瘦素在着床前小鼠胚胎中的表达及其对胚胎发育的影响

论著 文章编号 : 100025404 (2008) 1421316203 瘦素在着床前小鼠胚胎中的表达及其对胚胎发育的影响 高立芳 ,赵邦霞 ,谭冬梅 ,何明忠 ,谭 　毅 　　(重庆医科大学实验动物中心 ,重庆 400016) 　　摘 　要 : 目的 　探讨瘦素 ( lep tin)在围着床期小鼠胚胎中的表达规律和分布情况以及 lep tin抗体对小鼠胚胎体外发 育的影响。方法 　雌性 N IH小鼠超排后与雄鼠交配 ,分别在妊娠 1～4 d上午从输卵管或子宫角冲取相应时期的胚胎 ,用 于以下实验 : ①分别提取总 RNA,检测胚胎中 lep tin mRNA表达情况。②采用免疫荧光技术 ,观察 lep tin蛋白在囊胚的表 达和分布情况。③将 82细胞小鼠胚胎培养于含不同浓度 lep tin抗体的培养液中 ,观察囊胚形成及脱透明带的情况。结果 lep tin mRNA仅在囊胚期特异性表达 ,其余各时期胚胎未见表达 ; lep tin蛋白在囊胚的滋养层细胞和内细胞团的细胞质和 细胞膜呈阳性表达 ,而在细胞核无表达。一定浓度的 lep tin抗体可明显降低囊胚的形成率 ( 1∶400, P < 0105) 和脱带率 (1∶1 600, P < 0105) ,且随着抗体浓度的增加 ,这种抑制作用更明显。结论 　lep tin能促进着床前胚胎发育 ,同时也可能参 与了胚胎着床过程。 　　关键词 : 瘦素 ;胚胎发育 ;免疫荧光 　　中图法分类号 : Q95 - 33; Q954. 4 文献标识码 : A L eptin expression in m ouse pre2im plan ta tion em bryos and its effect on em bryo developm en t in vitro GAO L i2fang, ZHAO Bang2xia, TAN Dong2mei, HE M ing2zhong, TAN Yi (Laboratory Animal Center, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China) 　　Abstract: O b jec tive　To investigate the exp ression and distribution of lep tin in p re2imp lantation embryo, and its effect on mouse embryo development in vitro. M e tho d s　Adult N IH female m ice were superovulated and then mated with fertile males of the same strain. On the morning of 1 st to 4 th d of p regnancy, the oviduct and horn of uterus were dissected out and flushed with DMEM /F12 medium adequately. The embryos collected were subjected to the following p rocedures: ①Total RNA was isolated from embryos of each stage respectively and mRNA exp ression of lep tin was detected by RT2PCR. ② Immunofluorescence staining was performed on blastocysts to analyze the exp ression and the distribution of lep tin p rotein under laser confocal m icroscope. ③Eight2cell embryos were cultured in medium containing lep tin antibody at various concentrations to observe the formation and hatching of blastocysts. R e su lts　①Lep tin mRNA exp ression was only detected in blasto2 cyst, and no exp ression was detected in embryos in other stages. Lep tin p rotein was detected in cytop lasma, membrane of trophoblastic cell and inner cell mass, however no exp ression was detected in cell nucleus. ②Lep tin polyclonal antibody significantly inhibited formation of blastocysts (1∶400, P < 0. 05) and p revented hatching of blastocysts from zona pellucida (1∶1 600, P < 0. 05) in a dose2dependent manner. Co nc lu s io n　 The temporal exp ression of lep tin suggests that lep tin m ight p lay an important role during embryo development and imp lantation p rocess in m ice. 　　Key words: lep tin; embryo development; RT2PCR; immunofluorescence 　　基金项目 :国家自然科学基金 (30470654) Supported by the National Natural Science Foundation of China (30470654) 　　作者简介 :高立芳 ,女 ,重庆市垫江县人 ,硕士 ,研究实习员 ,主要从事胚胎工程方面的研究 ,现在重庆市畜牧科学研究院草食牲畜研究所。E2mail: glf13@163. com 　　通信作者 :谭 　毅 ,电话 : (023) 68485997, E2mail: tanyee66@hotmail. com 　　收稿日期 : 2007207202;修回日期 : 2008202229 6131 第 30卷第 14期 2008年 7月 　 　 第 　三 　军 　医 　大 　学 　学 　报 ACTA　ACADEM IAE　MED IC INAE　M IL ITAR IS　TERTIAE　 　 Vol. 30, No. 14 Jul. 2008 © 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 第 14期 　 高立芳 ,等. 瘦素在着床前小鼠胚胎中的表达及其对胚胎发育的影响 　 　　瘦素 ( lep tin)是肥胖基因 (obese gene, ob)的编码 产物 ,主要由脂肪组织分泌 ,参与调节食物摄入和能量 平衡 ,近年来研究表明 ,其也可以作为一种代谢信号对 下 丘 脑 2垂 体 2性 腺 ( hypothalam ic2p ituitary2gonadal, HPG)轴发挥重要的生理调控作用 ,从而影响生殖功 能 [ 1 ]。 　　本研究拟应用分子生物学技术 ,检测瘦素 mRNA 和蛋白在着床前小鼠胚胎中的表达情况和分布情况 , 探讨瘦素对小鼠胚胎发育和着床过程的影响 ,从而为 瘦素基因对小鼠胚胎的影响补充新的理论依据。 1　材料与方法 1. 1　材料 1. 1. 1　实验动物 　　N IH小鼠 7～8周龄 ,体质量 20～25 g,雌 雄各半 ,购自重庆医科大学实验动物中心。 1. 1. 2　主要试剂 　　RNA抽提试剂盒购自上海华舜生物工程 有限公司 ; RT2PCR试剂盒和琼脂糖购自 TaKaRa公司 ;小鼠瘦 素以及β2actin引物由 TaKaRa公司合成 ;兔抗鼠 ob多克隆抗 体购自美国 Santa Cruz公司 ; Tyrode’s购自美国 Sigma公司 ; Hoechst33342购自美国 Invitrogen公司 ;罗丹明标记山羊抗兔 IgG(H +L) 由北京中山分装。 1. 2　方法 1. 2. 1　超排卵 　　将成熟雌性 N IH小鼠超排卵 ,与雄鼠于下 午 17: 00按 1∶1比例合笼 ,次晨发现阴栓者记为妊娠 1 d孕鼠。 1. 2. 2　胚胎收集及总 RNA提取 　　分别在妊娠 1～4 d上午 脱臼处死小鼠 ,取其输卵管或子宫角 ,冲取相应时期的胚胎 ,收 集于含 RNA裂解液的 EP管 (事先用 DEPC处理 )中 ,按照试剂 盒说明书提取总 RNA,保存于 - 80 ℃备用。 1. 2. 3　RT2PCR反应 　　将提取的各时期胚胎总 RNA用紫外 分光光度计测定 RNA的 D (260) /D (280)比值 ,取部分 RNA进 行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳 ,证实 RNA的完整性。将完整的 RNA先进行逆转录 ,然后用设计的瘦素引物进行 cDNA片段扩 增 , 上 游 : 5′2TTCACACACGCAGTCGGTAT23′, 下 游 : 5′2CT2 CAAAGCCACCACCTCTGT23′,扩增产物大小为 309 bp。选择 β2actin作为内对照 ,其上游和下游引物序列分别为 : 5′2AGCC2 ATGTACGTAGCCATCC23′和 5′2CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA2 3′,扩增产物大小为 228 bp。RT2PCR操作参考一步法 ( TaKaRa 公司的说明书 )进行 ,将 mRNA 逆转录为 cDNA,再将所得的 cDNA进行 PCR扩增。其循环条件 : 94 ℃变性 30 s, 58 ℃退火 30 s, 74 ℃延伸 60 s,进行 38个循环。 1. 2. 4　电泳 　　分别取瘦素的 PCR扩增产物 9μl加 10 ×上 样缓冲液 1μl,β2actin的扩增产物 4. 5μl加 10 ×上样缓冲液 0. 5μl,在 2%琼脂糖凝胶上进行电泳 ,然后用凝胶成像系统成 像。 1. 2. 5　囊胚的免疫荧光 　　参照文献 [ 2 - 5 ]的方法 ,结合本 实验室的具体条件作一些改进 ,具体步骤如下 :妊娠 4 d上午从 子宫中冲取囊胚 , 1% PBS/BSA彻底冲洗 ,然后用 Tyrode’s液脱 去透明带 ,中性 PBS冲洗 , 4 ℃条件下在 4%多聚甲醛固定 1 h, 011% PBS/Tween20室温渗透 30 m in, 10%正常绵羊血清室温 下封闭 30 m in,然后加兔抗鼠 ob多克隆抗体 (1∶100)孵育 , 4 ℃ 过夜。次日先用 PBS冲洗 ,然后加罗丹明标记山羊抗兔 IgG (1∶100) , 4 ℃避光孵育 1 h, PBS冲洗 , Hoechst33342 ( 10μg/ m l)室温进行核染 15～20 m in, PBS冲洗 ,滴加甘油 2PBS (等体 积混合 )封片 ,在荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察 ,拍 照。 1. 2. 6　胚胎体外培养 　　采用微滴培养法 ,用 DMEM /Ham’s F12 + 10%胎牛血清的培养液将 ob多克隆抗体按 1 ∶200、 1∶400、1∶800和 1∶1 600稀释 ,以不加抗体的培养液作为对照 , 将各组培养液分别吸取 50μl加入 96孔培养板的不同孔中 ,每 孔培养液上加入 30μl灭菌液体石蜡覆盖 ,放入 37 ℃, 5% CO2 培养箱中平衡 2 h。将形态良好的 8细胞胚胎移入平衡好的各 组培养液中 (10～15枚 /孔 ) ,放入 CO2培养箱中 ,间隔 12 h观 察 1次 ,记录囊胚形成数及脱带数 ,每个剂量组重复 5次。 1. 3　统计学处理 　　各组囊胚形成率和脱带率的差异比较采用χ2检验 ,数据统 计均用 SPSS 11. 0统计软件完成。 2　结果 2. 1　瘦素 mRNA在小鼠囊胚的表达 　　分光光度法检测提取的总 RNA浓度 , D ( 260) /D (280) = 1. 8。RT2PCR结果见图 1所示 :瘦素 mRNA特异性地表达于小 鼠囊胚期 ,而在 22细胞、42细胞、82细胞、桑椹胚则呈阴性表达。 1: 22细胞胚胎 ; 2: 42细胞胚胎 ; 3: 82细胞胚胎 ; 4: 桑椹胚 ; 5: 囊胚 图 1　小鼠胚胎中瘦素 m RNA表达的 RT2PCR结果 2. 2　瘦素蛋白在小鼠囊胚的表达 　　激光共聚焦结果显示 ,小鼠囊胚中有瘦素蛋白表达 ,阳性 表达定位于滋养层细胞和内细胞团细胞的细胞质和细胞膜 ,而 细胞核中则呈阴性表达 (图 2)。 2. 3　ob多克隆抗体对小鼠胚胎体外培养的影响 　　不同浓度 ob抗体组 ,囊胚形成率和脱带率均有显著性差 异 ( P < 0101)。由表 1可见 ,培养液中 ob抗体浓度为 1∶1 600 和 1∶800时 ,囊胚的形成不受影响 ( P > 0. 05)。ob抗体浓度在 1∶400和 1∶200时 ,囊胚形成率明显降低 ( P < 0105) ,且抗体浓 度增加 ,这种抑制作用越明显。ob抗体浓度 ≥1∶1 600时 ,对囊 胚的脱带有显著抑制作用 ( P < 0105) ,且随着抗体浓度的增加 , 对囊胚的脱带的抑制作用更明显。 7131　　 © 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net A: 光学显微镜下成像 ; B: F ITC标记 , 543 nm荧光激发成像 ,滋养 层细胞和内细胞团细胞阳性 ; C: Hoechst33342核染 , 352 nm荧光激 发成像 ; D:激光共聚焦镜下图 B和图 C拼合图 图 2　瘦素在小鼠囊胚的免疫荧光结果 ( ×200) 表 1　不同浓度 ob多克隆抗体对 82细胞胚胎发育的影响 Ob抗体浓度 培养胚胎数 囊胚形成数 ( % ) 囊胚脱带数 ( % ) 0 (对照 ) 86 82 (95. 35) 80 (93. 02) 1∶1 600 86 85 (98. 84) 60 (69. 77) a 1∶800 79 78 (98. 73) 43 (54. 43) a 1∶400 99 64 (64. 65) a 20 (20. 20) a 1∶200 82 18 (21. 95) a 2 (2. 44) a a: P < 0. 05,与对照组比较 3　讨论 　　自从发现瘦素可以影响哺乳动物生殖系统以来 , 瘦素对胚胎发育以及着床过程的作用备受学者的关 注。陈骞等 [ 6 ]在胚胎培养液中添加不同剂量的瘦素 进行体外培养小鼠 22细胞胚胎 ,观察其发育情况 ,然 后进行胚胎移植观察着床率时发现 ,瘦素能提高 22细 胞胚胎体外发育的质量、发育率和胚胎着床率。 Kawamura等 [ 7 ]也发现瘦素能促使胚胎从 22细胞期发 育至囊胚 ,并能提高囊胚的孵出率 ,且具有剂量依赖 性。Craig等 [ 3 ]在培养猪早期胚胎时发现 ,在培养液中 添加 10 ng/m l的瘦素 ,结果很大程度上提高了胚胎的 卵裂率 ( P < 0101) ;在体外培养 7 d后 ,在培养液中添 加 10 ng /m l和 100 ng/m l的瘦素均能提高囊胚率 ( P < 0101)。文献 [ 7 ]报道 ,将胚胎培养在含瘦素和瘦素 受体抗体的培养液中 ,囊胚形成和孵出很大程度上被 抑制 ,表明瘦素受体抗体在着床前胚胎发育中能封闭 其自分泌机制。本实验显示 ,一定浓度的瘦素多克隆 抗体可体外抑制囊胚的形成和脱透明带 ,且随着抗体 浓度的增加 ,种抑制作用更为明显。这表明瘦素蛋白 有促进早期胚胎发育及促使囊胚脱透明带的作用。同 时 ,妊娠 1～4 d的小鼠子宫内膜表达瘦素蛋白 [ 8 ]。因 此我们推测在小鼠胚胎着床前 ,子宫内膜细胞和胚胎 表达的瘦素蛋白可能通过自分泌或旁分泌形式调节着 床前胚胎的发育 ,能提高胚胎发育率 ,保证成功着床。 　　本研究采用 RT2PCR方法测得瘦素 mRNA仅在小 鼠囊胚期特异性表达 ,与其他研究结论 [ 7, 9 ]一致 ;免疫 荧光方法测定囊胚的瘦素蛋白 ,然后在激光共聚焦显 微镜下扫描的结果显示 ,瘦素蛋白主要表达于扩展囊 胚的滋养层细胞和内细胞团的细胞质和细胞膜 ,而胞 核则呈阴性。这表明瘦素可能参与滋养层细胞和内细 胞团的生长发育 ,为滋养层细胞接触、黏附、侵袭子宫 内膜作准备 ,从而保证胚胎着床成功。 　　由于本研究检测到瘦素基因 mRNA仅在小鼠囊 胚期特异性表达 ,从而再检测了瘦素蛋白在囊胚的表 达情况 ,那么瘦素蛋白是否在受精卵、22细胞、42细胞、 82细胞、桑椹胚上也有表达 ,还需更多实验去验证 ,从 而完善对瘦素基因在着床前胚胎发育中作用的认识。 参考文献 : [ 1 ] Moschos S, Chan J L, Mantzoros C S. 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