小鼠无精子症动物模型的构建

第 13卷 　第 2期 中华男科学杂志 Vol. 13　No. 2 2007年 2月 National Journal of Andrology Feb. 2007 ·论 著 · 小鼠无精子症动物模型的构建 黄勋彬 , 李红钢 (华中科技大学同济医学院生殖医学中心 , 湖北 武汉 430030) 摘要 : 　目的 : 建立一种稳定的小鼠无精子症动物模型。　方法 : 60只清洁级 C5BL /6小鼠 ,分为化疗组 (1次性腹 腔注射白消安 10 mg/kg体重、环磷酰胺 120 mg/kg体重 )、激素组 (每日皮下注射苯甲酸雌二醇 40 mg/kg,连续注射 15 d) ,每组 30只。注射后 4、12、20周 ,观察小鼠睾丸生精小管结构的变化以及终止干预后生精功能恢复的情况。 结果 : 化疗组化疗后第 4周 ,睾丸生精小管内精子及精子细胞消失 , 20周时仍保持无生精状态 ;激素组连续注射苯 甲酸雌二醇后第 4周 ,生精小管内精子及精子细胞消失 ,但 20周时部分生精小管内可以找到精子细胞和精子。化 疗组小鼠睾丸重量明显低于激素组 ( P < 0. 05)。　结论 : 经过化疗处理的小鼠无精子症模型稳定 ,雌二醇皮下注 射的无精子症模型形成慢而不稳定。相对于雌激素注射方法 ,化疗是构建小鼠无精子症动物模型比较可靠的方法。 关键词 : 无精子症 ; 化疗 ; 动物模型 ; 雌激素 ; 小鼠 中图分类号 : R2332; Q343. 3 + 4　　文献标识码 : A　　文章编号 : 100923591 (2007) 0220147203① Establishm en t of an An ima lM odel of Azoosperm ia in M a le M ice HUANG Xun2bin, L I Hong2gang Center for R eproductive M edicine, Tong jiM ed ica l College, Huazhong U niversity of Science and Technology, W uhan, Hubei 430030, Ch ina Correspondence to: HUAN G Xun2bin, E2m ail: huangxb@m ails. tjm u. edu. cn Abstract:　O bjec tive: To establish a stable animal model of azoosperm ia in male m ice. 　M ethods: Two group s of m ice, with 30 in each, were intervened respectively by chemotherapy ( intraperitoneal injection of Busulfan and Cyclophospham ide) and subcutaneous injection of Estradiol. A t different times after the injection, the m icroscop ic structures of the sem iniferous tubules of both group s were observed and compared. The recovery of the germ cells in the sem iniferous tubules was also evaluated after the term ination of the inter2 vention. 　R esu lts: A stable animalmodelwas established by chemotherapeutic method with Busulfan and cyclophospham ide, while the model constructed by muscle injection of Estradiol was not stable. 　Conclus ion: Compared with estrogen injection, chemotherapeutic intervention is a reliable method for constructing an animalmodel of azoosperm ia in male m ice. 　N a tl J A ndrol, 2007, 13 (2) : 1472149 Key words: azoosperm ia; chemotherapy; animal model; estrogen 　　近年来 ,有关细胞替代疗法治疗无精子症的报 道越来越多 ,比如生精干细胞移植等 [ 1, 2 ]。随着针对 无精子症的细胞替代疗法研究的发展 ,人们需要获 得稳定的无精子症动物模型用于实验。目前主要有 两大类小鼠无精子症动物模型 ,即 :化疗方法构建的 小鼠无精子症模型和转基因无精子症动物模型 [ 3 ]。 前者的构建虽然比较简单和价廉 ,但稳定性值得推敲 ; 而后者构建难度较大 ,价格昂贵。本实验希望通过白消 安和环磷酰胺腹腔注射的化疗方法以及皮下注射苯甲 酸雌二醇的激素干预方法来构建小鼠无精子症动物模 型 ,并比较两种方法的优劣。 1　材料与方法 1. 1　动物 　清洁型 C57BL /6小鼠 (华中科技大学 ·741· ① 收稿日期 : 2006208210; 修回日期 : 2006211208 作者简介 : 黄勋彬 (19632) ,男 ,湖北武汉市人 ,副教授 ,博士 ,从事生殖医学和男科学专业。 通讯作者 : 黄勋彬 , E2mail: huangxb@mails. tjmu. edu. cn 同济医学院实验动物中心 )共 60只 ,鼠龄 6～8周 , 体重 24～28 g,分为化疗组和激素组 ,每组 30只。 根据用药后处死时间 ,每组再分为 4、12、20周组。 1. 2　试剂 　化疗组采用白消安 ( Sigma)和环磷酰 胺粉针剂 (上海华联制药有限公司 ) , 0. 9%生理盐水 稀释 ,分别按 10 mg/kg和 120 mg/kg腹腔注射。激 素组采用苯甲酸雌二醇注射液 (2 mg/m l, 上海第九 制药厂 ) ,按 4. 0 mg/kg体重皮下注射。 1. 3　方法 1. 3. 1　化疗方法 　将 30只小鼠均分为 3组 ,每只 小鼠腹腔注射白消安 ( 10 mg/kg)和环磷酰胺 ( 120 mg/kg) ,一次性注射后 ,分别饲养 4、12、20周 ,饲养 过程中 ,由于免疫抑制造成部分小鼠的死亡 ,其中第 1组死亡 4只 ,第 2组和第 3组分别死亡 5只 ,总体 死亡率 42%。化疗存活的小鼠一般情况良好 ,活动 和进食正常 ,体重无明显降低。分别在第 4、12、20 周采用 3%戊巴比妥钠腹腔注射 (30 mg/kg体重 )麻 醉后 ,取出附睾和睾丸 ,称取重量 ,浸泡 Bouin液中 固定 ,常规石蜡包埋、病理切片后进行苏木精 2伊红 (HE)染色 ,光镜下检查睾丸组织病理学改变。术后 断颈处死存活的小鼠。 1. 3. 2　激素方法 　将 30只小鼠均分为 3组 ,每日 每只小鼠皮下注射苯甲酸雌二醇 ( 4. 0 mg/kg体 重 ) ,连续注射 15 d。停药后继续饲养 4、12、20周 , 第 1组无死亡 ,第 2组死亡 2只 ,第 3组死亡 1只 , 总死亡率 10%。雌激素注射存活小鼠 , 一般情况良 好 , 活动和进食正常 , 体重无明显降低。分别在第 4、12、20周采用 3%戊巴比妥钠腹腔注射 (30 mg/kg 体重 )麻醉后 ,取出附睾和睾丸 ,称取重量 ,浸泡 Bouin液中固定 ,常规石蜡包埋、病理切片后进行苏 木精 2伊红 (HE)染色 ,光镜下检查睾丸组织病理学 改变。术后断颈处死存活的小鼠。 1. 4　统计学分析 　化疗组和激素组各个时期体重、 附睾和睾丸重量以 x ±s示 ,各对应时期的数据采 用独立样本 t检验分析比较。用 SPSS 12. 0软件进 行分析。P < 0. 05差异有显著性。 2　结果 2. 1　化疗组小鼠睾丸生精小管结构 　化疗后第 4 周小鼠睾丸生精小管内精子、精子细胞以及精母细 胞消失 ,可见少量初级精母细胞和精原细胞 (图 1 A)。化疗后 12周 ,生精小管内仅见基底层少许精 原细胞 ,间质组织发生纤维化 (图 1 B )。化疗后 20 周 ,生精小管内仍然保持无生精状态 ,没有明显恢复 迹象 (图 1 C)。 2. 2　激素组小鼠睾丸生精小管结构 　连续皮下注 射雌二醇 15 d,停药后 4周小鼠睾丸病检发现 ,生精 小管内精子、精子细胞以及部分精母细胞脱落消失 , 基底层可见部分精母细胞和精原细胞 (图 1 D ) ;停 药后 12周 ,生精小管内可见精母细胞增多 (图 1 E) ;停药后 20周 ,小鼠睾丸内可以找到部分生精小 管内含有精子细胞和精子 (图 1 F)。 2. 3　两组小鼠注射后体重、附睾和睾丸大小和重量 的比较 　各期小鼠体重在化疗药物注射和雌激素 连续皮下注射后无显著性降低 ,而化疗后小鼠睾丸 重量显著性低于苯甲酸雌二醇注射后的睾丸重量 ( P < 0. 05) ,附睾重量差异无显著性。见表 2。 3　讨论 采用化疗的方法构建无精子症动物模型已见报 道 [ 1, 2 ] ,但是 ,化疗往往导致动物死亡率偏高 ,剂量选 择不当 ,有时甚至有生精功能部分恢复的弊端。本 研究根据最新研究报道 ,借鉴其化疗方法来选择化 疗药物的剂量 [ 3 ]。探索利用雌激素构建小鼠无精子 症模型尚属一种新的方法。本文采取连续大剂量苯 甲酸雌二醇皮下注射 ,在成年雄性小鼠可以造成生 精小管内圆形细胞 (精子细胞和精母细胞 )的破坏 和脱落 ,造成生精功能的损害。有报道认为雌激素 可以导致睾丸圆形细胞 DNA损害 ,提示大剂量雌二 醇可能是造成成年雄性大鼠生精功能损害的原 因 [ 4, 5 ]。大剂量雌激素可明显抑制血清睾酮分泌和 精子发生 [ 6, 7 ] ,这些研究信息为选择雌激素构建雄性 小鼠无精子症动物模型提供了理论基础。 本研究中化疗组存活小鼠体重和附睾重量与激 素组差异无显著性 ,而睾丸的重量显著低于激素组 , 提示化疗存活小鼠全身影响不显著 ,主要造成对睾 丸的损害。该剂量雌激素连续皮下注射尚未造成小 鼠睾丸的显著萎缩 ,适合的注射剂量有待进一步探 索。本研究未将小鼠肝肾等器官进行病理学检查 , 在以后的研究中应该补充。化疗后 4、12、20周 ,雄 性小鼠睾丸切片病理检查均未见生精小管内有精子 细胞和精子 ,可见采用白消安合并环磷酰胺 ,在适当 剂量下可以稳定构建小鼠无精子症动物模型。而雌 激素皮下注射后第 20周 ,可见部分小鼠睾丸生精小 管内有生精细胞的恢复 ,提示这种方法可能难以构 建稳定的无精子症动物模型。不过 ,通过此研究可 见两种方法都能造成小鼠生精功能不同程度的损 害 ,可以作为小鼠无精子症动物模型构建的选择方 法 ,而雌激素注射方法尚需要进一步对剂量和用药 时间进行调整 ,才可能达到良好的效果。 ·841· 中华男科学杂志 2007年 2月 　第 13卷 图 1　化疗和雌激素注射后小鼠睾丸生精小管 (HE染色 , ×400) A:化疗 4周 ; B:化疗 12周 ; C:化疗 20周 ; D:连续注射激素后 4周 ; E:连续注射激素后 12周 ; F:连续注射激素后 20周 Figure 1. Tissue structures in the sem iniferous tubules of the m ice after chemotherapy and estradiol injection (HE, ×400) A: 4 weeks after chemotherapy; B: 12 weeks after chemotherapy; C: 20 weeks after chemotherapy; D: 4 weeks after successive injections of estradiol; E: 12 weeksafter successive injections of estradiol; F: 20 weeks after successive injections of estradiol 　　　　　　　表 2　化疗和雌激素注射后小鼠体重、附睾和睾丸大小和重量 ( x ±s) 　　　　　　　Table 2. W eights of the body, ep ididym is and testis of the m ice after chemotherapy and estradiol( x ±s) Group W eeks after intervention Body weight( g) 　　 Ep ididym is weight (mg) 　 Testis weight(mg) 　　 Chemotherapy 4 25. 2 ±2. 6 15. 3 ±3. 2 80. 2 ±6. 5 12 26. 2 ±1. 7 17. 6 ±4. 8 75. 5 ±8. 4 20 26. 1 ±1. 7 17. 5 ±5. 1 82. 3 ±6. 2 Estradiol injection 4 26. 0 ±1. 9 16. 2 ±2. 8 95. 5 ±8. 93 12 25. 6 ±2. 3 16. 8 ±6. 4 100. 1 ±11. 03 20 26. 5 ±1. 7 18. 6 ±5. 5 98. 7 ±6. 73 与化疗组同期比较 , 3 : P < 0. 05 Compared with chemotherapy in the same peroid, 3 : P < 0. 05 参考文献 [ 1 ]　张　茨 ,王玲珑 ,宋　超 ,等. 昆明白小鼠间同种生精干细胞移 植 [ J ]. 中华男科学 , 2003, 9 (6) : 4172420. [ 2 ]　Brinster RL, Zimmermann JW. Spermatogenesis following male germ2 cell transp lantation [ J ]. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91 (24) : 11298211302. [ 3 ]　Johnson J, Bagley J, Skaznik2W ikielM, et a l. Oocyte generation in adult mammalian ovaries by putative germ cells in bone marrow and peripheral blood[ J ]. Cell, 2005, 122 (2) : 3032315. 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