应用严格精子形态学测定法评估精子形态对体外受精率的影响

第 12卷 　第 9期 中华男科学杂志 Vol. 12　No. 9 2006年 9月 National Journal of Andrology Sep. 2006 ·研究简报 · 应用严格精子形态学测定法评估精子形态对 体外受精率的影响 崔险峰 (天津市中心妇产科医院生殖医学中心 , 天津 300052) 关键词 : 体外受精 ; 精子形态 中图分类号 : R698™ . 2　　文献标识码 : B　　文章编号 : 100923591 (2006) 0920842202① 　　在体外受精 ( IVF)的治疗实践中发现 ,受精率 低下 ( < 30%的卵子受精 )和受精失败 (所有卵子都 不受精 )的患者很常见 ( 20% ～30% ) [ 1 ] ,常规 IVF 技术已不能完全适应临床需要。导致这些受精失败 的原因未完全清楚 ,精子形态异常可能是常规 IVF 率低下的一个重要因素。为此 ,笔者采用严格精子 形态学测定法对精液标本进行分析并按正常精子形 态百分率分组 ,观察体外受精 - 胚胎移植 ( IVF2ET) 周期中不同正常精子形态百分率对 IVF的影响。 1　资料与 1. 1　标本来源 　选择 2005年 6月 ～2005年 10月 在天津市中心妇产医院生殖医学中心和唐山市妇幼 保健院生殖医学中心进行常规 IVF2ET辅助生育治 疗的 94个周期。药物促超排卵为促性腺激素 释放激素激动剂 ( GnRHa)降调后以常规长方案或短 方案促排卵 ,在取卵当日男方以手淫法采取精液 ,上 游法处理精液 ,在 0. 70 m l培养液 ( G2Fert)中上游 30 m in,吸取上液 0. 2～0. 4 m l用于 IVF。 1. 2　主要试剂 　D iff2Quick快速染色法试剂盒购自 深圳华康生物医学有限公司。 1. 3　精子形态分类 　使用严格精子形态学测 定法评估精子形态时 , ①按照文献 [ 2 ]标准判定正 常精子形态 ; ②将形态学处于临界状态的精子均列 为异常精子 ; ③ 94份精液标本按其正常精子形态百 分率分为 3组 :正常精子形态百分率 < 5%组 (A 组 ) , ≥5%而 < 15%组 (B组 )和 ≥15%组 (C组 )。 1. 4　精子形态 D iff2Quick快速染色 　取液化精液 500μl,加生理盐水 7 m l混匀 , 2 000 r/m in离心 10 m in。弃上清 ,保留沉淀。生理盐水调精子密度为 100 ×106 /m l, 取 5μl处理后的标本涂片 ,每份标本 原则上推 2张涂片 ,空气中自然干燥。染色按试剂 盒说明书操作。1 000倍油镜下观察不少于 200个精 子形态并记录结果。 1. 5　 IVF方法 　用培养液 ( IVF250)将上游获取的 精子密度调至 10 ×109 /L ,取 100μl微滴 ,覆盖矿物 油 (M 28410) ,置 5% CO2 37 ℃培养箱 30 m in后 (取 卵 4～6 h后 )可加卵 ,每微滴加卵 2～3个。受精后 16～20 h观察受精情况。以卵细胞内原核 ≥2个 (2PN)为受精 ,如观察时卵细胞未见极体则定为未 成熟卵 ,排除在本研究之外。 1. 6　统计学分析 　各组 IVF受精率采用χ2检验 , P < 0. 01认为差异具有显著性。 2　结果 3组患者 IVF受精率结果见表 1,差异有显著性 ( P < 0. 005)。 3　讨论 Macleod等于 1951年首先提出了对精子形态的 分类 ,此后众多的研究者提出了多种对精子形态的 分类方法 ,并研究了精子形态与男性生育力的关系。 在男性不育中精子形态所起的作用一直是一个争论 的焦点。精子形态在受精中的作用以及采用精子形 ·248· ① 收稿日期 : 2005211207; 修稿日期 : 2006205210 作者简介 : 崔险峰 (19722) ,男 ,陕西西安市人 ,主治医师 ,硕士 ,从事男性不育专业。 表 1　正常形态精子不同百分率对 IVF率的影响 组别 观察周期数 IVF率 ( % ) χ2 A组 10 20. 00 B组 31 67. 74 C组 53 84. 91 18. 21 态评定标准方面目前仍有争议 [ 3 ]。研究显示精子形 态与其功能密切相关 , 任何精子形态上的缺陷都将 导致其功能下降 , 影响男性生育力 [ 4 ] ,精子形态是 受孕过程中起重要作用参数之一 ,被认为是衡量男 性生育中最好指标 ,形态正常精子百分率与受孕有 直接关系 ,比精子密度、精液量和运动性更能在受孕 中起预测作用 [ 5 ]。形态异常精子受精率、受孕率明 显降低 [ 6 ]。 IVF方法用于临床以来 ,能够对精子和 卵子受精进行观察 ,从而提供了一个直接评估精子 受精能力的方法 ,并避免了其他不育因素的干扰。 1999年 WHO提出了严格的精子形态评分方法 [ 2 ] , 根据这一对精子形态的评分方法 ,研究认为正常形 态精子 < 15%时 , IVF受精率明显下降 [ 7 ]。L iu等 [ 8 ] 的研究结果显示 ,用严格精子形态测定的正常精子 形态率 ≤5%的患者 , IVF受精率平均低于 30% ,其 中大部分受精失败 ,因为有 65%这类患者有透明带 结合反应缺陷 ,故这类患者应选用卵细胞胞质内单 精子注射 ( ICSI)治疗。Guzick等 [ 9 ]认为用严格精子 形态测定的正常精子形态率在 6% ～15%的患者可 以选择 IVF或 ICSI,同时应参照另外的精子试验 ,诸 如精子密度、活率以及其他临床因素。黄敏珍等 [ 10 ] 的研究结果显示 ,当正常精子形态率 < 2%时 , IVF 的受精结局差 ,应选用 ICSI周期。 众所周知 ,对精子形态的评判受制片及操作者 主观因素的影响 ,为了尽可能减少在标本制作过程 中及结果判读时的主观因素的影响 ,笔者采用了洗 涤精子、调整精子密度及推片、染色中的统一操 作和对操作者的统一培训 ,对用 D iff2Quick快速染色 后的精子按严格精子形态评分方法给予评分 [ 11 ]。 本研究结果表明正常精子形态 < 5%的 A组 ,其 IVF 受精率为 20. 0% ;正常精子形态 ≥5%而 < 15%的 B 组 ,其 IVF受精率为 67. 74% ;正常精子形态 ≥15% 的 C组 ,其 IVF受精率为 84. 91%。即随着正常形态 精子所占百分率的升高 , IVF受精率也随之升高 ,而 且 3组之间的差别具有统计学意义。这表明正常精 子形态的百分率与 IVF受精率显著相关 ,它是影响 IVF受精率的一个重要因素。 参考文献 [ 1 ]　冯　婷 ,钱　云 ,刘嘉茵 ,等. 体外受精完全失败行卵细胞胞质 内单精子注射补救的应用价值探讨 [ J ]. 中华男科学 , 2004, 10 (3) : 1752177, 181. [ 2 ]　Word Health O rganization. WHO laboratory manual for the exam i2 nation of human semen and sperm2cervical mucus interaction [M ]. 4 th ed. London: Cambridge University Press, 1999. [ 3 ]　Nallella KP, Sharma RK, Aziz N, et a l. Significance of sperm characteristics in the evaluation of male infertility[ J ]. Fertil Ster2 il, 2006, 85 (3) : 6292634. [ 4 ] 　Yu JJ, Xu YM. U ltrastructural defects of acrosome in infertile men[ J ]. A rch Androl, 2004, 50 (6) : 4052409. [ 5 ]　Sallam HN, Ezzeldin F, Sallam A, et a l. Sperm velocity and mor phology, female characteristics, and the hypo2osmotic swelling test as p redictors of fertilization potential: experience from the IVF model[ J ]. Int J FertilWomensMed, 2003, 48 (2) : 88295. [ 6 ]　De VosA, Van De Velde H, Joris H, et a l. Influence of individ2 ual sperm morphology on fertilization, embryo morphology, and p regnancy outcome of intracytop lasm ic sperm injection[ J ]. Fertil Steril, 2003, 79 (1) : 42248. [ 7 ]　Coetzee K, Kruger TF, Lombard CJ. Predictive value of normal sperm morphology: a structured literature review [ J ]. Hum Re2 p rod, 1998, 4 (1) : 73282. [ 8 ]　L iu de Y, Baker HW. Frequency of defective sperm2zona pelluci2 da interaction in severely teratozoosperm ic infertile men[ J ]. Hum Rep rod, 2003, 18 (4) : 8022807. [ 9 ]　Guzick DS, Overstreet JW , Factor2L itrak P, et al. Sperm mor2 phology, motility and concentration in fertile and infertile men [ J ]. N Engl J Med, 2001, 345 (19) : 138821393. [ 10 ]　黄敏珍 ,吴敬之 ,史 　哲 ,等. 人卵泡液诱导精子顶体反应预 测体外受精能力 [ J ]. 中国男科学杂志 , 2005, 19 (6) : 8211. [ 11 ]　Enginsu ME, Dumoulin JC, PietersMH, et a l. Evaluation of hu2 man sperm morphology using strict critera after D iff2Quick stai2 ning; correlation of morphology with fertilization in vitro [ J ]. Hum Rep rod, 1991, 6 (6) : 8542858. (徐建平 　编发 ) ·348·第 9期 　　崔险峰 等 　应用严格精子形态学测定法评估精子形态对体外受精率的影响