Ⅰ型鸭肝炎病毒 ＲＴＰＣＲ 检测方法的建立及初步应用

书书 动物医学进展，２００９，３０（１０）：４５４８ ＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ Ⅰ型鸭肝炎病毒ＲＴＰＣＲ检测方法的建立及初步应用  党　龙１，邓舜洲１，张文波１，戴一民１，陈松昌２ （１．江西农业大学动物科技学院，江西南昌 ３３００４５；２．南昌金牧动物保健服务有限责任公司，江西南昌 ３３００１３） 　　摘　要：根据ＧｅｎＢａｎｋ中Ⅰ型鸭肝炎病毒（ＤＨＶ１）的基因序列，应用Ｏｌｉｇｏ软件对ＤＨＶ１的保守基因 ３ＡＢ引物，以江西分离株（ＪＸａｕＦ）的ＲＮＡ为进行ＲＴＰＣＲ扩增，得到预期大小的目的基因。通 过对该方法的敏感性和特异性的检测，结果表明，建立的利用ＲＴＰＣＲ检测ＤＨＶ１的方法具有良好的敏感 性和特异性。该法最低模板检测量为２０ｐｇ，且只能检测出ＤＨＶ１，对新城疫病毒、传染性法氏囊病毒、鸭瘟 病毒、鹅细小病毒和健康的鸭肝组织均不能检出。克隆、测序证实了扩增基因的正确性。通过对临床病料检 测结果表明，该方法可用于Ⅰ型鸭肝炎病毒的快速鉴别诊断。 　　关键词：Ⅰ型鸭肝炎病毒；ＲＴＰＣＲ；检测 中图分类号：Ｓ８５２．６５９．６ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００７５０３８（２００９）１０００４５０４ 　　自１９９９年以来，江西部分鸭场陆续发生Ⅰ型鸭 病毒性肝炎（Ｄｕｃｋｖｉｒａｌｈｅｐａｔｉｔｉｓｔｙｐｅ１，ＤＶＨ１）， 死亡率６９．２％～８０％，给养鸭造成重大经济损失。 近几年，随着养殖规模的扩大，死亡率有上升的趋 势。ＤＶＨ１是由Ⅰ型鸭肝炎病毒（Ｄｕｃｋｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓｔｙｐｅ１，ＤＨＶ１）引起的雏鸭的一种急性、高度 致死性传染病，主要侵害４周龄以内的雏鸭，特别是 不足１周龄的雏鸭最易感染，其特征是患鸭呈现沉 郁、转圈、抽搐、角弓反张等神经症状，并具有肝脏肿 胀、出血、胆囊充盈、胆汁颜色变淡等病理变化。传 统的检测方法较多，但要么费时、要么对设备的要求 高，不能快速的对ＤＨＶ１进行诊断。为此，本试验 建立了ＲＴＰＣＲ方法，以对ＤＨＶ１进行快速、准确 的诊断。 １　材料与方法 １．１　材料 １．１．１　病毒株　ＤＨＶ１ＪＸａｕＦ毒株，江西农业大 学预防兽医学实验室保存；新城疫病毒（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓ，ＮＤＶ）、传染性法氏囊病毒（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｕｒｓａｌｄｉｓｅａｓｅ，ＩＢＤＶ）、鸭瘟病毒（Ｄｕｃｋｐｌａｇｕｅｖｉ ｒｕｓ，ＤＰＶ）和鹅细小病毒（Ｇｏｓｌｉｎｇｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ，ＧＰＶ） 均由南昌金牧动物保健服务有限公司保存。 １．１．２　主要试剂　ｄＮＴＰ、ｒ犜犪狇ＤＮＡ 聚合酶、 ＤＮＡＭａｒｋｅｒ均为ＴＩＡＮＧＥＮ公司产品；反转录酶 （ＡＭＶ）、反转录酶抑制剂（ＲＮａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ）、ＲＮＡ 提取试剂盒，均为Ｐｒｏｍｅｇａ公司产品。 １．２　方法 １．２．１　病毒 ＲＮＡ 的提取　按照 Ｐｒｏｍｅｇａ公司 ＲＮＡ提取试剂盒的说明书操作。取２５ｍｇ～５０ｍｇ 感染ＤＨＶ１的肝组织，用研钵研磨大块组织，加入 ６００μＬ变 性 剂 后 再 研 磨 变 成 组 织 悬 液。加 入 ２ｍｏｌ／ＬＮａＡｃ６０μＬ缓慢混匀，再加入苯酚∶氯仿 ∶异丙醇（２５∶２４∶１）６００μＬ，反复颠倒３次～５次 后用力甩１０ｓ，冰浴１５ｍｉｎ，１２０００ｒ／ｍｉｎ４℃离心 ２０ｍｉｎ，提取上清至新管，加入等体积的异丙醇， －２０℃放置３０ｍｉｎ，在４℃以１２０００ｒ／ｍｉｎ离心 １０ｍｉｎ，弃去上清，沉淀用１ｍＬ冰浴的７５０ｍＬ／Ｌ 乙醇洗涤，在４℃以１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，弃上 清，干燥沉淀后加入ＤＥＰＣ水溶解，置－２０℃保存。 １．２．２　引物的设计　依据ＮＣＢＩ上收录的ＤＨＶ１ 毒株全基因组序列，通过基因结构的分析［１］，利用 ｏｌｉｇｏ软件对３ＡＢ基因设计引物： ＤＨＶ１３ＡＢＦ：５′ＣＧＧＧＡＴＣＣＡ ＴＣＣＡＡＧ ＧＴＧＡＴＧＣＧＴＴＡＧＡ３′（犅犪犿ＨⅠ） ＤＨＶ１３ＡＢＲ：５′ＣＧＡＣＴＣＧＡＧＣＴＧＧＴＣ ＴＴＣＣＡＡＴＴＣＴＴＣ３′（犡犺狅Ⅰ） １．２．３　扩增 １．２．３．１　ＲＴ反应　ＲＴ反应采用２０μＬ体系：５× ｂｕｆｆｅｒ（含 Ｍｇ２＋）４μＬ，ｄＮＴＰ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）４．０μＬ， 反向引物２μＬ，ＲＮＡ酶抑制剂（ＲＮａｓｉｎ）０．５μＬ，模 板９μＬ。反应条件为：７０℃５ｍｉｎ，４２℃３０ｍｉｎ进  收稿日期：２００９０５０１ 作者简介：党　龙（１９８２－），男，甘肃定西人，硕士研究生，主要从事动物传染病及免疫学研究。通讯作者 行反转录，９５℃２ｍｉｎ灭活。 １．２．３．２　ＰＣＲ 扩增　采用５０．００μＬ反应体系： ｄｄＨ２Ｏ３３．５μＬ，１０×Ｔａｇｂｕｆｆｅｒ（含 Ｍｇ ２＋）５μＬ， ｄＮＴＰｓ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）３μＬ，上 下 游 引 物 分 别 为 １．５μＬ，ＲＴ产物５μＬ，犜犪狇 聚合酶（２．５Ｕ／μＬ） ０．５μＬ。离心几秒后置于 ＰＣＲ 扩增仪中反应，先 ９４℃３ｍｉｎ；再９４℃４５ｓ，５４℃４５ｓ，７２℃１ｍｉｎ 的反应，共３５个循环；最后７２℃延伸８ｍｉｎ。ＰＣＲ 产物经１０ｇ／Ｌ的琼脂糖凝胶电泳后，拍照并分析记 录结果。 １．２．４　克隆测序　凝胶回收目的基因，与ｐＧＥＭＴ ｅａｓｙ载体连接，转化ＪＭ１０９感受态细胞，随机选取 Ａｍｐ／ＬＢ培养基上生长的菌落，扩大培养，提取质 粒，通过菌落ＰＣＲ和双酶切鉴定重组质粒，送上海 生工生物工程技术服务有限公司测序。 １．２．５　特异性和敏感性检验　将提取的 ＤＨＶ１ ＲＮＡ作１０倍稀释（２×１０８ｐｇ～２０ｐｇ），每个稀释度 各取１０μＬ按照１．２．３所述的反应条件进行 ＲＴ ＰＣＲ扩增检测其敏感性。并对 ＮＤＶ、ＩＢＤＶ、ＤＰＶ、 ＧＰＶ和健康的鸭肝组织等ＲＮＡ按照相同条件进行 ＲＴＰＣＲ扩增，检测其特异性。 １．２．６　ＲＴＰＣＲ法的临床应用　利用建立的ＲＴ ＰＣＲ方法对２株ＪＸａｕＦ毒株和１７份采自不同地区 疑似鸭病毒性肝炎的肝脏病料进行检测，同时与中 和试验比较检测的符合率。 ２　结果 ２．１　ＲＴＰＣＲ ＤＨＶ１ＪＸａｕＦ株 ＲＴＰＣＲ产物于１０ｇ／Ｌ琼 脂糖凝胶上电泳，结果表明扩增产物大小约为 ３００ｂｐ，与预期结果相符。正常鸭肝组织作对照，未 检出目的条带（图１）。 ２．２　重组质粒酶切 ＪＸａｕＦ毒株重组质粒上有犡犺狅Ⅰ和犅犪犿ＨⅠ 酶切位点，经双酶切后，分别获得大小约为３００ｂｐ 的插入片段和４９００ｂｐ的载体（图２）。 　　Ｍ．ＤＮＡ标准ＤＬ２０００；１．ＪＸａｕＦ株３ＡＢ基因；　　　　　　　　Ｍ．ＤＮＡ标准ＤＬ２０００；１．ＪＸａｕＦ毒株重组质粒； 　　２．健康鸭肝组织对照　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 ２．ＪＸａｕＦ毒株重组质粒双酶切产物 　　Ｍ．ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ２０００；１．３ＡＢｇｅｎｅｏｆＪＸａｕＦｓｔｒａｉｎ；　　　 Ｍ．ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ２０００；１．ＪＸａｕＦｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄ； 　　２．Ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ（ＤＨＶ１ｕｎｉｎｆｅｃｔｅｄｄｕｃｋｌｉｎｇｌｉｖｅｒｓａｍｐｌｅ）　　　２．ＪＸａｕＦｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｄｉｇｅｓｔｅｄｗｉｔｈ犅犪犿ＨＩａｎｄ犡犺狅Ⅰ 　　　　图１　ＪＸａｕＦ株扩增产物的电泳结果　　　　　　　　　　　图２　ＪＸａｕＦ毒株重组质粒的酶切鉴定 Ｆｉｇ．１　ＥｌｅｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｏｆｐｒｏｄｕｃｔｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒｏｍＪＸａｕＦｓｔｒａｉｎ　　　Ｆｉｇ．２　ＥｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＪＸａｕＦｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄ ２．３　序列测定与分析 用Ｔ７通用引物对阳性重组质粒进行测序，结果 表明ＲＴＰＣＲ产物的长度为３１２ｂｐ，与已发表的 ３ＡＢ核苷酸序列同源性比对发现，ＪＸａｕＦ株核苷酸 序列变化主要集中在两端，与ＥＵ３５７８０５（中国分离 ＣＧＹ株）同源性最高，为９６．２％；氨基酸同源性比 较 发 现，ＪＸａｕＦ 株 与 ＥＵ８７７９１６ 同 源 性 最 高 （９８．４％），与ＥＵ３５７８０５（中国分离ＣＧＹ株）次之， 为９６．８％，其余的则亲缘关系较远。 ２．４　敏感性和特异性的检验 建立的ＲＴＰＣＲ方法能够从ＪＸａｕＦ毒株中扩 增出大小为３１２ｂｐ的片段。而正常的雏鸭肝组织、 ＮＤＶ、ＩＢＤＶ、ＤＰＶ和ＧＰＶ的扩增结果均为阴性（图 ３）。因此该法具有很强的特异性，能够作为检测 ＤＨＶ１的可靠方法，操作简单易行，且重复性好。 敏感性检验见图４，从图４可看出ＲＴＰＣＲ方法最 低可检测出２０ｐｇ核酸模板。 ６４ 动物医学进展　２００９年　第３０卷　第１０期（总第１９５期） 　　Ｍ．ＤＮＡ标准ＤＬ２０００；１．ＪＸａｕＦ毒株；２．健康鸭肝组织；　　　　　 　　Ｍ．ＤＮＡ标准ＤＬ２０００；１．未稀释的ＪＸａｕＦ毒株ＲＮＡ； 　　３．ＮＤＶ；４．ＩＢＤＶ；５．ＤＰＶ；６．ＧＰＶ　　　　　　　　　　　　　　　　 　２～１０．２×１０８ｐｇ～２０ｐｇＤＨＶ１的ＲＮＡ模板 　　Ｍ．ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ２０００；１．ＪＸａｕＦｓｔｒａｉｎ；２．Ｈｅａｌｔｈｄｕｃｋｌｉｖｅｒ　　　　Ｍ．ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ２０００；１．ＵｎｄｉｌｕｔｅｄＲＮＡｏｆＪＸａｕＦ； 　　ｔｉｓｓｕｅ；３．ＮＤＶ；４．ＩＢＤＶ；５．ＤＰＶ；６．ＧＰＶ　　　　　　　　　　　　　 　２１０．２×１０８ｐｇ２０ｐｇＲＮＡｏｆＤＨＶ１ 　　　　　　　图３　特异性检验　　　　　　　　　　　　　　　　　　　图４　敏感性检验 　　　　　　Ｆｉｇ．３　Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｔｅｓｔ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｆｉｇ．４　Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ２．５　ＲＴＰＣＲ方法的初步应用 应用本试验建立的ＲＴＰＣＲ方法对２株江西分 离株和１７份采自不同地区疑似鸭肝炎病例的肝脏 病料进行检测，结果９０％的可以扩增出大小为３１２ ｂｐ的单一条带（图５、图６）。同时结果与病毒中和试 验比较，符合率为１００％。 　　Ｍ．ＤＮＡ标准ＤＬ２０００；１～２．ＪＸａｕＦ毒株；　　　　　　　　　　 　　Ｍ．ＤＮＡ标准ＤＬ２０００；１～１０．疑似ＤＨＶ１病料中ＲＴＰＣＲ 　　３～９．疑似ＤＨＶ１病料ＲＴＰＣＲ产物　　　　　　　　　　　　　 　产物 　　Ｍ．ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ２０００；１２．ＪＸａｕＦｓｔｒａｉｎ；　　　　　　　　　 　　Ｍ．ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ２０００；１１０．ＲＴＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆｄｏｕｂｔｆｕｌ 　　３９．ＴｈｅＲＴＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆｄｏｕｂｔｆｕｌｓａｍｐｌｅｓｏｆＤＨＶ１　　　　　　　ｓａｍｐｌｅｓｏｆＤＨＶ１ 　　　　　图５　ＤＨＶ１临床病例检测结果　　　　　　　　　　　　　　　图６　ＤＨＶ１临床病例检测结果 　　Ｆｉｇ．５　ＲＴＰＣＲｒｅｓｕｌｔｓｏｆＤＨＶ１ｆｒｏｍｃｌｉｎｉｃｓａｍｐｌｅｓ　　　　　　　　　　Ｆｉｇ．６　ＲＴＰＣＲｒｅｓｕｌｔｓｏｆＤＨＶ１ｆｒｏｍｃｌｉｎｉｃｓａｍｐｌｅｓ ３　讨论 ＤＨＶ１的检测已建立了多种方法。病毒中和 试验［２４］虽是普遍认为的权威诊断方法，但因其操作 繁琐、费时、成本高，不能用于快速诊断，不适于基层 的推广应用；琼脂扩散试验［５６］对抗原和抗体的要求 严格，检测的ＤＨＶ抗原需经匀浆浓缩。所用抗体 是兔抗ＤＨＶ抗体，如果抗原不纯，则会产生非特异 性沉淀，且琼脂扩散试验灵敏度不高；荧光抗体技 术［７］费用较高，对设备的要求很高，使得目前基层很 少应用荧光抗体法进行ＤＨＶ的检测；酶联免疫吸 附试验［８１０］虽然具有很高的敏感性和特异性，但 ＤｏｔＥＬＩＳＡ法检测ＤＨＶ１易受组织中色素的干扰， 且单抗的供应尚未商业化，使其推广受到了限制；免 疫电镜技术［１１］对设备的要求较高，现主要用于科研， 临床诊断受到限制。本试验建立的ＲＴＰＣＲ方法检 测ＤＨＶ１具有快速、敏感、特异性高、操作简单、易 标准化等优点，结合临床症状和病理剖检变化，只需 ５ｈ即可得出结果。与上述传统方法相比，极大地缩 短了诊断时间，对早期确诊ＤＨＶ１具有十分重要的 意义。 本试验ＲＴＰＣＲ的建立是以ＤＨＶ１的保守基 因３ＡＢ而设计的引物，只能扩增出ＤＨＶ１，而对正 常的鸭肝组织、ＮＤＶ、ＩＢＤＶ、ＤＰＶ和ＧＰＶ的扩增均 为阴性，特异性很强。马秀丽等［１２］报道了ＲＴＰＣＲ 方法可检测出１００ｐｇ的模板ＲＮＡ，程安春等［１３］也 报道了该方法可检测出３０ｐｇ的ＤＨＶ１的ＲＮＡ。 本试验建立的ＲＴＰＣＲ方法能敏感的检测出ＤＨＶ １，最低可检测出２０ｐｇ的核酸模板。 克隆测序进一步验证了所建立的ＲＴＰＣＲ方法 的正确性，通过与ＧｅｎＢａｎｋ上已发表的序列同源性 比对发现，ＪＸａｕＦ株３ＡＢ基因与ＥＵ３５７８０５（中国 分离ＣＧＹ株）３ＡＢ基因同源性最高，为９９．７％，亲 缘关系最近，但不同的地方核苷酸序列有所改变；氨 基酸比对说明，变化主要集中在３ＡＢ基因的两端， 且有连续７个氨基酸发生突变，但ＪＸａｕＦ株３ＡＢ ７４党　龙等：Ⅰ型鸭肝炎病毒ＲＴＰＣＲ检测方法的建立及初步应用 与其他 ＤＨＶ１核苷酸序列的相似性均在９６％以 上，表明ＪＸａｕＦ株３ＡＢ与世界其他地方不同的 ＤＨＶ１分离株之间，病毒基因组的一级结构具有较 高的同源性。 本试验建立的ＲＴＰＣＲ方法，经过对临床采集 的病料的初步应用表明，该方法的敏感性和特异性 很高，能用于临床对ＤＨＶ１进行快速检测，在雏鸭 引进和养殖过程中做出快速准确的诊断，减少经济 损失，为ＤＶＨ１的预防和诊治提供了有力的依据。 犈狊狋犪犫犾犻狊犺犿犲狀狋狅犳犚犲狏犲狉狊犲犜狉犪狀狊犮狉犻狆狋犻狅狀犪犾犘狅犾狔犿犲狉犪狊犲犆犺犪犻狀 犚犲犪犮狋犻狅狀犳狅狉犇犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳犇狌犮犽犺犲狆犪狋犻狋犻狊狏犻狉狌狊犜狔狆犲１ ＤＡＮＧＬｏｎｇ１，ＤＥＮＧＳｈｕｎｚｈｏｕ１，ＺＨＡＮＧＷｅｎｂｏ１， ＤＡＩＹｉｍｉｎ１，ＣＨＥＮＳｏｎｇｃｈａｎｇ２ （１．犆狅犾犾犲犵犲狅犳犃狀犻犿犪犾犛犮犻犲狀犮犲，犑犻犪狀犵狓犻犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔，犖犪狀犮犺犪狀犵，犑犻犪狀犵狓犻，３３００４５，犆犺犻狀犪； ２．犖犪狀犮犺犪狀犵犑犻狀犿狌犃狀犻犿犪犾犎犲犪犾狋犺犛犲狉狏犻犮犲狊犆狅犿狆犪狀狔，犖犪狀犮犺犪狀犵，犑犻犪狀犵狓犻，３３００１３，犆犺犻狀犪） 犃犫狊狋狉犪犮狋：ＡｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＲＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｅｎｃｏｄｉｎｇｒｅｇｉｏｎｉｎｇｅｎｏｍｅｏｆｄｕｃｋｈｅｐａｔｉｔｉｓｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ１（ＤＨＶ１），ｐｒｉｍｅｒｓｗｅｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄｗｉｔｈｈｅｌｐｏｆｏｌｉｇｏｄｅｓｉｇｎｓｏｆｔｗａｒｅ，ａｎｄａＲＴＰＣＲａｓｓａｙｆｏｒｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＤＨＶ１ｗａｓｄｅｖｅｌｏｐｅｄ．Ａｓｐｅｃｉｆｉｃ３１２ｂｐｆｒａｇｍｅｎｔｗａｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒｏｍＲＮＡｔｅｍｐｌａｔｅｓｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍＪｉａｎｇｘｉ．Ｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙａｎｄｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，ｉｔ＇ｓｐｒｏｖｅｄｔｈａｔｎｏｂａｎｄｓ ｗｅｒｅａｍｐｌｉｆｉｅｄｗｉｔｈｔｅｍｐｌａｔｅｓｅｘｔｒａｃｔｅｄｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙｆｒｏｍＮｅｗｃａｓｔｌｅｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓ（ＮＤＶ），ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｂｕｒｓａｌ ｄｉｓｅａｓｅ（ＩＢＤＶ），ｄｕｃｋｐｌａｇｕｅｖｉｒｕｓ（ＤＰＶ），ｇｏｓｌｉｎｇｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ（ＧＰＶ）ａｎｄＤＨＶ１ｕｎｉｎｆｅｃｔｅｄｄｕｃｋｌｉｖｅｒｔｉｓ ｓｕｅ．ＴｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆｔｈｅＲＴＰＣＲａｓｓａｙｗａｓ２０ｐｇ．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｔｈｅｅｘｐｅｃｔｅｄｇｅｎｅｗａｓｃｅｒｔｉｆｉｅｄｔｈｒｏｕｇｈ ｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．ＴｈｉｓＲＴＰＣＲｍｅｔｈｏｄｃａｎｂｅｒｅａｄｉｌｙａｄａｐｔｅｄｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＤＨＶ１ｆｒｏｍｃｌｉｎｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅｓ． 犓犲狔狑狅狉犱狊：Ｄｕｃｋｈｅｐａｔｉｔｉｓｖｉｒｕｓｔｙｐｅ１；ＲＴＰＣＲ；ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ 参考文献 见《动物医学进展》２００９年第１０期 ８４ 动物医学进展　２００９年　第３０卷　第１０期（总第１９５期）