RP_HPLC测定软糖中的食用合成色素

农产品加工·学刊 2009年第 5期 第 5期(总第 172期) 农产品加工·学刊 No.5 2009年 5月 Academic Periodical of Farm Products Processing May. 文章编号：1671- 9646 ( 2009 ) 05- 0070- 02 收稿日期：2008- 11- 12 作者简介：黄桂颖（1980- ），女，广东人，实验员，研究方向：食品化学与分析。E- mail：hgyzhku@163.com。 糖果产品多样化，更新快，因而食品安全对糖果 中添加的合成色素含量的检测方法有较高要求。近来 较为普遍的检测方法有离子交换色谱法、反相离子对 色谱法及高效液相色谱法[1~5]。而现有的高效液相色谱 法因应用于多种产品中，故需要采用较繁杂、耗时长 的梯度洗脱，本研究建立了一种快速、简单、准确的 高效液相色谱法，用于检测糖果中添加的合成色素含 量。 1 实验部分 1.1 仪器和试剂 1.1.1 主要实验仪器 Agilent1100型高效液相色谱仪、超声波清洗器、 二次蒸馏水器、G3型垂融漏斗抽滤装置。 1.1.2 主要试剂 甲醇（色谱纯）、二次蒸馏水、柠檬酸铵、柠檬 酸、甲酸、醋酸铵、聚酰胺粉、乙醇、草酸铵、氨 水、乙酸、甲酸、胭脂红、柠檬黄、日落黄，均为分 析纯试剂。 1.2 色谱条件 Zorbax eclipse XDB C18 150 mm×4.6 mm i.d色谱 柱，甲醇 +浓度为 0.02 mol/L的醋酸铵 （体积比为 25∶75） 作为流动相，流速为 1.00 mL/min，检测波 长为 254 nm，柱温为室温，采用曲线法定量[5]。 1.3 试液的制备 1.3.1 标样的制备 精密称取柠檬黄、日落黄、胭脂红各 0.1 g，分 别定容于 3个 100 mL容量瓶中，作为储备液，精密 移取上述 3种标准储备液各 5.0 mL，放入 100 mL容 量瓶中，用二次蒸馏水定容。3种色素质量浓度均为 50 μg/mL。 1.3.2 样品液的制备 采用聚酰胺法制备样液。称取软糖 7.0 g，粉碎 样品，并装入 100 mL烧杯中，加入 30 mL水，温热 溶解，用柠檬酸溶液调整 pH值为 6左右。将样液加 热至 60 ℃，加入 1 g聚酰胺粉，充分混匀，抽滤。 用 60 ℃的 pH值为 4的水洗涤 3~5次后，用甲醇 - 甲酸混合溶液洗涤 3~5次，再用水洗至中性，用甲 RP-HPLC测定软糖中的食用合成色素 黄桂颖，陈悦娇，苏燕妃，马应丹 （仲恺农业工程学院 轻工食品学院 校级重点实验室，广东 广州 510225） 摘要：建立了一种利用反相高效液相色谱快速检测软糖中食用合成色素含量的方法。色谱条件为 Zorbax eclipse XDB C18 150 mm×4.6 mm i.d 色谱柱，以甲醇与醋酸铵 （浓度为 0.02 mol/L） 体积比为 25∶75 作为流动相，流速为 1.00 mL/min，检测波长为 254 nm。结果明，香橙味软糖中的食用合成色素柠檬黄、胭脂红、日落黄的平均含量分 别是 0.166 5，0.006 6，0.166 5 g/kg，RSD为 0.24%~0.78%，回收率为 98.23%~100.20%。该方法快速、准确、重现 性好。 关键词：RP- HPLC；食用合成色素；柠檬黄；胭脂红；日落黄 中图分类号：TS202.3 文献标志码：A Determination of Synthetic Food Colors in Panoche by RP- HPLC Huang Guiying，Chen Yuejiao，Su Yanfei，Ma Yingdan （College of Light Industry and Food Sciences，Zhongkai University of Agriculture and Technology， Guangzhou，Guangdong 510225，China） Abstract：A quick method for determination of synthetic food colors in panoche by reversed phase high performance liquid chromatography was developed. Zorbax eclipse XDB C18 150 mm×4.6 mm i.d was used and mobile phase was methanol and 0.02 mol/L ammonium acetate with flow rate of 1.00 mL/min. Detected wavelength was at 254 nm. The recoveries were 98.23% ~100.20% and the relative standard deviation was less than 1.40%. The results mentioned above indicated that the method was simple，rapid and accurate. Key words：RP- HPLC；synthetic food colors；tartazine；ponceau；sunset yellow 2009年第 5期 图 1 色素标样色谱图（a） 和香橙味软糖的色谱图（b） 醇 - 氨水 - 水混合溶液解吸 3~5次，每次 5 mL，收 集解吸液，加入乙酸中和，蒸发近干，加水溶解，定 容至 5.0 mL。 2 结果与分析 2.1 检测波长 参照 GB/T5009.35—1996[4]，选择 254 nm为检测 波长。 2.2 流动相的选择 本文分别对梯度洗脱和等梯度洗脱做了试验。 梯度洗脱条件：采用体积分数为 20%~35％的甲 醇，洗脱 5 min；体积分数为 35％~98％甲醇，洗脱 7 min；体积分数为 98％的甲醇继续洗脱 6 min，对 洗脱质量浓度 50.0 μg/mL的混合标准液进行分离， 流速为 1.00 mL/min。结果显示，该条件下能分离出 3 个特征峰，但基线漂移不稳定，后期出现很多杂 峰。 以甲醇 +浓度为 0.02 mol/L的醋酸铵，甲醇 +质 量浓度为 1.25 g/L草酸铵，甲醇 +质量浓度为 0.5 g/L 的柠檬酸铵作为流动相，测试不同比例下色谱图的区 别。结果表明，3 种流动相均在比例为 25∶75 时， 3个特征峰的分离效果较好，其他比例出现重峰、拖 尾严重、基线不平、分离时间较长等现象。经过对 比，甲醇 +质量浓度为 1.25 g/L的草酸铵作为流动相 时，3个特征峰前出现较大的负吸收峰，影响定量结 果；而甲醇 +浓度为 0.02 mol/L的醋酸铵比甲醇 +质 量浓度为 0.5 g/L的柠檬酸铵（作为流动相时） 的色 谱图中特征峰的峰形更好，故本文选择甲醇与浓度为 0.02 mol/L醋酸铵的比例为 25∶75作为流动相；考虑 分离时间控制在 5 min左右，确定流速为 1.00 mL/min。 色素标样色谱图 （a） 和香橙味软糖的色谱图 （b） 见图 1。 2.3 线性回归方程、相关系数、线性范围 在拟定色谱条件下，将不同浓度的混合标样液系 列（质量浓度为 10，20，30，40，50 μg/mL） 分别 注入色谱仪，得线性回归方程、相关系数、线性范 围。 3种色素的线性回归方程、相关系数、线性范围 见表 1。 2.4 样品测定 把处理后的样品稀释 2倍，注入色谱仪，得到样 品色谱图，见图 1（b）。称取样品 3 份各 7.0 g，经 本方法的样品处理后进样，每份试样重复进样 4次， 按回归方程计算出含量，取其平均值，得香橙味软糖 中柠檬黄的含量为 0.119 g/kg，胭脂红的含量为 0.005 g/kg，日落黄的含量为 0.029 g/kg。 2.5 精密度和回收率 经 5次重复试验，柠檬黄、胭脂红、日落黄的 RSD分别为 0.24%，0.78%，0.43%，方法回收率为 98.23%~100.2%，其相对标准偏差不大于 1.40%，表 明测定结果的重现性较好，准确度良好。 2.6 标样液和样品液的稳定性试验 标准溶液和样品液在常温（无阳光直接照射） 下 放置，每隔 1 d进样，每次重复进样 3次。放置 5 d后， 标准溶液和样品液中的柠檬黄、胭脂红、日落黄的含量 变化不显著，标准溶液的 RSD分别为 0.16%，0.52%， 0.53%，样品液 RSD分别为 0.57%，0.67%，0.81％，说 明 3种食用合成色素在常温下的稳定性良好。 3 小结 与其他测定方法相比，选用等梯度高效液相色谱 表 1 3种色素的线性回归方程、相关系数、线性范围 色素 线性范围 /mg·L-1 回归方程 相关系数 R 柠檬黄 胭脂红 日落黄 5.0~25.0 5.0~25.0 5.0~25.0 Y=5 068.217 X- 2 751.095 Y=8 822.831 X- 4 054.619 Y=7 348.645 X- 659.142 0.999 8 0.999 8 0.999 9 1- 柠檬黄；2-胭脂红；3- 日落黄 70 60 50 40 30 20 10 0 0 1 2 3 4 5 6 m AU 1 1.376 3.777 2.223 2 3 （a） 140 120 100 80 60 40 20 0 0 1 2 3 4 5 6 m AU 1.373 3.777 2.232 1 2 3 （b） （下转第 75页） 黄桂颖，等：RP- HPLC测定软糖中的食用合成色素 ·71· 2009年第 5期 色泽有明显的影响。 （2） 表 2数据说明，萎凋和摇青会使叶子中一部 分叶绿素被破坏，且日光萎凋对叶绿素的破坏作用远 大于室内自然萎凋，日光萎凋 2次摇青茶的叶绿素含 量比对照处理的减少了 13.6％，但由于夏茶叶中的叶 绿素含量较高，适当破坏一部分，反而有利于成品茶 干茶色泽和叶底色泽；摇青的次数（1次或 2次） 对 叶绿素的破坏作用不显著。 （3） 萎凋和摇青的目的，是促使鲜叶内含成分的 转化。有关研究表明，萎凋和摇青会促使儿茶素总量 呈下降趋势，EGCG的含量也呈下降趋势，游离氨基 酸含量呈上升趋势。表 2中数据也说明，萎凋和摇青 促使茶多酚总量下降，但游离氨基酸的含量明显上 升，从而有利于改进夏茶的滋味。在同等失水率条件 下，室内自然萎凋茶的茶多酚含量均高于日光萎凋 的，1次摇青茶的茶多酚含量均高于 2次摇青的。可 见日光萎凋和 2次摇青有加快（增强） 茶多酚的降解 作用，用茶多酚含量较高的夏茶原料制作绿茶，日光 萎凋和 2次摇青均对茶叶品质形成有积极作用。 不同的萎凋方式和摇青次数对增加茶叶游离氨基 酸含量的影响，与对茶多酚含量的影响有所不同，无 论是日光萎凋还是室内自然萎凋，摇青 2次处理茶的 游离氨基酸含量都明显比摇青 1次的高，室内自然萎 凋 2次摇青处理茶的游离氨基酸含量也比日光萎凋 1次摇青处理的高，这是否可说明摇青对提高茶叶游 离氨基酸含量比任何萎凋方式更明显。 （4） 从表 2中水浸出物的变化情况看，萎凋和摇 青在促进了茶叶茶多酚和游离氨基酸含量变化的同 时，也促进了叶子中其他高分子物质的降解，从而提 高了茶汤水浸出物含量，改善了夏茶的香味和茶叶的 耐泡性。 参考文献： 李永章． 深度开发夏秋茶、充分利用茶资源 [J] . 茶叶， 2007（1）：46-47. 孙曼曼． 抓好夏秋茶生产的技术措施及途径 [J] . 茶业通 报，2007（1）：32-33. 陈旭东 ． 提高绍兴市夏秋茶资源利用水平的对策思考 [J] . 中国茶叶，2007（6）：20-21. [1] [2] [3] （上接第 32页） 法测定果糖中的食用合成色素柠檬黄、胭脂红、日落 黄，更快捷、更简单、更准确。 参考文献： 邢晓慧，尹未华，韩春菊，等. 高效液相色谱法测定蜜饯 中食用合成色素 [J] . 食品研究与开发，2007，28（10）： 133-135. 朱克永，敬西群，潘宁. 食品检测技术 [M] . 北京：科学 出版社，2004. 大连轻工学院. 食品分析 [M] . 北京：中国轻工业出版 社，1994. 靳敏，夏玉宇. 食品检测技术 [M] . 北京：化学工业出版 社，2003. 李必斌. 食品合成色素检测方法的研究进展 [J] . 中国卫 生检验杂志，2002，12（6）：758，739. 刘福岭，戴行钧. 食品物理与化学分析方法 [M] . 北京： 中国轻工业出版社，1987. [1] [2] [3] [4] [5] [6] （上接第 71页） benefits of Golden Rice: a Philippine case study [J] . Food Policy，2004，29： 147-168. Malene Schroder，Morten Poulsen. A 90-day safety study of genetically modified rice expressing Cry1Ab protein（Bacil－ lus thuringiensis toxin） in Wistar rats [J] . Food and chem－ ical Toxicology，2007，45：339-349. 曾青兰，李晓宏，王志勇 . 转基因食品安全性的探讨 [J] . 现代农业科技，2006（1）：99-100. 朴红梅，金成海，王景余，等. 转基因水稻研究及其生 物安全性问 [J] . 吉林农业科学，2005，30（1）：21- 24. 金忠明，徐敏华，王雷杰，等. 转基因技术与农产品安 全 [J] . 杭州农业科技，2006（6）：31-32. EFSA GMO Panel Working Group on Animal Feeding Tri－ als. 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