高效液相色谱法测定巴戟天中低聚糖含量

药物杂志Chin J Pharm Anal 2007，27(11) 高效液相色谱法测定巴戟天中低聚糖含量 李咏华 ，黄裕 ，杨中铎 ，刘菊妍 2 (1．广州汉方现代中药研究开发有限公司，广州510240； 2．中药提取分离过程现代化国家工程中心，广州 510240) 摘要 目的：建立ELSD—HPLC法测定巴戟天低聚糖类成分。方法：色谱柱：Phenomenex Synergi(250 Rim×4．6 him，4 m)；流 动相：甲醇 一水(3：97)；时间25 min；流速 0．8 mL·min～，以ELSD检测。结果：耐斯糖进样量在 0．8～8 g范围内有良好的 线性关系，r=0．9995，其低、中、高3个量的平均回收率分别为98．6％，99．O％，98．1％；RSD分别为2．3％，1．9％，2．4％。1 一 果呋喃糖基耐斯糖进样量在0．48～4．8 g范围内有良好的线性关系，r=0．9997，其低、中、高 3个量的平均回收率分别为 98．2％，98．O％，99．4％；RSD分别为 1．3％ ，2．5％，2．O％。结论 ：本法可同时测定巴戟天中耐斯糖、1 一果呋喃糖基耐斯糖的 含量，方法简单、灵敏、准确，重复性好，可用于控制巴戟天药材的质量。 关键词：巴戟天；低聚糖；五聚糖1 一果呋喃糖基耐斯糖；蒸发光散射一高效液相色谱 中图分类号 ：R917 文献标识码：A 文章编号：o254—1793(2007)11—1797—03 HPLC ---ELSD determination of oligosaccharides in Morinda officinalis LI Yong—hua ，HUANG Yu ，YANG Zhong—duoh ，LIU Ju—yan ， (1．Guangzhou Hanfang Natural Medicine R&D Co．Ltd，Guangzhon 510240，China； 2．National Engineering Research Center For Modernization of Extration and Sepation PiDcess of TCM，Guangzhou 510240，China) Abstract 0bjective：To determine nystose and 1 一fructofuranosylnystose in Morinda officinalis simultaneously by RP—HPLC —ELSD．Methods：HPLC was carried out with a W aters Alliance，Model 2695．equipped with Phenome— nex Synergi(250 mm x 4．6 mm，4 m)and evaporated light scattering detector．The mobile phase was a mixture of methnol and water(3：97)at the flow rate of 0．8mL·min～．Results：The linearities of nystose and 1 一fructo— furanosylnystose were obtained separately over the rang of 0．8—8 ixg(r=0．9995)and 0．48—4．8p,g(r 0．9997)．The average recoveries of nystose were 98．6％，99．O％，98．1％ with corresponding RSD of 2．3％， 1．9％ ，2．4％ ． Th e average recoveries of 1 一fructofuranosylnystose were 98．2％ ，98．0％ ，99．4％ with corre— sponding RSD of 1．3％ ，2．5％ ，2．O％ ．Conclusion：Th e method is simple，sensitive and reliable．It Can be used for quantitative determination of Mrinda officinalis． Key words：Morinda officinalis；nystose；1 一fructofuranosylnystose；HPLC—ELSD 巴戟天(Morinda officinalis)又名巴戟、鸡眼藤、 三角藤，为茜草科(Rubiaceae)多年生攀援木质藤本 植物，其根人药，是我国著名的四大南药之一，其主 要成分为蒽醌类、环烯醚萜类、有机 酸、低 聚糖 类 “¨J。巴戟天性温味甘，具有补肾助阳、祛风除湿 的功效，其中低聚糖类成分有显著抗抑郁活性 ]。 低聚糖类检测可采用紫外分光、气相色谱或高效液 相色谱法 J。其中紫外分光法专属性差，不能有 效分析各个组分，GC法多需衍生 ，操作复杂。由于 低聚糖类缺少发色团，HPLC中多采用示差折光检 测器，实验中对分析环境的高，结果不尽如人 意。本文采用 HPLC—ELSD法可同时测定多种不 同来源的巴戟天药材中四聚糖耐斯糖(nystose)、五 聚糖 1 一果呋喃糖基耐斯糖 (1 一fructofuranosyl— nystose)的含量，方法简单、灵敏、准确，重现性好。 } 通讯作者 Tel：(020)34400080—617；Fax：(020)84479600；E—mail：y~szhongduo@hotmail．eom 维普资讯 http://www.cqvip.com 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2007，27(11) 1 仪器与材料 Waters Alliance 2695液相色谱仪，Sedere Sedex 75型蒸发光散射检测器，Em Power色谱管理软件。 实验所用对照品耐斯糖、1 一果呋喃糖基耐斯 糖均为 Wako出品，HPLC检测纯度分别为 98％， 97％。巴戟天实验药材为市售药材，经鉴定符合 2005年版中国药典。甲醇为色谱纯(Merck)， 水为灭菌水，其他试剂均为分析纯。 2 色谱条件 色谱柱：Phenomenex Synergi分析柱(250 mm× 4．6 mm，4 m)；流动相：甲醇 一水(3：97)；时间 25 min；流速 0．8 mL·min～；温度 3O oC；进样量 2O L；ELSD参数：漂移管温度 4O℃，氮气压力 3．5 MPa，增益 8。本文条件下色谱图见图 1。 图1 高效液相色谱图 Fig1 HPLC chromatograms A．对照品(reference substance) B～F．样品 1，4，6，8，9(sample 1，4， 6，8，9)，样品序号同 1(sample No．was same as Tab 1) 1．耐斯糖(nystose)2．1 一染呋喃糖基耐斯糖(1 一fructofuranosyl— nystose) 3 溶液的制备 3．1 对照品溶液 分别精密称取对照品耐斯糖、1 一 果呋喃糖基耐斯糖适量，加甲醇定容，配制成 O．4 mg·mL～、0．24 mg·mL 的混合对照品溶液，备用。 3．2 供试品溶液 取巴戟天粉末约 2 g，精密称 定，加 45％乙醇 20 mL，回流提取3次，每次 1 h，滤 过，合并滤液，浓缩至 5 mL，活性炭吸附洗脱，用 2O％乙醇定容至 100 mL。 4 结果 4．1 线性关系考察 取上述对照品溶液 2，5，l0， 15，20 依次进样，按本文色谱分析条件测定，用 外标法以对照品的峰面积(1，)与相对应的进样量 ( ， g)做双对数线性回归处理。耐斯糖、1 一果呋 喃糖基耐斯糖的回归方程分别为： Y=1．52+5．63 r=0．9995 Y=1．48+5．6O r：0．9997 结果表明，耐斯糖进样量在 0．8—8 范围内，1 一 果呋喃糖基耐斯糖进样量在 0．48—4．8 范围内， 与峰面积呈良好的线性关系。 4．2 精密度试验 取“3．1”项下对照品溶液 2O L，经微孔滤膜滤过(0．45 m)，连续进样 5针，耐 斯糖、1 一果呋喃糖基耐斯糖的峰面积积分值的 RSD均为 1．8％。 4．3 重复性试验 精密称取同一批巴戟天粉末约 2 g，共5份，按“3．2”项下方法制备溶液，并取2O 进样测定。同一批 巴戟天药材 中耐斯糖含量为 1．8％，RSD为 2．1％；1 一果呋喃糖基耐斯糖含量 为2．2％，RSD为2．0％。 4．4 稳定性试验 取供试品溶液，于 0，2，4，8，24 h进样测定，得到峰面积，计算 RSD分别为2．1％， 2．4％。结果表明耐斯糖、1 一果呋喃糖基耐斯糖色 谱峰在24 h内均稳定。 4．5 回收率试验 取已知耐斯糖含量为 18．12 mg ·g 和 1 一果呋喃糖基耐斯糖含量为 21．68 mg· g 的巴戟天药材粉末约 1 g，精密称定，分别加入内 含耐斯糖 14．5O，18．12，21．74 mg，含 1 一果呋喃糖 基耐斯糖 17．34，21．68，26．01 mg的对照品溶液，按 “3．2”项下方法制备低、中、高 3种不同浓度的溶液 各 3份，取2O L进样测定，记录峰面积。结果耐斯 糖低、中、高3个浓度的平均回收率分别为98．6％， 99．O％，98．1％；RSD分别为 2．3％，1．9％，2．4％。 1 一果呋喃糖基耐斯糖低、中、高3个浓度的平均回 收率分别为 98．2％，98．0％，99．4％；RSD分别为 1．3％ ，2．5％ ，2．O％ 。 4．6 样品测定 取 l0批巴戟天药材，按“3．2”项 下方法制备溶液，并取2O L进样测定。结果见表 1及 图 1。 维普资讯 http://www.cqvip.com 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2007，27(11) ·-——1799·-—— 表 1 不同来源巴戟天药材中耐斯糖、1 一果呋喃糖基耐斯糖的含量数据(％) Tab 1 Test data of Morinda offwi~lis from various sources 5 讨论 巴戟天低聚糖类物质具有显著的抗抑郁活性， 但由于糖类的检测局限性，对这类成分的分析一直 未见报道。本文采用 ELSD检测器，用 HPLC方法 分离巴戟天中低聚糖成分耐斯糖、l 一果呋喃糖基 耐斯糖。结果表明，巴戟天中耐斯糖及 1 一果呋喃 糖基耐斯糖的分离效果好，方法简捷，实用性强，可 用于巴戟天药材的质量监控。 从样品的检测结果来看，各个产地的巴戟天药 材均含有耐斯糖、1 一果呋喃糖基耐斯糖成分，但含 量上有一定差异。从色谱图上看出，此分离条件下， 不仅耐斯糖及 1 一果呋喃糖基耐斯糖能够很好地 被指认，色谱图上的其他成分的色谱峰也很有一定 规律。因此，可以以此方法为基础，对巴戟天水溶性 寡糖部分进行进一步的指纹图检测研究。 参考文献 1 YANG Yan—jun(杨燕军)，SHU Hui—yi(舒慧一)，MIN Zhi—da (闵知大)，et a／．Anthraquinones isolated from Morinda ic删 and Damnacanthus indicus(巴戟天和恩施 巴戟的蒽醌化合物)．Acta Pharm Sin (药学学报)，1992，27(5)：358 2 LI sai(李赛)，OUYANG Qiang(欧阳强)，TAN Xuan—zhong(谈宣 中)，et o2．Chemical constituents of Morinda ou~cinalis(巴戟天化学 成分的研究)．China J ChinMaterMed(中国中药杂志)，1991，16 (11)：675 3 Yoshikawa M 。Nishisaka H，Yamaguehi S，et od．Chemi cal constituents of Chinese natural medicine，Morindae Radix，the dried root of Morin- da offieinalis Structures of moilndolide and momffieinaloside．Chem Pharm Bu／／，1995，43(9)，1462 4 CUI Chen—bing(崔承彬)，YANG Ming(杨明)，YAO Zhi-wei(姚 志伟)，et a1．Antidepressant active eonstituentsinthe rootsof biotin— da offieinalis(中药巴戟天抗抑郁活性成分的研究)．China J Chin MaterMed(中国中药杂志)，1995，20(1)：36 5 ZHANG Zhong—qi(张 中启 )，YUAN Li(袁莉)，ZHAO Nan(赵 楠)，et od．Antidepressant effectof ethanolie extractsofrootsofMorin— da ofl~einalis in rats and mice(巴戟天醇提取物的抗抑郁作用)． Chin Pharm J(中国药学杂志)，2000，35(11)：739 6 LIYun—fens(李云峰)，YANGMing(杨明)，ZHAOYi—min(赵毅 民)，et od．Inhibition by the oligosaccharides extracted from Morinda offieinalis，a Chinese traditional herbal medicine，on the eortieostemne — induced apoptosis in PC12 cells(巴戟天寡糖对皮质酮损伤的 PC12细胞的保护作用)． Sci，2004，75(13)：15 7 XUE Lian—llai(薛连海)，DENG Mitt(邓民)，HE Jian —zhong(何 建中)，et a1．Determining holoside in soybean by derivatization—gas chromatography(衍生化 一气相色谱法测定大豆提取液中的多糖 含量)．Chem (化学通报)，2003，66(8)：575 8 wu Hong—jing(吴红京)，TANG Gen—yuan(唐根源)，HUANG Ztfi—tong(黄志通)，et ．Analysis of constituents of isomaltoo~go— saeeharide by hish performance liquid chromatography(测定异麦芽 低聚糖组分的高效液相色谱法)．J Instmm Ana／(分析测试学 报)，2002，21(1)：63 (本文于2006年8月14日收到) 维普资讯 http://www.cqvip.com