输精管结扎术后附睾精子超微结构的变化

·论著· 输精管结扎术后附睾精子超微结构的变化 文任乾 　刘美意 　叶嘉玲 　陈巧儿 　姚晓涛 　唐立新 　　基金项目 :国家人口和计划生育委员会部委级重大项目 ( 96066) ,广东省科学技术厅重大项目 (粤科函财字 [ 2001 ]66号 ) ,广东省人口和计划生育委员会 (2000208) 作者单位 : 510600广州 ,广东省计划生育科学技术研究所 通信作者 :文任乾 , Email: wenrq@ tom. com 【摘要 】　目的 　输精管结扎术后附睾精子超微结构的变化。　方法 　38例输精管吻合术 者分 3组 (B组 :结扎后 < 2年 , C组 :结扎后 2～5年 , D组 :结扎后 > 5年 ) , 13例输精管结扎为对照组 (A组 )。在手术时取出近睪端输精管液和附睾液 ,光镜和电镜对精子形态学进行观察分析。　结果 　A组左右侧附睾精子正常形态的差异无统计学意义 ( P > 0. 05)。电镜和光镜观察结果显示 : A组 与输精管结扎术后 3组的精子正常形态 ( a)、头部畸形 ( b)、颈部畸形 ( c)和尾部畸形 ( d)差异均有统 计学意义 (均 P < 0. 001) ,扫描电镜分别是 : ( a) : ( 40. 28 ±11. 53) %比 ( 16. 80 ±7. 93) % , ( 6. 29 ± 4. 57) % , (4. 63 ±5. 06) % ; ( b) : ( 35. 00 ±14. 18 ) %比 ( 59. 05 ±14. 44 ) % , ( 63. 43 ±15. 23 ) % , (82. 05 ±16. 71) % ; ( c) : (20. 83 ±6. 40) %比 (13. 60 ±6. 78) % , (14. 71 ±6. 82) % , (9. 00 ±7. 18) % ; ( d) : (3. 89 ±4. 44) %比 (10. 55 ±11. 73) % , (15. 57 ±9. 81) % , (4. 32 ±7. 65) %。光镜分别是 : ( a) : (49. 12 ±20. 55) %比 ( 19. 95 ±15. 42 ) % , ( 10. 00 ±9. 50 ) % , ( 5. 84 ±9. 63 ) % ; ( b ) : ( 35. 00 ± 14. 55) %比 (22. 55 ±16. 24) % , ( 14. 71 ±15. 78) % , ( 10. 68 ±18. 65) % ; ( d) : ( 15. 80 ±9. 55) %比 (57. 50 ±24. 74) % , (75. 29 ±23. 90) % , (78. 21 ±30. 33) %。透射电镜可见精子头、颈、尾等各个部 位各种细胞器均有结构异常。　结论 　输精管结扎术后附睾精子的退变是全方位的 ,包括头、颈、尾 部和多个细胞器的异常。输精管结扎术后时间越长 ,异常情况越严重 ,比例更高。 【关键词 】　输精管结扎术 ; 　附睾 ; 　精子 ; 　超微结构 Ultra structure of human ep id idyma l sperma tozoa after va sectom y　W EN R en2qian, L IU M ei2y i, YE J ia2 ling, CHEN Q iao2er, YAO X iao2tao, TANG L i2xin. Fam ily Plann ing Research Institu te of Guangdong, Guang2 zhou 510600, China Correspond ing author:W EN Ren2qian, Em ail: w enrq@ tom. com 【Abstract】　O bjective　To investigate the ep ididymal sperm ultrastructure after vasectomy. 　M eth2 ods　During the operation of vasovasostomy (38 cases, test group) and vasectomy (13 cases, control group, group A) the p roximal vas deferens fluids were collected. The ep ididymal sperm morphology in the p roximal vas deferens fluids was observed using op tical and electronic m icroscopes. Data were analyzed by SPSS p ro2 gram. 　Results　The data from group A showed that there was no significant difference between left and right side in the percentage of normal sperm morphology. The results from both op tical and electronic m icro2 scopes showed that there was a significant difference in the percentage of normal sperm morphology ( a) , ab2 normal sperm head ( b) , sperm with neck defect ( c) and sperm with tail defect ( d) between group A and group B ( < 2 years after vasectomy) , group C (2 - 5 years after vasectomy) , group D ( > 5 years after vas2 ectomy). ( electronic m icroscopes: ( a) : ( 40. 28 ±11. 53) % vs ( 16. 80 ±7. 93 ) % , ( 6. 29 ±4. 57 ) % , (4. 63 ±5. 06) % ; ( b) : ( 35. 00 ±14. 18) % vs ( 59. 05 ±14. 44) % , ( 63. 43 ±15. 23 ) % , ( 82. 05 ± 16. 71) % ; ( c) : (20. 83 ±6. 40) % vs ( 13. 60 ±6. 78) % , ( 14. 71 ±6. 82) % , ( 9. 00 ±7. 18) % ; ( d) : (3. 89 ±4. 44) % vs (10. 55 ±11. 73) % , ( 15. 57 ±9. 81) % , ( 4. 32 ±7. 65) %. op tical m icroscopes: ( a) : (49. 12 ±20. 55) % vs (19. 95 ±15. 42) % , (10. 00 ±9. 50) % , (5. 84 ±9. 63) % ; ( b) : (35. 00 ± 14. 55) % vs (22. 55 ±16. 24) % , (14. 71 ±15. 78) % , (10. 68 ±18. 65) % ; ( d) : (15. 80 ±9. 55) % vs (57. 50 ±24. 74) % , (75. 29 ±23. 90) % , ( 78. 21 ±30. 33) %. There existed multi2cell organ and multi2 form abnormalities in the inner structures of sperm heads, necks and tails. 　Conclusion s　The ep ididymal ·021· 中华泌尿外科杂志 2006年 4月第 27卷增刊　Chin J U rol, Ap ril 2006, Vol 27, Supp l © 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net sperm defect ( including head, neck and tail) after vasectomy was demonstrated in the inner cell organs. The longer after vasectomy, the higher percentage of sperm with abnormality was found. 【Key words】　Vasectomy; 　Ep ididym is; 　Spermatozoa; 　U ltrastructure 　　研究发现 ,输精管结扎术后近睾端输精管中精 子密度增加 ,精子活动率减低 ,正常形态的精子减 少 ,小头精子、不定形精子和尾部畸形的精子增 加 [ 1, 2 ]。精管吻合术后妊娠率不高的原因之一是精 子形态学未能完全恢复 [ 3, 4 ]。附睾淤积症是输精管 结扎术的并发症 ,是影响输精管结扎术广泛应用的 因素之一 ,附睾淤积症的治疗也较为棘手。为进一 步了解输精管结扎术后附睾精子超微结构的变化 , 我们应用电子显微镜观察了输精管吻合术患者附睾 精子超微结构情况 ,现如下。 对象与方法 一、临床资料 输精管结扎术后 1～9年男性 38例 ,年龄 25～ 50岁。身体健康 ,职业均为农民 ,因各种原因并符 合计划生育政策要求做输精管吻合术。13例已生 育 2个以上孩子待输精管结扎术的男性 ,年龄 24～ 38岁 ,为对照组。 二、手术及取样 输精管吻合术在局部麻醉或硬外麻醉下进行 , 输精管结扎术在局部麻醉下进行。切开输精管时 , 在近睾端输精管中插入聚乙烯管 ,收集近睾端输精 管液体和附睾液体。对照组 (A组 )取材 18份 (左 侧 10份 ,右侧 8份 )。38例共取出附睾液标本 46 份 (左侧 26份 ,右侧 20份 ) ,按结扎术后不同时间 分为 3组 (B组 :结扎后 < 2年 , C组 :结扎后 2～5 年 , D组 :结扎后 > 5年 )。标本取出后立即悬浮与 Ham F10培养液中 , 37℃浴箱中保存。取部分涂片 作光镜常规精子形态学检查 ,余下精液洗涤离心 ,在 沉淀物中加 4%戊二醛固定 ,作电镜分析。 三、光学显微镜分析 根据 WHO精液分析方法 [ 5 ]进行常规精子 形态学分析。各组在改良巴氏染色后 , 油镜 ( ×100)计算 200条精子中正常精子形态和各类畸 型精子。 四、电镜分析 1. 电镜样本制作 :经 4%戊二醛固定后的样本 , 用 0. 2 mol/L磷酸缓冲液离心洗涤 3次 ,沉淀物中 加入 1%锇酸处理后 ,离心沉淀分成 2份 ,一份用 1%琼脂包埋 ,经 50% ～100%浓度梯度乙醇脱水 , 环氧丙烷渗透 ,过夜。Epon812包埋 ,切片 ,醋酸铀 和枸橼铅染色 ,透射电镜下观察并拍照。另一份用 乙醇 (50% ～80% )脱水后 ,经点样、干燥、喷金 ,用 于扫描电镜观察并拍照。 2. 扫描电镜 (JSM 225型 ,华南农业大学电镜室 ) 选择并固定在 2000倍数分析。随机在各视野计数 100条精子 ,正常精子 ,头部异常 (包括顶体缺 失或部分缺失、小头、大头 ) ,颈段异常 (包括颈膨 大 ,弯曲 )及尾部异常 (包括短尾、缺尾、尾膨大 ,卷 曲等 )等比例并拍照。 3. 透射电镜 ( PH IL IPS2EM400型 ,华南农业大学 电镜室 )检查 :以 A组的正常附睾精子为对照物 ,主 要观察输精管结扎术后各组标本精子膜的完整性 , 顶体完整性 ,核染色质连接段 ,中心粒 ,线粒体 ,轴 丝 ,致密纤维等超微结构的变化并拍照。 五、统计学方法 用 SPSS 10. 0版本统计软件 ,对各参数分别计 算均值和标准差 ,采用 t检验 (左侧和右侧比较 )、单 因素方差分析 (A组与 B、C、D组之间均值比较和组 间两两比较 )和 Pearson直线相关分析 (扫描电镜与 光镜检查结果相关分析 )。 结 　　果 一、扫描电镜与光镜检查结果 A组扫描电镜分析比较左侧和右侧正常形态 ( t = 0. 031)、头畸 ( t = 0. 624)、颈畸 ( t = 1. 339)和尾 畸 ( t = 0. 829) ,结果差异均无统计学意义 ( P值均 > 0. 05)。A组附睾液中的正常形态精子直线相关分 析结果显示 :扫描电镜检查结果与光镜检查结果呈 正相关 ( r = 0. 521, P < 0. 05)。采用单因素方差分 析和组间两两比较的方法 ,对扫描电镜和光镜检查 各类精子形态分析结果见 1, 2。扫描电镜 (正常 形态 F = 65. 792,头畸 F = 29. 827,颈畸 F = 9. 454, 尾畸 F = 4. 663, P值均 < 0. 001)和光镜 (正常形态 F = 27. 035,头畸 F = 6. 899,尾畸 F = 28. 180, P值 均 < 0. 001)中每个因素在各组间的差异均有统计 学意义。电镜检查结果组间两两比较能发现更多的 差异 (表 1)。多个视野中见较多的精子无尾、短尾 , 仅剩下多数的精子头为特征性改变 (图 1)。 ·121·中华泌尿外科杂志 2006年 4月第 27卷增刊　Chin J U rol, Ap ril 2006, Vol 27, Supp l © 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 表 1　正常附睾精子与输精管结扎术后附睾精子扫描电镜下精子形态的比较 ( €x ±s , % ) 分组 例数 精子形态 正常 头畸 颈畸 尾畸 A 18 　40. 28 ±11. 53△ 35. 00 ±14. 18△ 20. 83 ±6. 40△ 3. 89 ±4. 44△ B 20 16. 80 ±7. 93# 59. 05 ±14. 44# 13. 60 ±6. 783 10. 55 ±11. 73 C 7 6. 29 ±4. 57 63. 43 ±15. 23☆ 14. 71 ±6. 82☆ 15. 57 ±9. 81☆ D 19 4. 63 ±5. 06 82. 05 ±16. 71 9. 00 ±7. 18 4. 32 ±7. 65 　　　　　　△: A组与 B、C、D组比较 P < 0. 001, #: B组与 C组比较 P < 0. 05、B组与 D组比较 P < 0. 001, 3 : B组 　　　　　　与 D组比较 P < 0. 05, ☆: C组与 D组比较 P < 0. 05 表 2　正常附睾精子与输精管结扎术后附 睾精子光镜下精子形态比较 ( €x ±s , % ) 分组 例数 精子形态 正常 头畸 尾畸 A 18 49. 12 ±20. 55# 35. 00 ±14. 55# 15. 80 ±9. 55# B 20 19. 95 ±15. 423 22. 55 ±16. 24 57. 50 ±24. 743 C 7 10. 00 ±9. 50 14. 71 ±15. 78 75. 29 ±23. 90 D 19 5. 84 ±9. 6 10. 68 ±18. 65 78. 21 ±30. 33 　　#: A组与 B、C、D组比较 P < 0. 001, 3 : B组与 D组比较 P < 0. 05 图 1　输精管结扎术后 4年 ( C组 )附睾精子 ,大多数无尾 ,或 短尾 ,形成特殊图像 ( ×2000) 二、透射电镜观察结果 A组显示有较多比例的正常精子超微结构特 征 ,部分精子出现某些异常 ,如精子顶体膜部分破 裂。输精管结扎术后附睾精子发生各种变化 ,主要 精子头部变化 :顶体破裂、膜缺失或部分缺失、不规 则状 ,核不规则变形 ,有较多空泡沫形成等 (图 2)。 精子颈部变化 :颈部连接段和中心粒结构模糊不清 甚至消失 ,有头尾分离现象 ,不规则排列的线粒体结 构。尾部变化 :中央微管周围可呈不同状态缺失 ,形 成非 9 + 2等结构或其他不规则 ;线粒体排列紊乱、 分布不对称、线粒体鞘缺失 ;外周致密纤维不规则排 列、部分缺失或全部缺失 (图 3, 4)。输精管结扎术 后时间越长者 ,异常现象越严重 ,比例更高。 图 2　输精管结扎术后 4年 (C组 )的附睾精子 ,可见顶体膜消 失 ,核破碎和多个空泡形成 ( ×11 000) 图 3　输精管结扎术后 3年 (C组 )附睾精子 ,可见颈部节柱和 中心粒模糊不清 ,结构异常 ,头尾分离 ( ×3900) 图 4　输精管结扎术后 5年 (D组 )的附睾精子 ,尾部中央微管 不同程度的缺失 ,肿胀 ,形成 9 + 1结构 ( ×3900) ·221· 中华泌尿外科杂志 2006年 4月第 27卷增刊　Chin J U rol, Ap ril 2006, Vol 27, Supp l © 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 讨 　　论 本研究电镜结果发现 ,输精管结扎术后正常形 态精子比例均显著下降 , D组尤为明显 ,与光镜结果 一致 [ 1, 2 ]。提示输精管结扎术时间越长 ,淤积在附 睾内的精子中不正常的比例增多 ,虽然还可以看到 较少的正常形态精子 ,但整个视野的精子缺尾、断尾 畸形 ,所剩下的精子头也是形态不一 ,结构紊乱 ,在 扫描电镜标本中十分明显 ,与以往报道结果一 致 [ 2 ]。正常情况下 ,精子从附睾头至附睾尾需 30 d 时间 ,而输精管结扎术后需要时间更长。本研究取 材部位为近睾端输精管和附睾尾部的精子 ,在附睾 停留时间较长 ,最终被退化和吸收 ,因此 ,该部位正 常精子形态最少。有研究表明 :输精管结扎术 < 5 年与 > 5年比较 ,前者吻合后的精子再现率、精子 数、活动率、妊娠率等均高于后者 [ 6 ]。 本研究将各类精子头部异常归纳为一个指标 (头畸 ) ,光镜分析未发现结扎术后各组附睾精子头 部异常差异 ,且以高比例精子尾部畸形为主 (占 57% ～78% )。但电镜分析发现 :随结扎时间增加 , 精子头部异常比例逐步增加 ,同时 ,头部异常精子比 例高达 59% ～82%。按 WHO精液分析手册规定 , 精子形态学分析中如果同时存在多种畸形 ,只记录 其中一种 ,而且头部畸形先于中段畸形 ,中段畸形先 于尾部畸形 [ 5 ]。因此 ,在光镜分析时 ,精子头部的 微小改变很难发现 ,而尾部各类畸形较容易发现。 而电镜分析如果发现精子异常 ,首先记录的是头部 异常 ,很多光镜不能发现的异常在电镜中容易被发 现。光镜下输精管结扎术后附睾精子形态的特征 是 :以尾部异常、小头异常和不定型异常为主 ,多数 视野中可见缺尾的精子头 [ 2 ]。但电镜水平这一特 征不明显 ,显示精子头部异常为主 ,如头部顶体破 裂、缺失或部分缺失、不规则状 ;精子膜外翻、破裂 , 核浓缩体积变小等 ,但也可以看到颈部和尾部的畸 形。另外 ,颈部异常在光镜下较难判断 ,常规检查常 被误诊为小头畸形 [ 7 ] ,而本组电镜水平在正常人附 睾精子中可以发现高达 20%的颈部异常 ,在光镜中 可能将此类异常归入头部异常 ,因此 ,光镜结果以头 部异常为主。电镜下超微结构改变以整个精子的异 常改变 ,尤其是头部异常为主 ,包括精子膜、顶体、颈 段和尾部 ,以及各种细胞器的异常。因此电镜是一 种不同层次的检查 ,所显示的结果也十分重要 ,对男 性生殖生理学 ,输精管结扎术和精子生物学研究均 有帮助。 本研究结果显示 ,输精管结扎术后附睾精子超 微结构的异常是多方面的 ,包括有精子头部、尾部异 常 ,还有光镜较难发现的颈部的异常 ,但未发现输精 管结扎术后精子超微结构的特征表现 ,大多改变与 男性不育患者精子改变相同 [ 7, 8 ] ,主要表现有大头、 小头、不规则头精子增加 ,头部缺乏顶体、泡状顶体、 顶体膜破损等 ; 颈部有头尾分离现象 ,不规则排列 的线粒体结构 ;尾部 9 + 2结构消失或改变 ,线粒体 排列紊乱、分布不对称、线粒体鞘缺失等。这些改变 基本上是梗阻性无精子症的表现。但本研究结果提 供的输精管结扎术后附睾精子超微结构的信息 ,说 明输精管结扎术后附睾中精子的退变情况 ,尤其是 扫描电镜的分类结果可以为临床提供更多的参考 , 说明了输精管结扎术后附睾精子的退变是全方位 的 ,涉及头、颈、尾部和多个细胞器的异常。 (志谢 :华南农业大学电镜室对此研究给予许多帮助。世界卫 生组织提供了实验试剂。) 参 　考 　文 　献 1　W en RQ, L i SQ, W ang CX, et al. Analysis of spermatozoa from the p roximal vas deferens of vasectom ized men. Int J Androl, 1994, 17: 352 39. 2　W en RQ, L i SQ,W ang CX, et al. Morphological changes of spermato2 zoa in p roximal vas deferens after vasectomy. A sian J Androl, 1999, 1: 61265. 3　Shrepferman CG, Carson MR, Sparks AE, et al. Need for sperm re2 trieval and cryop reservation at vasectomy reversal, J U rol, 2001, 166: 178721789. 4　文任乾 ,刘美意 ,黄建初 ,等. 影响输精管吻合后生育力恢复相关 因素的初探. 中国男科学杂志 , 2003, 17: 1842187. 5　World Health O rganization. Laboratory manual for the exam ination of human semen and sperm cervical mucus interaction. 4 rd ed. Cam2 bridge University Press, 1999. 6　Yamamoto M, hibi H, Yokoi K, et al. Surgical outcome of m icroscop ic vasectomy reversal: an analysis of 30 cases. Nagoya J Med Sci, 1997, 60: 37242. 7　哈英娣 ,钱震 ,张晓忠. 男性不孕患者精子超微机构观察. 电子显 微学报 , 1998, 17: 4052406. 8　金杰 , 薛兆英 ,郭应禄 ,等. 不育症患者精子超微结构的研究——— 精子头尾分离. 中华泌尿外科杂志 , 1997, 18: 48250. (收稿日期 : 2005205207) (本文编辑 :孙忠民 ) ·321·中华泌尿外科杂志 2006年 4月第 27卷增刊　Chin J U rol, Ap ril 2006, Vol 27, Supp l © 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net