高效液相色谱法测定茶叶中茶多酚及咖啡碱含量

图 4 　纯化的人精子蛋白裂解液等电聚焦电泳图谱 等电点标准蛋白质 : 11 淀粉葡糖苷酶 (3150) ; 21 大豆胰蛋白酶抑制剂 (41 55) ; 3. β乳 球蛋白 A ( 51 20 ) ; 41 牛碳酸酐酶 ( 51 80 ) ; 51 人碳酸酐酶 B (6155) ; 61 肌红蛋白 (酸性带) ( 6185) ; 71 肌红蛋白 (碱性带) (7135) ; 81 扁豆凝集素酸性带 ( 81 15) ; 91 扁豆凝集素中性带 (8145) ; 101 扁豆凝集素碱性带 (8165) ; 111 胰蛋白酶原 (9130) 面的甘露糖基 , 可特异性阻断人类精2卵结合。随后 , Te2 sarik 等 (1991) [2 ] 和 Benoff 等 (1993) [3 ] 分别证明正常生育 力人精子头部在受精过程中达出了甘露糖结合活性 ; 而不 明原因不育症患者的精子则不能表达此活性或活性极低 , 这 类精子在体外实验中不与 ZP 结合 , 受精归于失败 , 表明人 类精子中存在着能识别并结合甘露糖 , 且与受精机制密切相 关的装置 , 即 MR。Benoff 等报道 , MR 表达的同时伴随着 精子膜系类固醇丢失等“获能”中固有的现象 [4 ] ; Ca2 + 通 道阻滞剂可同时抑制 MR 的表达和“顶体反应” (AR) 的发 生 , 并导致可逆性男性不育 [5 ] ; 甘露糖孵育精子具有促进精 子 AR 的作用等 [6 ] 。Chen 等 [7 ]和江一平等 [8 ]则分别观察到 , Ca2 + 载体 A23187 (AR 诱导剂) 可促进 MR 的表达 ; 江一 平等还发现 , 存在于女性生殖道内天然的获能和 AR 激动剂 ———雌激素孕酮也能促进 MR 的表达 [8 ] ; 人精子完成 AR 后 , 其 MR 聚集在赤道带和顶体后区 [9 ] , 提示 MR 可能有 介导精2卵膜融合的作用。上述发现表明 MR 与受精过程三 个阶段均有密切关联 , 揭示了 MR 在人类受精机理中的重 要意义 , 值得深入探讨。为此 , 江一平等曾提出“甘露糖受 体介导人类受精机制”假说 , 认为 MR 是介导人类受精全 过程的关键分子 , 并采用甘露糖2琼脂糖凝胶进行亲和层析 , 发现在精子的可溶性成分和结构性成分中均存在 DMA 结合 活性 , 经亲和层析分离纯化得到的 MR 仍具有 DMA 和甘露 糖结合活性。 为了进一步深入研究 MR , 我们利用 SDS2PA GE 对纯 化的人精子 MR 的分子量进行测定 , 结果表明纯化的人精 子 MR 的分子量为 6613 ku。等电聚焦是具有高分辨能力的 实验技术 , 应用窄 p H 范围的两性电解质混合物 , 可将等电 点差只有 0102 p H 单位的大分子系列清晰分开 , 并使其在 到达相应等电点的 p H 区域形成狭窄的区带 , 本实验中 MR 在等电聚焦电泳中呈现一条蛋白带 , 其等电点为 511。本研 究所获的纯化人精子甘露糖受体达电泳纯 , 可为进一步开展 人精子甘露糖受体有关理化特性和医用价值研究积累有价值 的资料。 参 　考 　文 　献 1 　Morri K , Daitoh T , Irahara M , et al1 Significance as a sperm re2 ceptor site on t he zona pelucida in human fertilization1 Am J Obstet Gynecol , 1990 , 161 (1) : 20722111 2 　Tesarik J , Mendoza C , Carreras A. Expression of D2mannose binding sites on human spermatozoa : comparison of fertile donors and infertile patient s. Fertil Steril , 1991 , 56 (1) : 1132118. 3 　Benoff S , Cooper GW , Hurley I , et al . Human sperm fertilizing potential in vit ro is correlated wit h differential expression of a head2specific mannose2ligand receptor . Fertil Steril , 1993 , 59 (4) : 8542862. 4 　Benoff S , Hurley I , Cooper GW , et al . Human sperm head2 specific mannose2ligand receptor expression is dependent on capac2 itation2associated membrane cholesterolloss. Hum Reprod , 1993 , 8 (12) : 214122154. 5 　Benoff S , Cooper GW , Hurley I , et al . The effect of calcium ion channel blockers on sperm fertilization potential . Fertil Steril , 1994 , 62 (3) : 6062617. 6 　Benoff S , Hurley I , Cooper GW , et al . Fertilization potential in vit ro is correlated wit h head2specific mannose2ligand receptor ex2 pression , acrosome status and membrane cholesterol content . Hum Reprod , 1993 , 8 (12) : 215522166. 7 　Chen J S , Doncel GF , Alvarez C , et al . Expression of mannose2 binding sites on human spermatozoa and t heir role in sperm2zona pellucida binding. J Androl , 1995 , 16 (1) : 55263. 8 　江一平 , 林秀云 , 魏玉珍 , 等. 己酮可可碱、孕酮和 A23187 对 人精子甘露糖受体表达的影响. 生殖医学杂志 , 1998 , 7 (1) : 42246. 9 　Jiang YP , Wei YZ , Wu YQ , et al . A preliminary investigation on localization of mannose2ligand receptors of human spermatozoa wit h immuno2gold cytochemist ry. Acta Histochemi Cytochemi , 1996 , 29 (suppl) : 8542855. 高效液相色谱法测定茶叶中茶多酚及咖啡碱含量 福建漳州片仔癀股份有限公司 (363000) 　陈鹤立 【中图分类号】R28412 　【文献标识码】B 　【文章编号】100222600 (2006) 0120080202 　　茶多酚 (green tea polyphenols , GTP) 与咖啡碱是茶叶 中重要的功能性成分 , 茶多酚是各类茶中都含有的水溶性浸 08 福建医药杂志 2006 年第 28 卷第 1 期　Fujian Med J Vol1 28 ,No . 1 2006 出物 , 许多生理和药理实验表明它对人体无毒 , 无副作用 , 是一种天然、高效、安全的抗氧化剂。它还具有抗衰老 , 抗 癌 , 抗辐射 , 消除口臭 , 减少口腔牙垢形成 , 抗菌灭菌以及 降血糖 , 防治心血管疾病等作用 [1 ] 。茶多酚抗氧化成分是其 中的儿茶素类 , 它们也是茶多酚中最主要的成分 , 主要是 EGCG (表没食子儿茶素没食子酸酯) 、EGC (表没食子儿 茶素) 、EC (表儿茶素) 和 ECG (表儿茶素没食子酸酯) , 各儿茶素的抗氧化能力不尽相同 , 因此测定茶叶中各儿茶素 含量对评价茶叶功能品质具有重要意义。咖啡碱在茶叶中含 量较高 , 其药理功能人们已熟知 , 它具有强心、利尿、提神 醒脑、刺激中枢神经系统等作用。本文采用高效液相色谱法 ( HPLC) 建立茶叶中各儿茶素及咖啡碱含量测定方法 , 现 报告如下。 1 　仪器与试剂 111 　仪器 : HP1100 型液相色谱仪 , DAD二极管阵列检测器。 112 　试剂 : 乙腈 (色谱纯) 、磷酸 (分析纯) 、双蒸水。咖啡 碱对照品 (中国药品生物制品检定所) ; EGCG、EGC、EC、 ECG对照品 (农业部质量检测中心) ; 茶叶样品 (市售) 。 2 　方法与结果 211 　色谱条件 : Eclipse XDB2C18 (416 mm ×150 mm , 5 μm) ; 流动相 : A 相 012 %磷酸 , B 相乙腈 , 梯度洗脱 , 25 分钟内完成 ; 流量 : 1 ml/ min ; 检测波长 : 280 nm ; 进样 量 : 20μl。 212 　线性关系 : 精密称取 4 种儿茶素及咖啡碱适量 , 用水 配制成不同浓度的工作液 , 进样 , 制作标准曲线 , 结果列于 表 1。 表 1 　 4 种儿茶素及咖啡碱标准曲线方程表 组分 回归方程( Y - 峰面积 , X - 浓度 , μg/ ml) 相关系数 EGC Y = - 18179 + 5130X r = 01 9995 EGCG Y = - 62176 + 391 32X r = 01 9990 EC Y = 16107 + 201 95X r = 01 9996 ECG Y = - 25135 + 551 76X r = 01 9998 CAF Y = - 39180 + 871 35X r = 01 9999 213 　样品溶液的制备与测定方法 : 取茶叶约 50 g , 粉碎 , 精密称取 115 g , 置 250 ml 烧瓶中 , 加沸水约 200 ml , 于水 浴中浸泡 45 分钟 , 过滤 , 滤液滤至 250 ml 量瓶中 , 水定容 至刻度。精密吸取 10 ml 置 25 ml 量瓶中 , 水稀释至刻度。 进样 20μl , 按标准曲线计算各儿茶素及咖啡碱含量。样品 色谱图见附图。 214 　精密度与加样回收率试验 : 精密吸取上述样品溶液 5 ml , 置 10 ml 量瓶中 , 精密加入适量的对照品 , 水稀释至刻 度 , 进行回收率试验。结果表明样品重复进样 5 次 , 各化合 物的 RSD 在 014 %～215 %之间 , 各化合物的加样回收率在 9712 %～10317 %之间。 附图　样品色谱图 215 　样品测定 : 取市售不同品种茶叶 , 按上述方法分别测 定各儿茶素及咖啡碱含量 , 结果列于表 2。 表 2 　　6 种不同茶叶中儿茶素及咖啡碱含量 ( %, w/ w) 样品 各儿茶素含量 4 种儿茶 咖啡碱 EGC EC EGCG ECG 素总量 含量 绿茶 1 31 5 21 4 615 018 131 2 31 7 绿茶 2 31 8 11 3 519 016 111 6 21 5 乌龙茶 1 31 0 01 6 417 019 912 11 9 乌龙茶 2 31 2 01 7 418 110 917 21 2 红茶 1 21 7 01 5 412 017 811 11 8 红茶 2 21 5 01 6 318 017 716 21 0 3 　讨论 茶叶中茶多酚的测定方法国标通常采用酒石酸亚铁比色 法 [1 ] , 儿茶素则采用香荚兰素比色法 [2 ] , 咖啡碱采用紫外分 光光度法及高效液相色谱法。近些年已有少量文献报道采用 高效液相色谱法测定茶多酚中的各种儿茶素组成 [3 ] 。本文采 用 HPLC 法同时测定茶叶中 4 种儿茶素及咖啡碱含量 , 方 法简便 , 准确度较高 , 能较客观地评价茶叶的品质。 本文采用梯度洗脱 , 可在 20～25 分钟内完成样品的测 定 , 梯度控制适当 , 各组分可以获得理想的分离。但茶多酚 极易氧化 , 儿茶素在水溶液中含量会随时间延长而下降 , 所 以样品配制后应尽快测定 , 不宜过夜 , 标准品的保管应是用 后立即密闭封存 , 配制好的标样亦不宜长时间使用 , 故样品 的测定采用线性回归方程计算。从本组不同茶叶的测定结果 可以看出 , 绿茶中各组分含量较高 , 红茶含量较低。说明茶 叶在焙制过程中茶多酚及咖啡碱有不同程度的改变。 参 　考 　文 　献 1 　方元超 , 赵晋府 , 编著. 茶饮料生产技术. 北京 : 中国轻工业 出版社 , 2001. 23225 , 3252326. 2 　魏毅 , 王娟. 香荚兰素比色法测定茶多酚口含片中儿茶素含量. 中国中药杂志 , 1999 , 24 (6) 3472348. 3 　何昱 , 洪筱坤 , 王智华. 茶多酚中儿茶素类及咖啡因的含量测 定. 中成药 , 2003 , 25 (10) 8272830. 18福建医药杂志 2006 年第 28 卷第 1 期　Fujian Med J Vol128 ,No . 1 2006