血凝及血凝抑制试验——血凝试验

血凝及血凝抑制试验——血凝试验 血凝及血凝抑制试验——血凝试验 录入时间:2008-11-19 16:57:33 来源：青岛海博生物 （1）实验原理：流感病毒表面的血凝素能与人的“O”型红细胞、豚鼠和鸡的红细胞上的血凝素受体结合，引起红细胞凝集。 （2）实验材料 ①流感病毒的尿囊腔培养液或羊膜腔的羊水培养液。 ②病人血清、0.5%鸡红细胞悬液。 ③流感病毒型与亚型免疫血清。 ④试管架、无菌小试管、无菌生理盐水、毛细滴管。 （3）实验方法 ①取小试管9支，第1管加生理盐水0.1ml，其他各管均加0.5ml。 ②取收获的尿囊液0.1ml，加入第1管中作1：10稀释，混匀后吸取0.5ml（1：10稀释）加至第2管混匀，混匀后从第2管中吸取0.5ml置第3管混匀……依次作倍比稀释至第8管，混匀后从第8管中取出0.5ml弃去。这样各管的液体量均为0.5ml，从第1管至第8管的尿液稀释度为1：10，1：20…1：1280，第9管为生理盐水对照管。 ③稀释完毕后每管加入0.5%鸡红细胞悬液0.5ml. 混匀，室温放置30—45min，立即观察结果，观察时轻拿、勿摇。 （4）结果判定各管出现鸡红细胞凝集程度 以“++++”、“+++”、“++”、“+”、“—”表示，以出现“++”病毒的最高稀释度为血凝效价。 ++++：鸡红细胞全部凝集成块状，凝集的红细胞铺满管底。 +++：大部分鸡红细胞凝集，在管底铺成薄膜状，但有少数红细胞不凝，在管底中心形成小红点。 ++ ：约有半数鸡红细胞凝集，在管底铺成薄膜，面积较小，不凝集的红细胞在管底中心形成小圆点。 +：只有少数鸡红细胞凝集，不凝集的红细胞在管底聚成小圆点，凝集的红细胞在小圆点周围。 —：不凝集。鸡红细胞沉于管底，呈一边缘整齐的致密圆点。 按上述结果举例的流感病毒的血凝效价为1：320，即病毒液稀释至1：320时，每0.5ml中含1个血凝单位。若配4个血凝单位，病毒液应稀释成1：80。 如果血凝试验阳性，应该进一步做血凝抑制试验鉴定该病毒的型甚至亚型。 血凝及血凝抑制试验——血凝抑制试验———定量法 录入时间:2008-11-19 16:58:35 来源：青岛海博生物 （1）实验原理：在病毒悬液中加入特异性抗血清，再加入人的“O”型红细胞或鸡、豚鼠的红细胞则不发生凝集现象，即为血凝抑制。因试验中用已知抗血清，故可鉴定病毒型及亚型。 （2）实验材料 ①流感病毒液（尿囊液）效价为4个血凝单位/0.5ml。 ②流感病人血清。 ③其他同血凝试验。 （3）实验方法 ①病人血清用霍乱滤液处理，除去其中非特异性抑制素。 ②取小试管10支，各加入生理盐水0.5ml。 ③取处理后1：5稀释的病人血清0.5ml，加入第1管中作1：10稀释，混匀后取0.5ml加至第2管，并依次作倍比稀释，到第8管为止，弃去0.5ml，第9管为病毒对照，第10管为血清对照。第1—8管血清稀释度为1：10—1：1280。 ④稀释完毕后，第1—9管加入4个血凝单位的病毒悬液0.5ml，混匀。第10管不加病毒悬液。 ⑤摇匀后，每管加入0.5%鸡红细胞0.5ml，混匀，置室温30min、15min各观察结果一次，以*#%() 结果为准。 （4）实验结果 以能完全抑制血细胞凝集的血清最高稀释倍数为血凝抑制效价。 （5）临床意义 发现与鉴定病毒；诊断病毒病；病毒分型；免疫机体后抗体效价的测定；浓缩病毒；病毒抗原分析（某些病毒可用交叉血凝抑制试验分析抗原成分）；病毒株变异相的测定等。 补体结合试验 录入时间:2008-11-19 16:59:41 来源：青岛海博生物 1、原理 特异性病毒抗原和相应的抗体结合形成免疫复合物时能结合补体。因此加定量的补体于抗原抗体的反应系统中，补体被结合，不再以游离形式存在，此时如再加入另一抗原一抗体系统（羊红细胞和溶血素），则后者因缺乏游离的补体参与其溶血反应而不溶血，补体结合试验为阳性反应。如被测系统中没有病毒抗原或没有病毒抗体，不能形成复合物，加入定量的补体仍以游离形式存在，再加入红细胞和溶血素系统，补体即参与作用而显现溶血，此时补体结合试验为阴性反应。 本法操作烦琐，特异性较中和试验低，但补体结合抗体出现早，消退快，有助于早期诊断。 2、临床意义 主要用于流行病学调查；病毒病的诊断；疫苗使用后人群抗体情况调查；检测病毒抗原；鉴定病毒属。 和试验—实验方法 录入时间:2008-11-19 17:09:23 来源：青岛海博生物 病毒中和试验有两种方法：固定血清一稀释病毒法和固定病毒一稀释血清法。固定血清一稀释病毒法应用较普遍 。 （1）固定血清一稀释病毒法将等量血清与不同稀释度的病毒相结合，相互作用后接种小白鼠，结果以中和指数表示。 ①⑥病毒滴度LD50（半数致死量 ）、EID50（半数鸡胚感染量 ）、TCID50（半数组织培养感染量）测定。 ②先将病毒制成0.2病毒悬液，然后作一系列10倍递次稀释，使之成为0.02，0.002，......。中和试验选择的病毒稀释度范围，要根据病毒滴定的结果而定。 ③将选定的稀释度病毒分别定量加入两排无菌试管内。一排每管加入与病毒等量的免疫（或被检）血清作为试验组，另一排每管加入与免疫（或被检 ）血清同样的正常血清作为对照组。充分摇匀后置37℃水浴作用1h。 ④按“病毒滴度测定”的方法接种实验动物（鸡胚或组织培养）。以同样方法计算试验组及对照组的LD50（EID50或TCID50）。 ⑤结果计算。对照组LD50（EID50或TCID50）减去试验组LD50（EID50或TCID50）后差数的反对数，为陂检标本的中和指数。中和指数小于10为阴性，10—50为可疑，大于50为阳性。 （2）固定病毒-稀释血清法：将定量的病毒与不同稀释度的血清相结合，作用后接种动物、鸡胚或细胞管，以测定血清中中和抗体的效价。 ①④⑤病毒滴度LD50、EID50、TCID50测定。 ②将试验血清做系列倍比稀释，使之成1：2，1;4，1:8……。 ③将病毒稀释成每只动物（鸡胚或细胞管）1/2接种量中含100 LD50（EID50或TCID50），计算病毒稀释倍数的方法为（以TCID50为例）： a=lg（TCID50/0.2ml）—lg（中和试验时1/2病毒接种量）—lg（每管接种量/每管接种病毒量） 上式计算结果的反对数，10（a）即为病毒应稀释的倍数。 例如，某病毒lg（TCID50/0.2ml）=6.5，中和试验时1/2接种量（即0.1ml）中含100 LD50，则a=6.5—lg100—lg2=4.2，而10（4.2）=15849，即为病毒应稀释的倍数。 ④不同稀释度血清与等量病毒相加，摇匀放37℃水浴作用1h，接种动物（鸡胚或细胞管）。 ⑤结果计算。固定病毒一稀释血清法中和试验的结果计算，是计算出保护50%动物不死亡的血清稀释度。 动物接种 录入时间:2008-11-19 17:10:53 来源：青岛海博生物 （一）实验动物的选择 选择合适的实验动物对实验结果的准确性具有重要意义，选择内容应包括动物的种系特征、动物对病毒的敏感性，以及动物的年龄、体重、性别和数量等。选择的原则如下。 ①选择对被诊断和研究的病毒易感的动物。 ②实验动物要确保健康无病，在接种一周前要从动物室领取实验所需动物，使其适应环境并做健康检查，对发病和异常者应立即淘汰。 ③同一实验要选择大小一致的动物。 ④对大型动物作某些途径接种，要对实验动物进行麻醉，接种不同动物应选择不同的麻醉剂。 （二）动物接种途径 根据实验研究的目的不同选择各种不同的接种途径（表1）。 表1 各种病毒常见的实验动物与接种途径 病毒名称 实验动物 接种途径 小白鼠 脑内、腹腔、皮下 流行性乙型脑炎病毒 恒河猴 脑内、鼻 内、皮下 小白鼠 脑内、腹腔、静脉、皮下 森林脑炎病毒 绵羊 脑内 恒河猴 脑内 雪貂 鼻内 流行性感冒病毒 小白鼠 鼻内 猴 鼻内 恒河猴 皮下、肌 肉、静脉、脑 内 麻疹病毒 豚鼠、家兔 腹腔 豚 鼠、猴 皮下、腹腔、鼻 内、静脉 风疹病毒 雪貂 皮下、脑内 腮腺炎病毒 恒河猴 脑内、腹腔、静脉、腮腺 家兔 角膜、脑内 单纯疱疹病毒 豚鼠 趾 小白鼠 脑内、鼻内、腹腔 流行性角膜炎、结膜炎病毒 家兔 脑内、角膜 猴 脑内、鼻内、腹腔 小白鼠 脑内、脊髓 内 脊髓灰质炎病毒 金黄地鼠 脑内 家兔 脑内、皮下 狂犬病毒 大白鼠、小 自鼠 脑内 犬、猫、猴、鸡 脑内 柯萨奇病毒甲型 初生小白鼠 脑内、肌肉、腹腔、皮下 病毒组织培养技术1 录入时间:2008-11-19 17:11:26 来源：青岛海博生物 广义上的组织培养技术包括：器官培养、组织块培养和细胞培养。目前一般所指的组织培养多指细胞培养。根据细胞的来源、染色体特性和传代次数的不同可分为：原代和次代细胞培养、二倍体细胞株和传代细胞系。 1、材料 ①无菌玻璃器皿。平皿、吸管、滴管、三角烧瓶、链霉素小瓶、胶塞等。 ②解剖器材。无菌小剪、镊子。 ③各种溶液。Hanks液、2.5g/l胰酶。细胞生长液 （0.5%水解乳蛋白88ml、双抗1ml、小牛血清10ml，用5.6%NaHCO3 0.8—1ml调至pH7.2），细胞维持液（0.5%水解乳蛋白95ml、双抗1ml、小牛血清3ml，用5.6%NaHCO3 0.8—1ml调至pH7.2左右）。 ④孵育9—11d鸡胚。 ⑤其他。血细胞计数器、离心机、水浴箱、消毒棉球等。 2、方法 （1）单层细胞的培养 ①取9—11d龄鸡胚用碘酒将卵壳消毒后，无菌操作取出鸡胚放于平皿内，去头、爪、内脏及骨骼，用Hanks液洗涤3次，除去残存血液。 ②将组织块移入链霉素小瓶内，用无菌剪刀将鸡胚剪碎成0.5—1.0mm3的小块，用含有双抗的Hanks液洗涤3次。 ③消化。加入5倍量的2.5g/l胰酶，置37℃水浴箱消化15min，用冷Hanks液洗涤1次，除去剩余的胰酶。 ④分散细胞。加入2ml生长液，用毛细管反复吹打，使细胞分散，加适量生长液稀释细胞悬液。 ⑤细胞计数。吸取0.1ml细胞悬液加0.8mlHank液及0.1ml（0.4%）台盼蓝染液，混匀后，滴入血细胞计数器内，按白细胞计数法计数细胞数。 ⑥细胞分装与培养。将细胞悬液分至4个小培养瓶中（每瓶1.5ml或根据细胞计数结果，用生长液将细胞稀释成300000——500000个/ml，加入小培养瓶内，放孵箱37℃培养。24—48h后显微镜下观察，见到生长成片的单层鸡胚成纤维细胞。 （2）组织块培养：Maitland（1928）将鸡肾组织剪成小块悬浮于泰洛液及鸡血清中，静置于37℃培养，这种悬浮培养虽没有细胞生长，但能供病毒繁殖。 目前此法已不常用，但这种方法简便，不需胰酶消化，不怕振动，可携带至现场应用，并且组织块培养细胞维持时间较长，可能有利于慢病毒分离。 小组织块培养可分为悬浮培养和固定培养两种。 ①小组织块悬浮培养技术 a、将组织剪成0.5—1.0mm3的小块。 b、Hanks液洗3次，新鲜的组织块很容易粘贴于玻璃上。 c、按10—15块组织加入1ml生长液的比例，在试管或瓶中培养。 ②小组织块固定培养技术 a、小组织块制备同前。 b、将洗液吸干，加入少量生长液。 c、用毛细管约吸6—10块小组织块，分散放在试管壁下1/3最好成一直线。 d、轻轻把细胞管旋转约180℃，使粘有组织的玻面向上，溶液流走。 e、加入1ml生长液，不要与组织块接触。 f、将细胞管斜放置37℃，此时组织块在玻璃上面，生长液在下面。 g、在前几天，每天将细胞管轻轻旋转2，以润湿组织块。 h、细胞开始由组织块长出后，可使生长液浸泡组织块继续培养。 （3）器官培养：器官培养不是常规技术，但对某些病毒的分离鉴定有用，如用单层细胞未能分离出的冠状病毒，利用器官培养就能实现分离。例如，利用正常气管进行器官培养，纤毛运动即停止，纤毛细胞亦出现病变，最后脱落。有些病毒虽能在气管培养上繁殖，但对纤毛活动无明显的影响。 ①取5—9个月死胚的气管组织。 ②用含5倍浓抗生素的Hanks液洗3次，将组织包括黏膜和软骨，用锋利的刀或剪，剪成2—3mm3的块。 ③在直径60mm的平皿中放4—6块，使软骨在下，纤毛在上。 ④加入EagleMEM或199营养液，放5%CO2温箱培养。 病毒组织培养技术2 录入时间:2008-11-19 17:11:47 来源：青岛海博生物 3、病毒的接种及检测 病毒常存在的部位有：鼻、咽、气管分泌物、粪便、组织器官、体液、脑脊液、血液。常用对病毒敏感的动物或细胞作为病毒分离的材料。拭子一般在取样后放入2ml加抗生素的肉汤中折断、涮洗，低温保存。用前将拭子中液体挤出，然后1500r/min离心15—20min，吸上清接种于细胞中。粪便标本一般用10倍Hanks液稀释，振荡使之乳化后2500r/离心15min，过滤后4℃1000r/min离心1h，取上清1.8ml，加入0.2ml抗生素4℃作用1h后接种细胞。虫媒蚊一般捕获后喂养5%葡萄糖水3d，待血食消化后，冻死。每50只为一批加入2—3ml5%酒精一生理盐水，4℃作用1h后用Hanks液洗3次，用无菌研磨器磨碎后加入Hanks液4℃1000r/min离心1h，取上清以备接种用。 细胞成片后，弃去生长液，Hanks液洗一次，接种上述处理后标本，加维持液使之能覆盖细胞，在培养温度下吸附1h后弃去，加维持液每日观察病变。 在组织培养中病毒的识别方法主要有细胞病变、蚀斑测定、红细胞吸附、干扰现象、中和试验、免疫荧光、细胞代谢改变、电镜观察等。 （1）细胞病变：多数病毒在细胞内增殖，可引起细胞形态学改变，称为细胞病变效应。常见病变为细胞变圆、融合、坏死、溶解、脱落。有的病变表现为细胞变圆，堆积成葡萄状，如腺病毒；有的则表现为细胞融合，形成多核巨细胞，如麻疹病毒；有的细胞内出现包含体，如狂犬病病毒。 细胞病变的判断可根据出现病变的细胞在整个单层中所 占面积的比例进行判定。采用标准如下： + 表示开始出现病变至少有25%细胞发生病变； ++表示有25%—50%的细胞发生病变； +++表示有50%—75%的细胞发生病变； ++++表示有75%—100%的细胞发生病变。 判定时必须对整个细胞单层进行全面的观察，然后加以判定。不能只看几个视野。因有些病毒感染可引起特殊的细胞病变，所以根据病毒所引起 的病变特点可进行初步推断，缩小鉴定范围。 （2）蚀斑测定：这是一种检查和准确滴定病毒感染性的方法。将稀释的病毒悬液加入单层细胞培养瓶中，病毒吸附后，再覆盖一层融化的半固体营养琼脂，使病毒在单层细胞培养中有限扩散。结果是每一个有感染性的病毒在单层细胞中可产生一个局限性的感染灶 。用活性染料（如中性红）染色。则活细胞着色，受病毒感染而破坏的细胞不着色，形成肉眼可见的蚀斑。每一个蚀斑是 由一个感染性病毒颗粒形成的，称作蚀斑形成单位（PFU）。病毒悬液中的感染性病毒量的滴度可用PFU/ml表示。 （3）红细胞吸附：流感病毒和副流感病毒感染的细胞膜上出现病毒基因编码的抗原，可以与红细胞结合。若向培养瓶内加入红细胞，可见红细胞吸附于细胞膜上，这种现象称为红细胞吸附现象。 （4）干扰现象某些病毒感染细胞时不出现CPE或其他易于测出的变化（如HAD），但能干扰在其后感染的另一病毒的增殖。如风疹病毒感染Vero细胞后CPE不明显，但能干扰后感染的埃可病毒的增殖，从而阻抑后者特有的CPE。若细胞出现ECHOV感染所特有的CPE，则表示在细胞内无风疹病毒增殖。反之。若培养后Vero细胞不出现特有的CPE，则说明培养细胞中有风疹病毒增殖。 （5）细胞代谢的改变：感染细胞的结果可使培养液的pH值改变，说明细胞的代谢在病毒感染后发生了变化。这种培养环境的生化改变也可作为判断病毒增殖的指标。 （6）电镜观察：可用电子显微镜直接观察细胞内外的病毒，并可了解病毒的形态及大小。 组织培养技术—组织培养原理2 录入时间:2008-11-19 17:12:52 来源：青岛海博生物 3、细胞培养的基本条件 单细胞在适当的培养条件下可迅速增殖。但若遇到不良环境细胞会变圆，停止生长，甚至死亡。细胞培养的基本条件主要包括：细胞接种量、培养液、pH值及气体条件、温度、无菌条件和培养器皿的清洁度。 细胞接种量一般来讲，细胞量越大繁殖的速度越快，但太大的细胞量对于生长也不利。接种人肾和猴肾细胞量为300000ml，小鼠或地鼠肾细胞为500000ml，鸡成纤维细胞为1000000ml，传代细胞一般100000—300000ml。细胞一般可在3—7d长成单层。 （2）合成培养液：以前多用天然培养液，现多用合成培养液。合成培养液有多种， 如Eagle液，RPMI1640，RPIM199。其主要成分为氨基酸、糖类、维生素、无机盐及其他成分。氨基酸是组成蛋白质的基本单位，所有组织培养液均需要12种氨基酸即精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、谷氨酸。Eagle液仅含有这12种氨基酸，RPMI1640、RPIM199、水解乳蛋白还含有其他氨基酸。 维生素是维持细胞生长和生物活性的物质，可作为酶的辅基或辅酶，对细胞代谢有重要影响。 糖类又称碳水化合物。所有组织培养液中均含有葡萄糖，它是细胞代谢的能量来源。 无机盐是细胞代谢必不可少的，是细胞的重要组成成分。所有用于组织培养的培养基均以无机 电解质为生理盐溶液，对于渗透压的维持、激活酶活性、缓冲等有重要作用。常用的生理盐溶液有Hanks液及Eagle液。 蒸馏水主要用于溶解上述物质。含有重金属的水对细胞有破坏作用，一般用双蒸水，去离子水亦可，但电导率须在10以下。 合成培养液中不含蛋白质成分，血清蛋白对组织培养是不可缺少的，不仅能促进细胞增长且能帮助细胞贴壁。不同血清对细胞促进作用不同，以小牛血清最好。每个批号血清使用前 需加热处理。一般经56℃30min灭活，并须了解有无细胞毒性作用。 10%血清营养液能促进细胞增殖。 （3）pH值及气体条件：细胞生长最宜的pH值范围是7.0—7.4，细胞可忍受较大的范围pH值变化（pH6.6—7.8），培养环境偏酸较偏碱更宜于细胞贴壁。培养液中的缓冲体系主要是碳酸氢盐、磷酸氢盐和血清。其中碳酸氢盐/CO2为主要的缓冲体系。细胞代谢产生的各种酸使pH值下降，而培养液中的NaHCO3产生CO2排入空间又使pH值增加。pH值的变化主要取决于HCO3-浓度、CO2分压、细胞糖代谢能力。 （4）温度：细胞培养的最适温度与细胞来源的动物体温一致。温度增加2—3℃对细胞产生不 良影响，使之在24h内死亡。低温对细胞影响较小。 （5）无菌条件：培养液不仅对细胞是高度营养物，对于细菌和霉菌也是高度营养物。细胞培养中如污染微生物，其繁殖比细胞快并能产生毒素使细胞死亡。因此细胞培养技术的关键之一是防止污染。在细胞培养中，可能发生污染的来源有：组织培养液、器皿、组织本身、工作者本身、空气等。要对培养液、器皿用具、操作室进行彻底消毒。在操作时要严格实行无菌操作。各种器皿拿人操作台前，表面应用消毒液消毒，操作时在台上最好铺一块湿的来苏尔纱布以减少空间灰尘飞扬。无菌室、超净台用前须用紫外灯照射消毒。打开培养管前须在火焰上略烧一下瓶口以使灰尘固定，操作时必须将瓶、管斜放，吸管注入液体应避免和瓶口接触，操作时应禁止谈话。 （6）培养器皿的处理：培养器皿处理的好坏与否对于细胞的贴壁生长影响很大。目前，常用的器皿主要有玻璃及塑料两大类 。玻璃器皿一般须用洁净液浸泡过夜，清水洗10次后再用蒸馏水洗2次，烤干备用。96孔或24孔塑料板一般用2%NaOH浸泡1h后，清水洗净再用1mol/lHCL浸泡1h，用清水洗后再用蒸馏水漂洗。37℃干燥后，紫外灯照射消毒。新橡皮塞须先用0.5mol的NaOH煮沸15min，洗涤后用4%HCL煮沸15min，清洗后用蒸馏水洗5次，煮沸10min灭菌。 组织培养技术—组织培养原理1 录入时间:2008-11-19 17:13:09 来源：青岛海博生物 将人或动物离体的活组织或分散的活细胞，在实验室的试管或培养瓶中，模拟体内的生理条件使之生存和生长，称为组织培养。包括器官培养、组织块培养和细胞培养。 1、组织来源 人、猴、啮齿类动物、禽的胚胎和脏器为组织培养常见的组织来源，对于虫媒病毒可使用蚊组织，手术切除的癌瘤组织可用于建立传代细胞。组织要保持新鲜，一般须在6h内处理。 2、单细胞的制备 组织分散成单细胞的方法主要有3种：机械分散法、酶消化法、螯合剂分散法。后两种方法多与机械法结合使用。 （1）机械分散法：适用于细胞间连接较松的组织，如鸡胚组织。可将鸡胚剪成1mm3的小块，放在底部有一块铜丝网的10—20ml注射器内，用手的压力将组织细胞挤过网孔。脾脏组织的分散可将脾组织放在无菌平皿中，用1ml注射器芯轻压，使细胞出来。 （2）酶消化法：目前主要用胰酶，它能消化细胞间的蛋白质成分。组织块受胰蛋白酶作用后细胞变为圆形，再用吸管机械吹打或电动搅拌细胞可分散。胰蛋白酶用的浓度过大或时间过长对细胞均有损害，影响细胞的生长。一般用2.5—5g/l的胰酶，消化液量为消化物的5—10倍，37℃作用20—30min，大的组织块可作用60min，pH值范围一般在7.4—7.6。 （3）螯合剂分散法：钙离子和镁离子是细胞结合的离子。单层细胞在缺少钙、镁离子的环境下，细胞变圆，分散为单细胞。乙二胺四乙酸容易与钙、镁螯合而使细胞间及细胞与玻璃培养瓶间的钙、镁离子螯合，而达到细胞分散的目的，但对于新鲜组织的分散效果不佳，故多用于单层细胞的分散。乙二胺四乙酸不受血清的抑制，所以，消化后需用Hanks液洗去残留乙二胺四乙酸，以免影响细胞生长。 鸡胚培养技术—接种与收获 录入时间:2008-11-19 17:13:47 来源：青岛海博生物 （四）接种与收获 1、材料 ①来亨鸡白色受精卵、卵架、检卵灯。 ②碘酒、酒精消毒棉球。 ③灭菌的手术刀、镊子、剪刀、平皿。 ④1ml注射器及6号针头、12号针头。 ⑤乙型脑炎病毒液、单纯疱疹病毒液。 ⑥流感病毒稀释液。 ⑦磨卵机、透明胶纸。 2、方法 常用接种方法有四种，可根据病毒种类、接种目的不同，采用适当的接种途径。 （1）卵黄囊接种法 ①取6—8日龄鸡胚，在检卵灯下画出气室和胎位，置卵盘上，气室端向上。 ②用碘酊、酒精消毒气室，然后用磨卵器在气室中央磨一小孔（用砂轮代替磨卵器也可）。 ③用碘酊、酒精消毒，以12ml注射器吸取乙型脑炎病毒液，针头自气室小孔朝胚胎相反方向旁侧斜刺入，深度3cm左右，即达卵中心卵黄囊内。注入量0.2—0.5ml，接种后以无菌蜡封闭小孔。根据接种病毒种类不同，置33—37℃温箱中培养，每天检卵一次。 ④取孵育24h以上濒死的鸡胚直立于卵盘上，钝端向上。气室部位用碘酊、酒精消毒后，用无菌镊子击破气室并除去卵壳。用另一无菌镊子夹破绒毛尿囊膜和卵膜，取出胚胎，然后夹住卵黄脐带处，小心收获卵黄囊。如制涂片，可从中剪一小块，轻涂于载玻片上，固定、染色、镜检。可放低温冰箱保存，备用。 （2）绒毛尿囊膜接种法 ①取10—12日龄鸡胚，于检卵灯上画出气室与胎位，并在胎位无大血管处画一记号。 ②将卵直立于卵架上，钝端向上，先在气室部位用碘酊、酒精消毒，用磨卵器或砂轮在气室中磨一小孔，勿伤卵膜。 ③将卵平放，无大血管记号处向上，再依次用碘酊、酒精消毒记号处，用磨卵台或砂轮打一长为3—4mm的三角形小口，将卵壳取下，勿损伤壳膜，用注射针头在壳膜上划一小缝，勿伤绒毛尿囊膜，将一滴生理盐水滴于卵膜缝隙处。用针尖刺破气室囊膜，用大胶球自小孔处吸气造成负压，可见生理盐水下沉，绒毛尿囊膜即凹下，与壳膜已分开，人工气室制造成功。 ④用0.25ml或1ml注射器吸取单纯疱疹病毒液0.1—0.2ml，滴于绒毛尿囊膜上，用消毒的熔化石蜡封闭两口。蜡封部位向上，置37℃孵育4—5d。 ⑤将鸡卵取出后用碘酊、酒精消毒，以镊子揭去人工气室处卵壳并扩大开口，轻提绒毛尿囊膜，用剪子剪下接种面及周围的绒毛尿囊膜。置于加有无菌生理盐水的平皿中观察病变及作其他检验用。 （3）尿囊腔接种法 ①常用9—12日龄鸡胚，检卵灯下画出气室界限，并在胚胎旁绒毛尿囊膜发育良好无大血管处和气室交界处画一记号。 ②用碘酊、酒精消毒，以磨卵器或砂轮磨一小孔，划破卵壳不损伤卵膜，以注射器吸取流感病毒液0.05—0.2ml，刺入壳膜少许，即可达尿囊腔。 ③以透明胶纸封闭注射孔，置35—36℃孵育3d取出。 ④为防止出血，收获前先将鸡胚置 ,4℃冰箱冷却7—12h。取出后用碘酊、酒精消毒气室端，以镊子式剪子沿气室周围除去卵壳，撕去壳膜。以毛细管或注射器穿破绒毛尿囊膜吸取尿液，置无菌瓶中备检。 （4）羊膜腔接种法 ①取9—11日龄鸡胚，该部位接种，孵育鸡胚时，将气室端向上，让胎位接近气室，便于接种。在检卵灯下画出胎位、气室，用砂轮或磨卵器沿气室边缘和胚胎位置靠近处，开一道3mm的浅沟，并开一不损伤卵膜的孔。 ②用碘酊、酒精消毒，然后用无菌镊子揭去壳膜，并滴一滴无菌液体石蜡以使下面的膜透明，通过透明的膜，可清楚见到整个胚胎。 ③用注射器吸取标本，针头对准开口处向鸡胚直下，穿过绒毛尿囊膜、羊膜，进入羊膜腔，注入标本0.1—0.2ml，注射后用胶布封口，胶布下垫一无菌纸块，然后置35—37℃温箱孵育3—4d。 ④收获前将鸡胚置4℃冰箱7—12或-4℃冰箱30min，将鸡胚冻死，以减少收获时出血。撕去胶布，卵壳以碘酊、酒精消毒，用镊子撕去卵膜。左手持镊子夹住羊膜腔，右手用毛细管或带针头的注射器吸取羊水，放无菌小试管中备用。 3、结果观察 检查接种标本后的鸡胚，是否被病毒感染，有两种方法：直接法和间接法。 （1）直接法仅能看到绒毛尿囊膜上是否形成痘疮，鸡胚是否有特殊的病理变化，是否生长发育缓慢或死亡。如疱疹病毒在绒毛尿囊膜上可形成特殊 的痘疮；流行性乙型脑炎病毒、新城鸡瘟病毒可引起鸡胚死亡，可用作感染指标，但必须与接种损伤、标本毒性、细菌污染相区别。 ④接种损伤。接种损伤所引起的死亡，通常散在无规律性，病毒引起的死亡有潜伏期并有一定规律性。 ②标本毒性。毒性引起死亡，标本经稀释后，即不出现死亡。 ③细菌污染。污染引起死亡，尿液呈灰色、浑浊，鸡胚无光泽。 ④排除上述三种情况，可确认为临床诊断指标。 （2）间接法：大部分需要鸡胚培养后收获，利用间接法。如流感病毒用尿液和羊水作血凝和血凝抑制试验；腮腺炎病毒用鸡胚的体液、组织及特异性诊断血清作补体结合试验；狂犬病病毒注入鸡胚脑内，收获后取脑组织作病理切片或直接涂片查找包含体。由于病毒种类不同，可选择不同方法作临床诊断指标。 鸡胚培养技术—接种前的准备和注意事项 录入时间:2008-11-19 17:14:06 来源：青岛海博生物 1、接种前的准备 （1）鸡胚的准备接种前用检卵灯观察鸡胚的活动、气室的界线和胚胎的位置，并将气室边缘和接种位置作一记号。 （2）实验室的准备：因鸡胚是细菌的良好培养基，操作时要求严格的无菌条件。实验室、无菌室以及净化工作台必须经紫外灯消毒。各种实验用器具必须无菌。 （3）接种标本的准备：用于分离培养的病毒标本要确保无菌。如无把握，要用抗生素（青霉素、链霉素）处理后，方可接种鸡胚。 2、注意事项 （1）防止污染：接种全过程要求无菌操作。为减少污染，要求方法简单、操作迅速 。 （2）温度要适宜在室温较低 的冬季要采取保温措施才能进行鸡胚接种，以减少死亡。接种过的鸡胚，要根据所接种的病原体生长增殖所需要的温度，置温箱中孵育。 免疫电镜观察病毒形态 录入时间:2008-11-19 17:14:48 来源：青岛海博生物 许多情况下，病毒颗粒与标本中其他颗粒混杂在一起，很难分辨形态。免疫电镜技术是借助抗血清与病毒颗粒特异性结合，包被病毒使之凝聚加以区别。可以观察病毒含量较少的标本是其优点。 1、原理 标本中的病毒与稀释的血清中抗体结合形成抗原一抗体复合物，电镜观察。 2、材料 ①20g/l磷钨酸（PTA）。用双蒸馏水配制20g/l磷钨酸溶液，用1mol/lNaOH校正pH值为6.8。 ②涂有炭及聚乙烯醇缩 甲醛的铜网。 ③病毒相应抗血清。 ④平皿、滤纸、游丝镊子、微量毛细管，10g/l琼脂凝胶块，蜡皈。 3、操作方法 ①取0.9ml病毒悬液，加入0.1ml稀释的病毒相应血清，37℃30min，充分反应。 ②取10g/l琼脂凝胶块，下面垫三层普通滤纸，将一滴抗原-抗体复合物悬滴在琼脂凝胶块上，将涂膜的铜网扣在悬滴表面使之漂浮。 ③在悬滴未被吸干之前取下铜网，倒转在蜡板上，立即滴加磷钨酸染液染色1min，用滤纸毛边吸干多余染液，电镜观察。 4、结果 显示病毒形态、结构。 5、注意事项 注意掌握抗原、抗体比例，比例适当方可形成大小合适的抗原 ; 抗体复合物。 真菌的一般检验法——不染色标本直接检验法 录入时间:2008-11-21 14:03:19 来源：青岛海博生物 真菌的一般检验法为直接镜检观察是否有菌丝、孢子或菌体，检出循环抗原等。直接镜检对真菌病诊断很重要，尤其对威胁生命的真菌病，快速、准确的非培养诊断法是非常必要的。 不染色标本直接镜检除部分深部感染真菌可初步确定菌种外，大部分浅部感染真菌仅能确定真菌菌丝和有无孢子，很难确定为何种真菌感染。 1、材料 ①标本。甲屑、皮屑、毛发等固体标本；脓汁、尿沉渣、分泌物等液体标本。 ②试剂。100g/lNaOH或KOH溶液；生理盐水。 ③其他。小镊子、盖玻片、载玻片。 方法 （1）制片方法将甲屑、皮屑、毛发等 固体标本置灭菌洁净载玻片上，加一滴封固剂（100g/lNaOH或KOH溶液），盖上盖玻片，微加热使角质软化，轻压盖玻片，使标本变薄、透明，并驱除气泡。脓汁、尿沉渣、分泌物等标本仅用无菌生理盐水稀释即可。 （2）检验方法：先用低倍显微镜检查，当查到可疑为真菌孢子或菌丝时，再换高倍镜检查，观察菌丝和孢子。许多标本不需染色即可直接镜检。如观察分生孢子的发育需放大1000倍。有些结构如分生孢子梗上产生的瓶梗需用相差显微镜才看得清楚。某些病原性真菌如荚膜组织胞浆菌、皮炎芽生菌、粗球孢子菌感染病人标本中，直接检出与这些病原菌形态特征符合的真菌时，结合临床表现容易作出明确诊断。如果检出的是正常菌群，要确定其病原性比较困难。在酸中毒的糖尿病病人暴发急性感染时，如检出宽或波形不分隔的菌丝则应考虑毛霉菌病。直接检出的结果也有助于实验室进一步诊断，有助于采取恰当的检验步骤和措施（如选择特殊的培养基和确定适宜的孵育时间）。但是，直接检查也有其局限性，因为阴性结果也不能排除真菌感染，直接检查不如培养法敏感，其敏感性也随标本类型、数量、采集时间和质量等而有不同；也有假阳性结果，溶解的淋巴细胞在脑脊液印度墨汁湿片中易误认为新型隐球菌；脂肪微滴也可能与出芽酵母细胞混淆。出现可疑结果时应进行复查，或采用其他检验步骤。除花斑癣病原菌培养有困难只能依据直接镜检诊断外，一般标本应进一步作培养检查。 真菌的鉴别方法 录入时间:2008-11-21 14:13:33 来源：青岛海博生物 真菌是一大类具有典型细胞核的真核细胞型微生物，分布广泛，种类达数千种，对人类有致病性的有百余种。大部分真菌为多细胞结构，由菌丝和孢子组成。菌丝是多细胞的，各细胞间的细胞质相通，具有中隔或横隔的菌丝在中隔上有小孔，细胞质可流通，细胞核也可以在菌丝中移动。孢子有多种，形态各异。少部分真菌为单细胞的，称之为酵母型细胞。真菌的菌丝和孢子形态特异，是鉴别真菌的重要，用低倍或高倍显微镜就可观察，有助于真菌的鉴定。 表 常见的真菌感染形式及所致疾病 感染形式 常见真菌 疾病 浅表感染 秕糠状鳞斑癣菌 花斑癣疹 皮肤感染 毛癣菌属和表皮癣菌属 皮肤病（皮肤、毛发、甲） 小孢子菌属 癣（皮肤、毛发、甲） 白假丝酵母菌 皮肤或 口腔黏膜的念珠菌病 皮下组织感染 申克孢子丝菌 申克孢子丝菌病 深层感染 皮炎芽生菌 芽生菌病 酷厌球孢子菌 球孢子菌病 荚膜组织胞浆菌 组织胞浆菌病 巴西副球孢子菌 副球孢子菌病 深层机会感染 自假丝酵母菌和其他念珠菌 念珠菌病 新型隐球菌 隐球菌病 薰烟色曲霉菌和其他各种 曲霉菌 曲霉菌病 毛霉菌和根霉菌 接合霉菌病 真菌的一般检验法——染色标本检查法 录入时间:2008-11-21 14:15:15 来源：青岛海博生物 真菌感染的临床标本多数采用不染色直接镜检，可查到菌丝和孢子。有些深部感染真菌形态特殊，菌体较小，必须染色后才能更清楚地观察到其形态和结构。皮屑内的叠瓦癣菌及球孢子菌的菌丝在染色后关节孢子较为明显。尤其组织病理检查寻找菌体，更需要特殊染色。此外，染色标本有利于保存涂片，便于教学应用。 1、材料 ①标本。甲屑、皮屑、毛发等固体标本；脓汁、尿沉渣、分泌物等液体标本。 ②革兰染色液、瑞氏染色液、姬氏染色液、印度墨汁。 2、方法 （1）染色标本的制作标本是分泌物、脓汁、脑脊液，与细菌染色标本处理相同。临床病理标本如皮屑、甲屑、毛发等标本过厚时，须先用100—200g/lNaOH或KOH溶液处理5—20min，然后再在盖玻片一端加染色液，另一端用吸水纸缓慢地将100—200g/lNaOH或KOH溶液吸去，直到真菌染上色为止，最后封固。如标本是培养物，先在载玻片上滴上一滴100—200g/lNaOH或KOH溶液，然后轻轻地从菌落钩取菌丝，置于100g/lNaOH或KOH溶液中，用接种针轻轻分开，尽量保持菌丝原来的特殊结构，然后放上盖玻片，微微加热，加压排出气泡，之后进行染色。 （2）染色方法：临床标本也可用革兰染色、瑞氏染色、姬氏染色等方法镜检，后两种染色多限于检出骨髓和外周血片中的荚膜组织胞浆菌。印度墨汁标本片常用于新型隐球菌荚膜负染色。裴氏染色为细胞学的一种染色方法，染液包括苏木素、伊红等染料，病人痰标本染色后酵母细胞胞质呈深色。胞壁无色。过碘酸-SchMF（PAS）和环六亚甲基四胺硝酸银染色为组织切片染色法。癣病标本多用KOH湿片检查，也可用荧光素染色，在荧光显微镜下观察。 产毒真菌的检验——材料与方法 录入时间:2008-11-21 14:16:31 来源：青岛海博生物 产毒真菌大部分属于曲霉菌、青霉菌属和镰刀菌属中的一些种，这些霉菌在自然界分布广泛，对储粮、动物饲料和食品侵染的机会较多，通过检测这些霉菌和毒素反映食品的安全性。 1、材料和试剂 （1）器材：温箱（25—28℃）、目镜测微尺、物镜测微尺、显微镜、超净工作台、放大镜、三角瓶、试管、平皿、酒精灯、载物玻片、盖玻片等。 （2）培养基和试剂：察氏培养基、马铃薯一葡萄糖琼脂培养基、马铃薯琼脂培养基、玉米粉琼脂培养基、灭菌蒸馏水、乙醇。 2、方法 （1）采样采取有代表性的样品250—500g，尽快检验。 （2）表面除杂菌如为粮粒样品，取样品10—20，放入灭菌的150ml三角瓶中，无菌条件下加入无菌水超过样面1—2cm左右，塞好塞子充分振摇1—2min；将水倒净后，再加水振荡，反复洗涤10次，弃去水后。将粮粒倒于无菌平皿中备用；原粮样品应先用75%酒精浸泡1—2min，脱去粮粒表面蜡质，倾去酒精后，再用上法洗涤，备用。 （3）接种与培养：用无菌镊子将 已处理好的粮粒胚部向下，均匀地插种在高渗察氏平板上（粮粒的一部分插入培养基中），小粒样品如大米接种10粒/皿，大粒的样品如玉米、大豆等接种5粒/皿，每份样品须接种100粒。将种有样品的平皿置25—28℃孵箱培养5—7d，培养后期应每天观察菌落生长情况，以免生长较快的霉菌将其他的菌覆盖，影响观察及检验结果。 （4）计数：记录100粒粮食中长霉菌的数量，同时记录每一粒所生长的霉菌数，计算霉菌侵染的粒数和菌落生长的总数。在计数时，只计数与粮粒相连接的菌落。 （5）镜检与初分离：用接种钩在平皿上钩取一小块稍带少许培养基的培养物，放在已滴加1—2滴乳酸苯酚液的载玻片上，再用两支接种钩轻轻地将培养物分开，然后盖上盖玻片，先在低倍镜下找到培养物。再将显微镜的聚光器位置降低，光圈调小，转至高倍镜下观察。如为曲霉属可见典型的分生孢子头；青霉属的真菌镜下可见有鉴别意义的帚状枝；而镰刀菌属可见镰刀状的大分生孢子等。将它们分别转种于相应的鉴别培养基平板和斜面，25—28℃孵箱培养5—14d。 （6）常见产毒霉菌鉴定：霉菌的鉴定主要依靠形态特征，包括菌落特征和镜下特征。需观察的镜下特征包括霉菌的菌丝和孢子的形态和特征、孢子的排列等，并详细记录。 产毒真菌的检验——结果 录入时间:2008-11-21 14:17:25 来源：青岛海博生物 常见真菌菌落特征如下。 （1）菌落生长的速度：用培养一定天数的菌落直径大小来表示霉菌生长的速度，也可用局限生长表示生长速度慢，蔓延生长表示生长速度快。 （2）菌落的颜色：霉菌菌落的颜色应包括菌落表面的颜色、菌落背面的颜色、菌落周围培养基的颜色，以及霉菌在不同生长阶段的颜色变化。 （3）菌落的质地：根据菌丝的长短、疏密以及孢子的有无和多少，菌落的质地可为绒状、絮状、绳状和束状。 （4）菌落的表面：疏松或致密，平坦、凹陷或隆起，有无皱褶，有无放射状或同心环状的沟纹，边缘是否整齐等。 （5）渗出物：有的菌种常常在菌落表面出现带颜色的似液体物即为渗出物，记录其色调和分泌的量。 （6）气味：是否出现除霉味以外的其他特殊的气味。 （7）菌丝：由孢子在环境适合情况下长出的芽管延长而成，可长出许多分枝，形成交织成团状的菌丝体。在显微镜下为或粗或细、有隔或无隔的、具分枝的结构。有的皮肤感染的真菌会形成螺旋状、球拍状、结节状、鹿角状及梳状等具鉴别意义的特殊菌丝。但粮食中真菌的菌丝一般无鉴别意义。 （8）孢子：是真菌的繁殖器官，一条菌丝上可长出多个孢子，当环境条件适合时，孢子又发芽发育成菌丝。根据产生孢子的方式不同，分为有性孢子和无性孢子两类 。有性孢子有接合孢子、卵孢子、担孢子和子囊孢子；无性孢子有分生孢子、孢子囊孢子、叶状孢子（包括芽生孢子、厚膜孢子和关节孢子）。在产毒霉菌鉴定中后者更有意义。 常见霉菌特征 录入时间:2008-11-21 14:18:10 来源：青岛海博生物 1、曲霉属 曲霉属主要的产毒 曲霉菌包括黄曲霉、寄生曲霉、杂色曲霉、构巢曲霉和棕曲霉。这些霉菌的代谢产物为黄 曲霉毒素、杂色曲霉素和棕曲霉毒素。曲霉属的颜色多样，而且比较稳定。营养菌丝体由具横隔的分枝菌丝构成，无色或有明亮的颜色，一部分埋伏型，一部分气生型。分生孢子梗大都无横隔，光滑、粗糙或有麻点。梗的顶端膨大形成棍棒形、椭圆形、半球形或球形的顶囊，在顶囊上生出一层或二层小梗，双层时下面一层为梗基，每个梗基上再着生两个或几个小梗。从每个小梗的顶端相继生出一串分生孢子。由顶囊、小梗以及分生孢子链构成一个头状体的结构，称为分生孢子头。分生孢子头有各种不同颜色和形状，如球形、放射形、棍棒形或直柱形等。曲霉属只有少数种形成有性阶段，产生封闭式的闭囊壳，某些种产生菌核或菌核结构，少数种可产生不同形状的壳细胞。 2、青霉属 青霉属主要的产毒霉菌包括黄绿青霉、橘青霉、圆弧青霉、展开青霉、纯绿青霉、红青霉、产紫青霉、冰岛青霉和皱褶青霉等。这些霉菌产生的毒素为黄绿青霉素、橘青霉素、圆弧偶氮酸、展青霉素、红青霉素、黄天精、环氯素和皱褶青霉素。 营养菌丝体呈无色、淡色或鲜明的颜色，具横隔，或为埋伏型、或部分埋伏型部分气生型；气生菌丝密毡状、松絮状或部分结成菌丝索。分生孢子梗由埋伏型或气生型菌丝生出，稍垂直于该菌丝（除个别种外，不像曲霉那样生有足细胞），单独直立或作某种程度的集合乃至密集为一定的菌丝束，具横隔，光滑或粗糙。其端生有扫帚状的分枝轮，称为帚状枝。帚状枝是由单轮或两次到多次分枝系统构成，对称或不对称，最后一级分枝即产生孢子的细胞，称为小梗。着生小梗的细胞叫梗基，支持梗基的细胞称为富枝。小梗用断离法产生分生孢子，形成不分枝的链，分生孢子呈球形、椭圆形或短柱形，光滑或粗糙，大部分生长时呈蓝绿色，有时呈无色或呈别种淡色，但决不呈污黑色。少数种产生闭囊壳，或结构疏松柔软。较快地形成子囊和子囊孢子，或质地坚硬如菌核状由中央向外缓慢地成熟。还有少数菌种产生菌核。 3、镰刀菌属 镰刀菌属主要的产毒霉菌包括禾谷镰刀菌、串珠镰刀菌、雪腐镰刀菌、三线镰刀菌、梨孢镰刀菌、拟枝孢镰刀菌、尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌和木贼镰刀菌等。这些霉菌产生的毒素为单端孢霉烯族化合物、玉米赤霉烯酮和丁烯酸内酯等。在马铃薯一葡萄糖琼脂或察氏培养基上气生菌丝发达，高0.5—1.0cm，或较低为0.3—0.5cm，或更低为0.1—0.2cm稀疏的气生菌丝，甚至完全无气生菌丝而由基质菌丝直接生出黏孢层，内含大量的分生孢子。镰刀菌属的菌可产生大、小两种分生孢子。大分生孢子形态多样，如镰刀形、线形、纺锤形、披针形、柱形、腊肠形、蠕虫形、弯曲、直或近于直型等。顶端细胞呈多种形态，如短喙形、链形、钩形、线形等，大分生孢子产生在菌丝的短小爪状突起上或产生在分生孢子座上，或产生在黏孢层中。大多数镰刀菌的小分生孢子通常假头状着生，较少为链状着生，或者假头状和链状着生兼有；小分生孢子生于分枝或不分枝的分生孢子梗上，形状多样，如卵形、椭 圆形、梨形、纺锤形、披针形、腊肠形、柱形、锥形、圆形等，通常小分生孢子的量较大分生孢子为多。气生菌丝、子座、黏孢团、菌核可呈各种颜色，基质亦可被染成各种颜色。有的种会产生厚垣孢子，顶生、单生、或多个成串、或成结节状，无色或具有各种颜色，光滑或粗糙。 真菌的培养方法 录入时间:2008-11-21 14:19:06 来源：青岛海博生物 真菌营养要求不高，需氧，生长繁殖最适pH接近中性，最佳温度为25—30℃，但某些深部真菌为37℃，与人体温度相同。由于真菌繁殖一代的时间较长，因而培养时间也较久，应防止培养基干燥，或尽可能用试管。临床上常用沙保弱培养基。长出的菌落分为：酵母型菌落、类酵母型菌落和丝状菌落三种。酵母型菌落呈奶油色，硬度与细菌的菌落相似；镜检可见圆形或卵圆形壁薄真菌细胞，以发芽方式繁殖，幼芽成熟则脱离母细胞，这种孢子称为芽生孢子。类酵母菌落表面与酵母菌落相似，也呈奶白色或黄色，但有深入培养基的假菌丝。所谓的假菌丝，即培养基内菌细胞发芽，但芽不从母细胞脱离，而延长发育，继续发芽，细胞相连接形成分枝呈网状。丝状菌落由菌丝（气中菌丝、营养菌丝）组成，外观上可呈棉絮样、毛样、粉状、颗粒状，又因真菌孢子具有各种颜色，所 以通常称为“霉菌 ”。有不少属的真菌，可根据不同生活环境、不同的培养温度，生成不相同的菌落，镜下所见也不相同，这类真菌称为双相性真菌。真菌的菌落在真菌鉴定上是很重要的。一般菌丝体每30—40min就能产生一个新的菌丝，一旦被污染，蔓延速度很快。而培养基因菌落产生的水溶性色素而变成相应颜色，这对于鉴定真菌的种属都有重要意义。 真菌的培养方法——斜面培养 录入时间:2008-11-21 14:20:05 来源：青岛海博生物 真菌的分离培养的目的是进行致病性真菌的菌种鉴定，帮助诊断。常用的方法有斜面培养法、玻片培养和平板培养法三种。 斜面培养又称大培养。 1、材料 沙保罗培养基、待检标本、75%酒精、接种针、温箱等。 2、方法 ①待检标本（如皮屑、甲屑或断发 ）用75%酒精浸泡数分钟以杀死表面细菌，然后用灭菌生理盐水充分洗涤。 ②按无菌操作法用接种针将标本接种在含青霉素、链霉素的沙保弱斜面培养基上。 ③试管口用硫酸纸包好扎紧棉塞口，放置22℃温箱培养。 ④第1周观察2次，第2周隔日观察一次，3周内不长出菌落，再重复做一次，若仍无菌落生长，可阴性。 3、结果 菌落观察时，要注意菌落形态、颜色、有无气中菌丝和营养菌丝，挑取菌丝置玻片上镜检。 真菌的培养方法——玻片培养 录入时间:2008-11-21 14:20:57 来源：青岛海博生物 玻片培养又称小培养，小培养法可以随时观察真菌的生长形态（如大分生孢子、小分生孢子及孢子柄等），还可以随时观察其生长发育的全部情况，有利于菌种的鉴定。 1、钢环法 （1）材料：白假丝酵母菌、沙保弱培养基、无菌玻片、盖玻片、钢环（带有缺 口）、石蜡。 （2）方法 ①用无菌镊子取无菌小培养钢环，环的两面分别蘸取熔化的固体石蜡，平置于无菌载玻片上，另取一无菌盖玻片，在酒精灯火焰上加热后覆盖于钢环上，待冷后，小培养钢圈即被固定于载玻片与盖玻片之间。 ②用毛细滴管吸取融化的培养基，从钢环上端孔注入，注入量占容积的1/2即可。 ③培养基冷却凝固后，用接种针挑取材料，由上端孔接种于环内培养基上。 ④置湿盒内，室温或37℃下培养2—3d后，逐日观察，镜下可连续看到真菌生长过程及菌丝、孢子等特征，一般7d左右即可长好。 ⑤也可不用小培养钢环，直接将融化的培养基滴于无菌玻片上，待冷凝后从周边接种材料，用盖玻片覆盖后培养，在显微镜下连续观察生长情况。 （3）结果：镜下观察可见到有胞壁增厚的厚膜孢子及假菌丝。 2、小块琼脂玻片培养法 用无菌操作法将制好的待用琼脂平板用无菌接种针或接种环切成大约1cm2的方块，将其放置于灭菌的载玻片上。将标本或待检菌接种于琼脂块四周边缘靠上方部位，然后用无菌镊子取一无菌的盖玻片盖在琼脂上。在无菌平皿内放入少量无菌水和一个无菌U形（或V形）玻璃棒。将此载玻片置于玻璃棒上，盖上平皿盖培养。每日用肉眼和显微镜观察孢子和菌丝的特点。 真菌的培养方法——平板培养法 录入时间:2008-11-21 14:21:41 来源：青岛海博生物 平板法培养霉菌与分离细菌的方法不同，一般采用点植法即选择合适的琼脂平板，左手拿起平板底，使培养基朝下，右手持接种针，蘸取少量孢子点种在培养基中心点或成三角形的三分点，然后盖上平皿盖，始终保持平板底朝上，放于孵箱中培养，这种方法可避免霉菌孢子散落在培养基上，使菌落生长一个或三个扇形的典型菌落，便于观察。 酵母菌直接镜检计数法 录入时间:2008-11-21 14:23:10 来源：青岛海博生物 适用于由酵母菌引起变质的食品。方法是利用血细胞计数板，取一滴美蓝染色液，从计数板盖片一侧滴入计数池，计数5个中格中的酵母细胞数，着色的细胞为死细胞，不着色的细胞为活酵母细胞，可分别计数，按下面公式计算： 酵母数（个/ml）=5个中格（80个小格）内酵母数 *稀释倍数*10（6）/2 白假丝酵母菌的鉴定 录入时间:2008-11-21 14:24:32 来源：青岛海博生物 1、材料 （1）标本鳞屑、渗出物或痰液。 （2）试剂沙保罗培养基、1%吐温80玉米淀粉培养基、血清。 2、方法 （1）标本采集：一般从病损表面采用棉拭子进行刮屑、采取渗出物或痰液等。 （2）显微镜检查：用痰、渗出物作涂片进行革兰染色；如为皮屑或甲屑置于玻片上。先滴加10%KOH溶液消化后镜检。镜检可见革兰阳性、卵圆形酵母菌及芽生孢子和假菌丝。 （3）培养：将标本接种于沙保罗培养基，25℃经3—4d培养，在培养基表面形成乳白色（偶见淡黄色）酵母样菌落，镜检可见假菌丝以及成群的芽生孢子。 3、结果 假丝酵母种类较多，一般可根据形态和培养特征进行鉴别，但常用下列方法检查。 （1）厚膜孢子形成试验：将培养物接种在含1%吐温80玉米淀粉培养基中，经25℃24—48h后可查见有厚膜孢子形成。如果培养温度超过37℃，则不能形成厚膜孢子，厚膜孢子的形成有助于鉴定 白假丝酵母菌。 （2）芽管形成试验将培养物接种于事先预热温度为37℃的血清 中，菌量要多一些。血清量大约0.5—1.0ml，37℃下1.5—4h内即可查见有芽管形成。 （3）糖同化或发酵试验：白假丝酵母菌的鉴定可用糖发酵及同化试验。 （4）血清学检查用白假丝酵母菌高价诊断血清进行夹心ELISA法、免疫酶斑点法等方法鉴定。 隐球菌的鉴定 录入时间:2008-11-21 14:25:17 来源：青岛海博生物 1、材料 （1）标本：脑脊液、痰、脓、尿、活体组织及人体解剖材料等。 （2）试剂：墨汁、沙氏固体培养基、小白鼠。 2、方法 （1）标本采集：采集脑脊液、痰、脓、尿、活体组织及人体解剖材料等。 （2）直接检查：将样品经墨汁染色后镜检，查看有无圆形或卵圆形的芽生孢子，孢子外面有一肥厚的荚膜，荚膜比菌体可大1—3倍。出芽可为单芽，也可为多芽，孢子内可见有一个较大反光颗粒（脂质颗粒）和许多小颗粒。 （3）培养检查：将样品接种在沙氏固体培养基上，置25—37℃培养均可生长，24—48h形成酵母样菌落，少数菌株生长缓慢，至少要培养2—3周才能形成菌落，菌落呈