#论 著#
自体骨髓干细胞移植治疗慢性肝衰竭研究
姚 鹏 胡大荣 王 帅 闻 炜 周一鸣 龚丽娟
=摘要> 目的 探索自体骨髓干细胞移植对肝衰竭患者的治疗作用,为干细胞移植的临床应用研究提供基础。方
法 35 例慢性重症肝病患者, 20 例行自体骨髓干细胞移植治疗, 15例作为对照。在无菌条件下, 从患者髂后上棘抽取骨
髓30~ 50 ml, 分离纯化骨髓干细胞。在局部麻醉下行肝动脉介入, 将分离的骨髓干细胞移植于肝脏。患者在移植后 1、
2、4、8 周进行肝功能检测。观察患者移植后不同时间症状改善情况及术后不良反应情况。结果 在移植 8周后,患者丙
氨酸转氨酸逐渐降低,由平均 181. 7 LmolPL 降至72. 1 LmolPL;总胆红素由平均153. 8 LmolPL 降至80. 2 LmolPL;直接胆红素
由平均 74. 1 LmolPL降至 40. 5 LmolPL;白蛋白逐渐升高,由平均 26. 5 LmolPL 升至 31. 5 LmolPL;与对照组相比有明显差异,
表明移植后患者肝功能明显改善。干细胞移植后凝血酶原活动度逐渐上升,由术前平均 28. 2%上升至 50. 1%。进一步
观察自体骨髓干细胞移植对肝衰竭患者生存率的影响, 发现移植后 1 周生存率为 100% , 4 周为 95% ( 19P20) , 8 周后为
90% (18P20) , 12 周后为 85% (17P20) ,较对照组生存率明显升高。移植后大多数患者有明显症状改善, 移植后 8 周内腹水
减轻 10例( 50% ) , 食欲改善 15例( 75% ) ,体力好转 11 例( 55% ) , 腹胀减轻 9例 ( 45% )。在 20 例移植患者中未发现严重
并发症,术后有轻度恶心 1 例,发热 1 例。结论 自体骨髓干细胞移植治疗后, 患者肝功能和凝血机制明显改善,生存率
提高,症状好转, 表明骨髓干细胞移植对肝衰竭患者治疗有效, 安全,不良反应少。
=关键词> 骨髓干细胞;移植;肝衰竭
Trea tment of chronic hepatic failur e with autologous bone mar row stem cells tr ansplantation YAO Peng , HU Da2ron,
WANGShuai, WEN Wei, ZHOUYi2ming, GONGLi2juang. Institute of Liver Diseases, General Hospital of Beijing Military Region,
Beijing 100700, China
=Abstr act> Objective Recent advances have implicated that bone marrow2derived stem cells could differentiate into hepatocytes
and play a important role in the regulation of liver regeneration. In this study we investigated the possibility of treatment for patients with
liver failure by transplantation of self2bone marrow derived stem cells. Methods Patients were divided into two groups, the transplant
group and control group. Bone marrow was harvested( 30250 ml) from patients in the transplant group. To get the bone marrow stem
cells, bone marrowwas processed by density gradient sedimentation, the final preparation of BMSC were infused into liver of patients via
hepatic artery. At different time ( 1week, 2weeks, 4weeks, 8weeks) after transplantation, ALT, TBIL, DBIL, ALB, PTAwere tested,
and the survival rate and improvement of symptom were recorded. Results After transplantation of bone marrow stem cells, the liver
function of patients improved. Eight weeks after transplantation, ALT reduced from 181. 71 LmolPL to 72. 1 LmolPL;TBIL frome 153. 1
LmolPL to 80. 2 LmolPL; DBIL from 74. 1 LmolPL to 40. 5 LmolPL; ALB elevated from 26. 5 LmolPL to 31. 5 LmolPL; PTA rose from
28. 23% to 50. 1% ; the survival rate of transplant group were higher than that of control group; symptoms of patients of transplant group
were better. Eight weeks after transplantation, ascites decreased in 10 cases( 50% ) , appetite improved in 15 cases(75% ) , abdomen
distention ameliorated in 9 cases ( 45% ) ; no serious events developed in 20 patients with bone marrow stem cells transplantation.
Conclusion The liver function of patients with severe liver disease were significantly improved after bone marrow stem cells
transplantation, the preliminary results indicate that it is safe and effective.
=Key words> Bone marrow stem cells; Transplantation; Liver damage
作者单位: 100700 北京军区总医院肝病治疗中心
干细胞是指一类具有自我更新和分化能力的细
胞[ 1,2] ,干细胞的增殖及定向分化具有巨大的应用潜
能,已成为细胞生物学以及整个生命科学的研究热点。
干细胞定向分化为功能细胞并用于器官损伤治疗
一直是人类医学的梦想及追求目标,研究表明,在肝损
伤及肝细胞再生过程中[ 3] ,干细胞起着重要作用,而骨
髓干细胞是肝细胞的重要肝外来源[ 4, 5]。骨髓干细胞
在特定环境下可分化成肝干细胞及肝细胞, 从而参与
肝功能的修复和重构。
我们研究应用患者自体骨髓干细胞作为供体, 在
体外分离纯化后移植肝衰竭患者体内, 使干细胞在肝
脏中生长分化为具有功能的肝细胞, 使损伤肝功能得
#171#肝脏 2005年 9月第 10卷第 3期
以恢复和重建。为肝病治疗打开崭新途径, 为干细胞
的进一步治疗研究打下基础。
材料和方法
一、病例选择
表 1 自体骨髓干细胞移植后肝功能改善(LmolPL, x ? s)
参数 术前对照组 移植组
术后 1周
对照组 移植组
术后 2周
对照组 移植组
术后 4周
对照组 移植组
术后 8周
对照组 移植组
ALT 193. 0 ? 24. 1 181. 7? 15. 1 152. 1 ? 28. 6 149. 2 ? 20. 5 151. 7 ? 19. 7 121. 2? 22. 5 164. 3 ? 32. 3 86. 7 ? 22. 5 106. 9 ? 23. 2 72. 1 ? 31. 6
TBIL 157. 2 ? 10. 1 153. 8? 26. 1 169. 6 ? 90. 4 124. 2 ? 41. 7 123. 7 ? 59. 9 112. 2? 75. 1 134. 5 ? 64. 2 81. 1 ? 45. 9 119. 2 ? 87. 1 80. 2 ? 64. 9
DBIL 83. 1 ? 70. 1 74. 1? 61. 1 91. 5 ? 30. 6 64. 5 ? 56. 6 77. 4 ? 36. 7 53. 3? 52. 1 80. 2 ? 58. 2 39. 2 ? 15. 3 72. 4 ? 47. 6 40. 5 ? 39. 2
ALB 28. 2 ? 4. 8 26. 5? 4. 2 27.L6? 4. 7 29. 1 ? 3. 9 28. 9 ? 3. 8 30. 1? 4. 2 29. 6 ? 3. 7 32. 3 ? 4. 0 25. 9 ? 4. 6 31. 5 ? 4. 1
35例慢性乙型重症肝病患者为我所住院病例,年
龄20~ 65岁, 诊断符合 2000 年病毒性肝炎防治
诊断标准[ 6]。20例行自体骨髓干细胞移植治疗, 15例
为对照,给予综合基础治疗。所有治疗在患者知情同
意情况下进行, 签定5知情同意书6。
二、主要试剂及仪器
流式细胞仪( FACSCalibur, BD公司) , LCV PLUS血
管造影仪 ( GE 公司 ) , Percoll 分离液 ( Sigma 公司) ,
DMEM(Dulbecco. s modified eagle. s medium2F12)培养基
(Hyclone公司)。
三、骨髓干细胞采集
患者行局部麻醉消毒, 在无菌条件下, 以 18号骨
髓穿刺针从髂后上棘进行穿刺,抽取骨髓 50~ 100ml ,
以4 000U肝素抗凝, 避免污染。
四、骨髓干细胞分离
按参考文献[ 7]方法,患者骨髓离心去除脂肪层,
用等量 DMEM培养液稀释骨髓,制成细胞悬液。将骨
髓加到密度 1. 073Pml的 Percoll分离液上, 1 200 @g离
心25 min(室温下)。吸取界面细胞层, 用生理盐水洗
脱, 1 500@g@5 min离心 3次, 生理盐水重悬细胞,镜
下计数所用细胞为 1. 0 @107 细胞Pml, 制成体积为 10
ml悬液,置于 37 e 二氧化碳孵箱待用。骨髓干细胞移
植患者在局部麻醉下,行肝动脉介入,在 X线监视下,
将分离的骨髓干细胞通过导管从肝动脉缓慢给入病变
部位。之后用 10 ml 生理盐水冲洗管腔。剂量:骨髓
干细胞每次 5@107~ 108Pml。
五、肝功能检测
患者在移植后不同时间( 1、2、4、8周)进行肝功能
检测, 分别检测丙氨酸转氨酶 ( ALT ) , 总胆红素
(TBIL) , 白蛋白 (ALB) , 凝血酶原活动度 ( PTA) 等指
标,未移植组作为对照。
六、症状改善及不良反应
观察患者在移植后不同时间( 1、2、4、8周)腹水、
食欲、体力、腹胀、睡眠等症状改善情况及术后不良反
应情况,未移植组作为对照。
统计学检验采用 t 检验。
结 果
一、自体骨髓干细胞移植后患者肝功能改变
患者在移植 1、2、4、8周后, ALT逐渐降低,由平均
181. 7 LmolPL 降至 72. 1 LmolPL, TBIL 由平均 153. 8
LmolPL降至 80. 2 LmolPL, 直接胆红素( DBIL)由平均
74. 1 LmolPL 降至 40. 5 LmolPL, ALB逐渐升高, 由平均
26. 5 LmolPLPL升至 31. 5 LmolPLPL,移植 8周后与对照
组相比差异有显著性,表明骨髓干细胞移植治疗后,患
者肝功能明显改善(表 1)。
二、自体骨髓干细胞移植后患者凝血机制改变
移植组在干细胞移植后 PTA逐渐上升, 由术前平
均28. 23%上升至术后 4周的 50. 16%, 而对照组患者
无明显改善,表明骨髓干细胞移植治疗后,患者凝血机
制明显改善(图 1)。
图 1 自体骨髓干细胞移植后 PTA 改变
三、自体骨髓干细胞移植对患者短期生存率影响
对照组患者在 1周后,生存率下降为 86. 67% (13P
15) , 4周后为 80%( 12P15) , 8周后为 60% (9P15) , 12周
后下降至 40%(6P15)。而移植组移植后 1周生存率为
100% , 4周为 95% (19P20) , 8周后为 90% (18P20) , 12
周后为85% (17P20) ,较对照组生存率明显升高。
四、自体骨髓干细胞移植后患者症状改善
#172# Chinese Hepatology, Sep 2005, Vol 10, No. 3
移植后大多数患者有明显症状改善,移植后 8周
内腹水减轻 10例( 50% ) , 食欲改善 15例( 75% ) ,体力
好转 11例( 55%) , 腹胀减轻 9 例( 45%) ,睡眠改善 12
例( 60%)。
五、自体骨髓干细胞移植后不良反应发生情况
在20例移植患者中未发现严重并发症,术后有轻
度恶心1例,发热 1例。未见白细胞下降、肝区疼痛出
血等并发症。
讨 论
骨髓干细胞是肝细胞的重要肝外来源, 在特定环
境下可分化成肝干细胞及肝细胞, 从而参与肝功能的
修复和重构。近年发现骨髓干细胞能分化为多种组织
细胞,如肝细胞、神经细胞、心肌细胞和骨骼肌细胞
等[ 8,9]。Theise等[ 10]报道,骨髓细胞在体内不但能分化
为肝细胞,而且能分化为胆管细胞。大量研究表明,骨
髓干细胞能分化为肝细胞,参与细胞再生,从而治疗肝
损伤[ 11, 12]。我们在大量研究基础上, 将骨髓干细胞应
用于肝病治疗。
由于干细胞的分化受其分化环境影响, 在肝脏内
环境下干细胞能分化为肝细胞。因此, 我们将自体骨
髓干细胞移植至患者肝脏,使其在自身内环境下分化
为肝细胞,替代损伤肝细胞,从而促进肝功能修复和肝
再生。
本研究采集自体骨髓干细胞移植, 可以避免免疫
排斥反应,不必考虑组织相容性抗原(MHC)的配型问
题,具有良好应用前景。
我们的研究表明, 患者在移植 8 周后, ALT 和
DBIL逐渐降低, ALB逐渐升高, 与对照组相比差异有
显著性,表明骨髓干细胞移植治疗后,患者肝功能明显
改善。移植组在干细胞移植后 PTA逐渐上升, 表明骨
髓干细胞移植治疗后, 患者凝血机制明显改善。对照
组患者在 1周后,生存率下降至 86. 6% (13P15) , 4周后
下降至 80% ( 12P15) , 8周后为 60% (9P15) , 12周后下
降至 40% (6P15) ;而移植组, 在移植后 1周生存率为
100% , 4 周为 95% (19P20) , 8周后为 90% (18P20) , 12
周后为 85% (17P20) ,较对照组生存率明显升高。移植
后大多数患者有明显的症状改善, 在20例移植患者中
未发现严重并发症。
肝衰竭是由于各种原因造成的肝功能严重损害,
目前还无有效治疗措施, 尽管肝移植为肝衰竭患者提
供了有效的治疗方法, 但由于费用高昂, 供体肝源有
限,从而使肝移植的广泛应用受到限制,干细胞移植将
为肝衰竭患者提供崭新的治疗途径, 具有巨大的应用
前景[ 13]。
本研究中, 我们初步探讨了自体骨髓干细胞移植
对肝衰竭的治疗作用,结果令人鼓舞。然而, 自体骨髓
干细胞在人受体肝脏内定植、生长分化为肝细胞的过
程还需进一步研究, 我们以后的研究将对移植分化的
细胞进行追踪检测, 探讨移植后骨髓干细胞在肝脏内
环境下生长分化的情况。
研究采用自体骨髓干细胞移植, 不存在免疫排斥
反应,安全有效,价格低廉,具有良好前景。
参 考 文 献
1 Yao P. Act ivation of NF2JB is not essential for hepatocyte growth factor2
mediated anti2apoptosis effect on WB F2344 cell but for WB cell
proliferat ion. J Hepatol, 2004, 40: 3912398.
2 姚鹏,詹轶群,许望翔,等.细胞因子在体外对大鼠肝干细胞的影
响.中华肝脏病杂志, 2003, 11:33236.
3 Petersen BE, Bowen WC, Patrene KD, et al. Bone marrow as a potential
source of hepatic oval cells. Science, 1999, 284: 116821170.
4 Masahiro M, Akiyama I, Sakaguchi M, et al. Improved conditions to
induce hepatocytes from rat bone marrow cells in culture. Biochem Biophys
Res Commun, 2002, 298:24230.
5 Wollert K, Meyer G, Lots J, et al. Int racoronary autologous bone2marrow
cell transfer after myocardial infarct ion: the BOOST randomized control led
clinical trial . Lancet , 2004, 364: 1412148.
6 中华医学会传染病与寄生虫病分会、肝病学分会. 病毒性肝炎防治
方案.肝脏, 2000, 5: 2572263.
7 Oh SH, Miyazaki M, Kouchi H, et al. Hepatocyte growth factor induces
different iation of adult rat bone marrow cells into a hepatocyte lineage in
vitro. Biochem Biophys Res Commun, 2000, 279, 5002504.
8 Kusheda T, Inaba M, Hisha H , et al. Crucial role of donor2derived stromal
cells in successful treatment for intractable autoimmune diseases inMRLPlpr
mice by BMS via portal vein. Stem Cell, 2001, 19:2262235.
9 Cantz T, Sharma AD, Jochheim2Richter A, et al. Reevaluat ion of bone
marrow2derived cells as a source for hepatocyte regeneration. Cell
Transplant , 2004, 13 :6592666.
10 Theise ND, Badve S, Saxena R, et al. Derivation of hepatocytes from bone
marrow cells in mice after radiat ion2induced myeloablat ion. Hepatology,
2000, 31: 2352 240.
11 Robert ES, Morayma R, Lisa K , et al. Multipotent adult progenitor cells
from bone marrow differentiate into functional hepatocyte2like cells. J Clin
Invest , 2002, 109: 129121302.
12 Lee KD, KuoTK, Whang2Peng J, et al. In vit ro hepatic different iation of
human mesenchymal stem cells. Hepatology, 2004, 40 : 127521284.
13 Kania G, Blyszczuk P, Jochheim A, et al. Generation of glycogen2and
albumin2producing hepatocyte2 like cells from embryonic stem cells. Biol
Chem, 2004, 385: 9432953.
(收稿日期:2005206203)
#173#肝脏 2005年 9月第 10卷第 3期