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分子杂交技术(2007)

2010-12-07 42页 ppt 2MB 20阅读

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分子杂交技术(2007)nullnull分子杂交技术 李洋 湖北大学生命科学学院null核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 在DNA复性过程中,如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中,或把DNA与RNA放在一起,只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系,就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex) 。一、分子杂交与印迹技术的原理null复性RNADNAnullDNA变性 方法 热变性:90~100℃ 酸碱变性:常采用碱变性 化学试剂变性:尿素、甲酰胺、甲醛等 特点:粘度增加...
分子杂交技术(2007)
nullnull分子杂交技术 李洋 湖北大学生命科学学院null核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 在DNA复性过程中,如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中,或把DNA与RNA放在一起,只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系,就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex) 。一、分子杂交与印迹技术的原理null复性RNADNAnullDNA变性 方法 热变性:90~100℃ 酸碱变性:常采用碱变性 化学试剂变性:尿素、甲酰胺、甲醛等 特点:粘度增加、密度增加、增色效应、溶解温度(melting temperature,Tm) DNA复性或杂交(hybridization) DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等null影响杂交的因素影响杂交的因素核酸分子的浓度和长度 浓度大,复性快;分子量大,复性慢 温度 离子强度 杂交液中的甲酰胺 核酸分子的复杂性 非特异性杂交反应 预杂交:封闭非特异性杂交位点,用鲑鱼精子DNAnullnullnull印 迹 法 (Blotting)内切酶切开DNA电泳印迹转移放射性探针杂交胶片显影凝胶电泳凝胶电泳null 分子杂交中的一些基本概念 探针 (probe) 人工合成,即为探针 DNA 片断。一小段用同位素、生物素或荧光染料标标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸,与固定在NC膜上的核苷酸结合,判断是否有同源的核酸分子存在。 null 探针 检测 Southern 法 DNA DNA Northern 法 DNA RNA Western 法 蛋白质 蛋白质 (单向) Eastern 法 蛋白质 蛋白质 (双向)探针的标记探针的标记探针的种类 cDNA 探针、基因组DNA探针、寡核苷酸探针、RNA探针 标记物 核素标记物(同位素标记):32P、35S、3H等 非核素标记物(非同位素标记):生物素、地高辛、荧光素等nullnull探针标记方法 缺口平移法(nick translation) 随机引物法(random primer):六核苷酸残基的引物 PCR标记法 末端标记法 探针的纯化 nullnullnullnullnullnullnullnullnullSouthern 印迹杂交Southern 印迹杂交1975年,英国Southern创建 DNA/DNA杂交,即将DNA电泳、转印到固相支持物上,用探针进行检测的方法。Southern 杂交(Southern bloting)的主要步骤Southern 杂交(Southern bloting)的主要步骤待测DNA样品的制备、酶切 待测DNA 样品的电泳分离:琼脂糖凝胶电泳 凝胶中DNA的变性:碱变性 Southern转膜: 硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜 毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法 探针的制备 Southern杂交 杂交结果的检测 nullnullnullnullNorthern 印迹杂交(Northern bloting)Northern 印迹杂交(Northern bloting)检测RNA(主要是mRNA)的方法 与Southern杂交的不同 靶核酸:RNA RNA电泳 转膜:不需变性斑点印迹杂交(dot bloting)斑点印迹杂交(dot bloting)将RNA或DNA变性后直接点样于NC膜或尼龙膜上 优点:简单、快速、可同时检测多个样品null原位杂交(in situ hybridization)原位杂交(in situ hybridization)将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交,称为原位杂交。 特点 能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究 不需从组织或细胞中提取核酸,对含量极低的靶序列灵敏度高 能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态 核酸原位杂交的基本步骤核酸原位杂交的基本步骤细胞或组织的固定:载玻片 组织细胞杂交前的预处理 用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质 探针的选择和标记 杂交 杂交结果检测nullnullWestern 杂交印迹法(Western bloting)Western 杂交印迹法(Western bloting)检测蛋白质,即将电泳分离的非标记蛋白质转移到固相载体上,用特异的抗血清对蛋白质进行鉴定及定量的方法 主要步骤: 蛋白质样品的制备 SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳 蛋白质的电转移:NC膜 靶蛋白的免疫学检测 靶蛋白于第一抗体(一抗)反应 与标记的第二抗体(酶标二抗)反应 显色反应:酶促反应nullnull三种印迹技术的比较nullnull放射自显影照片
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