNA清除过程，并且绝大多数 cccDNA在该阶段得到清除（约 90%）；第二阶段为慢速清除期（第 12周以后），考虑与 CTL的细胞毒效应及肝 细胞再生有关，仅约 10%左右的 cccDNA是在此阶段被清除。总体看来，初建感 染状态时 cccDNA优先于 rcDNA扩增，提示 cccDNA易由从头合成途径迅速补充； 占总量 90%的 cccDNA可在很短时间内被消除，表明 cccDNA存在快速耗竭通道。 随访发现，虽然 2只猩猩均表现为急性自限性感染过程，临床症状和生化指 标恢复正常，但是肝组织内仍残存有痕量的“cccDNA”；在慢性 HBV 感染者经 抗病毒治疗后或是自发性的病毒清除过程中（血 HBsAg和 HBV DNA消失），也 有着类似现象[8,9]。这些现象提示，可能自限性感染过程并不要求完全清除所有细 胞内的 HBV cccDNA；认识并认可这些现象，对于合理确立抗病毒治疗的策略和 目标具有重要意义。 2.2 细胞内 cccDNA的半衰期测定 在前述黑猩猩急性感染过程中，Wieland 等估算出 cccDNA 半衰期为 9～14 天。迄今为止，有关 cccDNA半衰期研究的其他结果大致如下： Civitic 等在 DHBV 先天感染的原代培养鸭肝细胞中，用 5-溴 2-脱氧尿苷 （BrUdR）标记 cccDNA，测得 cccDNA的半衰期平均为 3～5天；Delaney等在 转染了 HBV DNA 的 HepG2 细胞中应用拉米夫定抑制 HBV 复制过程，测得 cccDNA半衰期为 3天；Guo等在转染了 DHBV的 LMH细胞中应用拉米夫定抑 制 DHBV复制过程，测得 cccDNA半衰期为 48小时。 Addison等用拉米夫定治疗先天感染 DHBV的北京鸭 5个月，然后取肝脏活 检发现 5只鸭中有 3只 cccDNA水平呈指数下降，其半衰期长达 35～57天，另 2 只 70天内呈指数下降，但此后稳定在 6拷贝/细胞的水平；Zhu等用 L-FMAU治 疗WHBV慢性感染的土拨鼠 30周，测得 cccDNA半衰期 33～50天。 上述报道的结果相差甚远，既往曾把这一现象解释为宿主的“种属差异”。 但是同为 DHBV cccDNA，半衰期却有 2～5 天和 35～57 天两个不同层次；而 DHBV 和 WHBV 作为不同病毒，在鸭和土拨鼠这两种不同宿主中的半衰期却如 此相近（35～57天、33～50天），这显然不是种属差异所能解释。进一步发 www.bdg365.com 广州家庭医生 ww w. bd g3 65 .c om 广 州 家 庭 医 生 4 现，较短的半衰期（2～5天）均是在体外培养的细胞中测得；较长的半衰期（33～ 57天）均是在活体肝脏中测得，可见不同的实验设计才是问题的关键。 2.3 cccDNA真有这么长的半衰期吗？ 要获取细胞内 cccDNA半衰期的准确数值，最重要的前提是确保在检测过程 中没有新的 cccDNA补充；或者，至少要证明新合成的 cccDNA的量少到可以忽 略不计。但是在具体的实验设计中，这一重要原则往往被忽视。 Addison 等用拉米夫定治疗先天感染 DHBV 的北京鸭，5 只鸭中有 2 只 cccDNA水平先下降然后稳定在 6拷贝/细胞的水平，这一现象表明：活体内药物 未能有效阻止新生的 cccDNA从头合成。核内 cccDNA是由胞浆内 rcDNA补充更 新的，作者在文中用了大量篇幅证明血中 HBV DNA已经被药物明显抑制（下降 幅度可达 5个数量级），可是对于细胞内 rcDNA水平却只字未提。事实上，外周 血中 HBV DNA 数量的明显减少并不代表肝细胞内的 HBV DNA 数量的同步减 低。临床观察表明接受拉米夫定治疗 1年的患者外周血 HBV DNA水平下降至治 疗前的 1/330～1/1700，但是肝细胞内 HBV DNA只下降至治疗前的 2/3～1/3，细 胞内病毒量并没有数量级上的变化[10]。单用拉米夫定或联合 PEG-干扰素治疗 1 年的患者，外周血 HBV DNA定量下降 3.98～5.18个数量级，肝细胞内 HBV DNA 数量却只下降 0.19～0.21个数量级（即治疗前的 65%～61%），肝细胞内 cccDNA 下降了 0.068～1.07 数量级[11]。这些数据不仅可以解释现有的活体内 cccDNA 半 衰期检测方法的局限性，也提示了目前抗 HBV治疗的真正瓶颈所在。 综上所述，如果不能完全解决 cccDNA半衰期测定技术的准确性问题，那么， 应用现有文献描述的 cccDNA半衰期数值去判断抗病毒治疗的效果就必须慎 重，不能套用现有的 cccDNA半衰期的概念和数值去预测抗病毒治疗的未来。 3 HBV cccDNA检测的假阳性 3.1 HBV DNA的非法复制过程 HBV DNA的复制是个逆转录过程：1）以 pgRNA 为模板通过病毒 P蛋白的 逆转录活性合成 HBV rcDNA 负链，同时 pgRNA经由 P蛋白的 RNA酶 H活性 逐渐降解（残留 5’端长度为 18nt的寡聚帽状核苷酸）；2）pgRNA 5’端残留的 18nt 的寡聚核苷酸转位到负链近 5’端 DR2区域，以其末端 12nt的序列与负链 DR2区 域互补结合并作为引物开始合成 rcDNA正链。上述过程 2）中，正链引物正确转 www.bdg365.com 广州家庭医生 ww w. bd g3 65 .c om 广 州 家 庭 医 生 5 位到 DR2位置（转位引发，translocation priming）是保证 HBV DNA分子形成正 常的松弛环状结构（rcDNA）的关键。若正链引物从 DR1位置引发（原位引发， in situ priming），产物 HBV DNA分子为线性双链，与相应的 rcDNA分子在序列 结构上有重要区别。原位引发现象又被称为非法复制（illegitimate replication）， 可占细胞内 HBV复制过程的 5%～20%；相应的线性双链分子产物可以正确包装、 分泌到细胞外并能感染新的细胞[12,13]。因为病毒频繁复制的巨大基数，经由非法 复制途径产生的线性双链绝对数量并不算少，是感染后人肝细胞内 HBV DNA的 主要存在形式之一[14]，已经足以干扰某些特异性检测 cccDNA的方法并带来致命 的假阳性。 3.2 假阳性的产生机制及控制方法 目前用于 cccDNA特异性检测的方法主要有三种，究其策略都是利用 cccDNA 区别于 rcDNA和其它复制中间体、异质性复制产物的结构连续性差异，从而实现 检测的特异性。 Invader 方法[15]能够区分 HBV rcDNA，有赖于 rcDNA分子在正链 5’末端的 “截断”特征。遗憾的是，由于前述非法复制过程及相应的线性双链分子产物在 该处的结构特征完全等同于 cccDNA分子，产生了致命的假阳性，尤其是在用于 检测肝细胞内 cccDNA时。 嵌合引物（chimeric primer）法[16]的特异性同样有赖于正链 5’末端的“截断” 特征，也具有上述假阳性可能。并且，在第一步单链延伸过程中，正链末端本身 也可以作为引物引发合成无截断特征的正链序列，在高丰度的 rcDNA存在时这种 假阳性更易出现。 经典的跨 rcDNA双缺口 PCR策略沿用已久，非法复制过程产生的线性双链 分子不会造成假阳性；但是当有高丰度的 rcDNA存在时，因为正链和负链不完全 延伸产物的自退火（self-annealing）现象，也会有假阳性发生。至于某些简化的 跨单缺口 PCR策略，几乎没有特异性。 解决上述假阳性问题有赖于对相应机制的深刻理解。对于 Invader 方法和嵌 合引物法，应该完全去除核酸抽提产物中的线性双链成分，这是很难实现的；幸 而跨双缺口的方法不会因线性双链分子产生假阳性。我们的数学模型评估和实时 荧光定量 PCR方法验证表明，跨双缺口方法中 rcDNA丰度必须低于 103拷贝/PCR 反应才能有效避免假阳性的发生。单独应用 Hirt分离法（Hirt Fractionation）或选 www.bdg365.com 广州家庭医生 ww w. bd g3 65 .c om 广 州 家 庭 医 生 6 择性酶切方法并不能确保 rcDNA丰度降至假阳性阈值以下，有效避免跨双缺口策 略中的假阳性问题需要严格的定量控制措施。 3.3 现有文献中的假阳性问题 任何一位作者在发表研究结果时，都应该阐明他所用方法的假阳性机制并详 细解释控制措施；实验设计中必须设立含有高丰度 rcDNA的阴性对照，每份样品 和对照都应该进行“rcDNA”定量检测以判断有无假阳性可能。遗憾的是，众多 的建立 cccDNA特异性检测方法的文章、关于外周血单个核细胞（PBMCs）中检 测到 cccDNA的文章、关于血清中检测到 cccDNA甚至和病情复发相关的文章都 没有讨论各自方法的假阳性问题，更无相应的控制措施。迄今为止，只有 Kock 等[17]关于 PBMCs中不存在 cccDNA的文章符合严格的对照原则。感兴趣的读者 研读或引用该类结论时，需特别留意关于假阳性的评价。 4 小结与展望 HBV“肝外储存池”研究的核心内容在于判断病毒能否在特定细胞中维持完 整的复制过程，cccDNA检测可以作为重要标志。但是对于 cccDNA各种检测方 法的假阳性问题，学术界一直没有给予足够的重视，由于技术问题带来的假阳性 结果以及由此而得出的错误结论，可能会误导我们的认识，不可掉以轻心。 急性自限性 HBV感染过程中，病毒清除主要是通过非溶细胞性途径进行的； 这一过程的广泛性和短暂性，提示我们 cccDNA其实是可以迅速消除的，清除核 内 cccDNA并非我们想象中的那么困难。现有抗病毒药物产生临床效益的机制可 能仅限于抑制/防止病毒释放入血，与此相应地减少了致病抗原/表位的分泌和提 呈，但是还远未达到明显抑制/清除细胞内 HBV复制的效果，更谈不上“耗竭” cccDNA。如果将细胞内 HBV视作满桶的水，现有的抗病毒治疗减少或防止了水 的外溢（这也是致病抗原/表位的提呈过程）从而减轻了免疫致病性；但是桶内的 水并没有明显变化（数量级！），更谈不上桶底 cccDNA的减少了。这一设想在肯 定现有抗病毒治疗的有限效果并探讨其有效机制的同时，也让我们看到了未来抗 病毒治疗的广阔天地。从细胞内 HBV DNA（rcDNA + cccDNA），而不仅仅是血 清中 HBV DNA的角度评价抗 HBV药物和各种的疗效，面临的不仅是挑战， 更多的是机遇。 参考文献 www.bdg365.com 广州家庭医生 ww w. bd g3 65 .c om 广 州 家 庭 医 生 7 1 Ganem D, Alfred M．Hepatitis B virus infection — natural history and clinical consequences．N Engl J Med, 2004, 350: 1118-1129． 2 Sherlock SD, Dooley J. 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