抗原抗体反应及应用

第七章 抗原抗体反应及应用 第七章 抗原抗体反应及应用 不论天然的还是人工合成的分子，只要能被机体的免疫系统识别的都可以诱导机体的免疫应答，产生相应的抗体。大多数抗体和抗原本身是既有免疫原性(诱发产生特异抗体)，又有反应原性(与特异的抗体相结合)。抗原与抗体的特异性反应不仅可以在体内进行，而且可以在体外进行。一切利用血清学技术方法所进行的各种测试都是基于这一根本的特性。抗体反应技术的应用之广泛已经远远超出了免疫学、医学、甚至生命科学的范围，成为—类微量，灵敏，快速的检测方法。本章着重介绍抗体制备，抗体抗原反应原理及技术方法的应用。 第一节抗体的制备 环境中的大部分生物(包括病原生物)及其产物分子和一些化合物对哺乳动物的免疫系统而言是外源抗原，这些抗原能通过侵染或其他的途径刺激免疫系统，产生以抗体为主的体液免疫应答。同样用抗原人工免疫实验动物，可以获得含有特异性抗体的血清，称为抗血清(antiserum)，因血清中抗体是多个抗原决定簇刺激不同B细胞克隆而产生的抗体，所以称多克隆抗体(polyclonal antibody)。一个B细胞克隆所分泌的抗体即为单克隆抗体。用免疫动物的B细胞与骨髓瘤细胞融合，在体外可以分离出许多单个B细胞克隆，以此方法可制备单克隆抗体(monoclonal antibody)。随着分子生物学技术的发展，已经可以用抗体基因文库(antibody combinatorial library)筛选制备单克隆抗体。应用基因工程技术，根据需要对抗体进行改造，获得基因工程抗体(engineering antibody)，以及催化性抗体(catalytic antibody 或abozyme)等的全新的抗体。 一、抗血清的制备 1．免疫动物 (1)抗原：免疫动物是制备抗血清的第—步。免疫所用的抗原可用病毒、细菌或者其他蛋白质抗原，如果使用半抗原如小分子激素等，必须与大分子载体连接，连接剂见表7—1。抗原的用量视抗原种类及动物而异，—次注射小鼠可以少至几个微克，免、羊甚至更大的动物每次注射的量就相应增加，从几百μg／次至几mg／次。 〔2)佐剂及乳化：佐剂可以帮助抗原在注射部位缓慢释放，以增加免疫刺激的效果。佐剂有完全和不完全佐剂之分。完全佐剂加有灭活的分枝杆菌(如卡介苗)或棒状杆菌。福氏佐剂可从试剂公司购买，也可用羊毛脂和石蜡油按1：2—4混合自行制备。佐剂与抗原按1：1的比例混合乳化为均匀的乳液，放置后不会发生油水分离。 (3)免疫动物：常用于制备抗血清的动物打豚鼠、家免、小鼠、大鼠等，如果大量生产可用动物羊、马等，动物接受免疫的乳液量小鼠为1．0—2．0 mL，家兔为2—4mL。抗原免疫动物的途径取决于动物种类、抗原特性和是否使用佐剂。腹腔注射(i．p)，肌肉注射(i．m)，皮内注射(i．d．)和皮下注射(s．c．)适合于任何抗原，这些途径主要刺激局部淋巴结发生免疫应答，初次免疫和免疫加强注射均可使用。静脉注射(i.v.)则只适合于可溶性抗原及分散的单细胞悬液，且不能使用佐剂，其诱发的免疫应答主要发生在脾脏。此外，在单克隆抗体制备时，亦可用脾脏直接注射或体外免疫方法，尤其对微量抗原比较实用。体外免疫方法也常用于人源单克隆抗体的制备。体外免疫时将脾细胞或外周血淋巴细胞(包括B细胞，T细胞及抗原递呈细胞)与抗原一起作体外培养，然后再与骨髓瘤细胞融合。初次免疫后要经过2—3次以上的免疫加强以保证能形成较高水平的IgC抗体。两次免疫注射之间的时间间隔，一般3—4周比较适合大部分动物，小动物可间隔10—14d，大动物则在2月左右。在免疫加强最后一次注射后的一周内采集抗血清，可获得高水平的抗体。 2抗血清的纯化与保存 （1）采血：加强免疫的动物2—3次后，可通过耳静脉或眼球(小鼠)采血，进行抗血清效价测定。当效价达到理想的高度后，可以采血。采血方式可以从心脏直接取血，也可通过动脉放血。待血液凝固后用针筒或吸管吸取血清。 (2)抗血清的纯化与保存：除抗体外血清中含有多种其他蛋白成分。为了避免这些蛋白质干扰抗体(免疫球蛋白)标记反应和抗原抗体反应，抗血清可经过纯化以获得单一的机体(常为IgG)组分。常用的纯化IgG的方法为饱和硫酸胺盐析和层析法。蛋白质在不同的盐浓度的溶液中，其溶解度不一样，盐离子干扰蛋白质和水分子间氢键形成，因为水—盐结合比水—蛋白质结合更稳定，蛋白质即可从溶液中沉淀出来。蛋白质分子越大，沉淀时所需盐离子浓度越低。免疫球蛋白(Mr 1.5×105)比血清中主要蛋白质白蛋白(M r 6.7×104)的分子大得多，抗体在30％—50％饱和度的硫酸盐中析出，而白蛋白需在70％—80％饱和度才析出，因此常用33％饱和度的硫酸胺纯化血清中的IgG。盐析时为了减少抗体变性，需在4℃进行，同时用pH8.0缓冲液稀释抗血清，以减少蛋白浓度过高而发生共沉淀。铵盐的溶解度不随温度变化而明显改变，0℃和25℃仅差3％，而钠盐则相差5倍，因此常在低温沉淀时用铵盐，室温沉淀用钠盐。铵盐对抗体的标记反应(如FITC和biotin标记时)有一定的干扰作用。 盐析法只能部分纯化抗体，更高纯度的抗体制剂可用层析法制备。 IgM五聚体相对分子质量达9.7×105，比血清中任何其他蛋白都大，用分子筛层析很容易将其纯化。IgG在PH 8．0时带负电荷，能与DEAE纤维素上的阳离子结合，因此可用离子交换层析来纯化IgG。IgG纯化最常用的方法为亲和层析。IgG与葡萄球菌A蛋白和链球菌G蛋白具合高度的亲和性，可用这两种蛋白质交联亲和层析柱将IgG纯化。大部分IgG与蛋白A结合PH为8—9，洗脱PH为2—4；而与蛋白G的结合PH为5—7，洗脱PH为9—10。C蛋白更适合于IgG的纯化，不但反应条件为温和的弱酸性或弱碱性，并且与IgG的结合力高于A蛋白。G蛋自能与大部分动物种类的IgG结合，而A蛋白对小鼠IgG1、大鼠IgG2b、人IgG3、马和绵羊IgG结合力弱或不能结合G蛋白和A蛋白均不能与鸡IgG结合。 抗血清或纯化的抗体在低温保存可维持活性数年，反复冻融使抗体很快失活，被细菌或霉菌污染的抗血清或IgG制品也易失去活性。稀释的抗血清加入防腐剂叠氮化钠和保护剂如BSA等可于4℃保存。长期保存常用等量甘油于—20℃以下冷藏。也可置于 50％饱和硫酸铵中4℃保存，还可以冷冻干燥保存。 3抗血清的特性鉴定 根据不同目的制备的抗血清，对其中所含抗体的浓度，特异性及免疫球蛋白种类的要求也不一样。为了获得质量和数量上合符要求的抗血清，在收集动物血清前必须对免疫效果进行检测，对收获后的抗血清也必须对—些参数进行分析，如效价、亲和力及交叉反应等。 根据不同的抗原性质选用合适的检测方法。最常用的为免疫沉淀，ELISA，放射免疫等。 效价又称滴度(titer)，是常用于表达抗血清中特异性抗体相对含量的—个半定量指标，即在给定的条件下，结合—定量抗原的抗血清的稀释度。抗血清经一系列稀释后(如倍比稀释)与定量的抗原反应，以能检测抗血清最大稀释倍数即为该抗血清的效价。不同的检测方法测定同一种抗血清的效价，灵敏度不一样，抗血清的效价也不一样，如沉淀反应(琼脂双扩散)与ELISA二者的效价相差甚大，后者远高于前者。放射免疫分析(RIA)常用于标记小分子抗原来检测抗血清的效价。 亲和力(affinity)表示抗血清与相应抗原的结合强度，是描述抗体持异性的重要指标， 常用亲和常数K表示。亲和常数K与抗原抗体反应的平衡常数有关： K+ Ag＋Ab AgAb K－ [AgAb] K+ K= K= [Ag][Ab] K－ 式中K+为结合速度常数，K－为解离速度常数。亲和常数K的测定见第二节 抗体特异性与交叉反应：抗体是特异的。只与相应抗原反应。实际制备的抗体却常有非特异性反应，这是因为抗原不纯造成的。多组分抗原之间存在共同的抗原决定簇，或者两个抗原决定簇结构类似能与同一抗体结合，均可出现抗体与异源抗原的交叉反应。用琼脂双扩散能简便直观地反映不同抗原与同一抗血清，或不同抗血清与同一抗原的交叉反应。 二、单克隆抗体的制备 1制备原理 单克隆抗体(MAb)与抗血清(又称多克隆抗体，PAb)最主要的区别是MAb为单一种B细胞克隆所产生的一种均一的免疫球蛋白分子。所以MAb是B细胞克隆的标志，是一种独特型的抗体，它的特异性是针对一个抗原决定簇的。制备单克隆抗体不能用化学分离的方法从多克隆抗体中去分离纯化得到它，而是用分离产生抗体的B细胞克隆的方法得到它。为了使B细胞克隆能在体外人工培养下长期存活并产生完全均一的MAb，G．KÖhler合Milstein于1975年创立了杂交瘤方法。所以制备单克隆抗体的技术又称杂交瘤技术(hybredoma technique)。 杂交瘤技术的基本原理是用分泌抗体但不能长期培养的B细胞与能在体外长期培养并可低温保存的肿瘤细胞进行杂交。筛选得到的杂交瘤细胞应该是既能分泌抗体又有瘤细胞的特性，可长期传代培养，又可在液氮中保存的细胞。把这些细胞单克隆化，用单克隆化的杂交瘤细胞进行单克隆抗体的生产（图7－1）。 2．B细胞与瘤细胞的来源及杂交瘤选择原理 最常用的单克隆抗体是小鼠的单抗，此外也有大鼠的和人源的单抗。人源单抗制备比较复杂。小鼠单抗的制备通常是使用Balb／c小鼠的B细胞和它的骨髓瘤细胞。大鼠的单抗制备通常用Lou／c大鼠及其骨髓瘤和Y3／AO大鼠及其骨髓瘤细胞(表7—2)。B细胞是从免疫动物的脾脏中分离出来的。动物免疫方法与抗血清制备相同，只是在制备脾脏前3d必须进行一次静脉加强注射以保证得到的B细胞有旺盛的分泌抗体的活性。骨髓瘤细胞有许多细胞株是经过诱变和筛选得到的缺陷型。筛选的是①瘤细胞本身不产生抗体或者产生抗体的某种链，但不能分泌；②是次黄嘌呤鸟嘌呤核苷酸转移酶(HGPRT)和胸腺嘧啶激酶(TK)的缺陷型。因为这种缺陷型的瘤细胞正常的核酸合成途径被氨基喋吟(aminopterin)阻断后，由于缺失这些酶，即使补充它的底物次黄嘌呤(H)和胸腺嘧啶(T)，核酸合成的旁路也不能起到救援的作用，结果导致瘤细胞死亡(图7—2)。而杂交瘤细胞因带有B细胞的全套基因，在HAT存在的条件下借助于HGPRT和TK的作用通过替代的核酸合成途径能正常合成DNA和RNA。所以杂交瘤能正常地生长繁殖而被选择出来。未被融合的游离的B细胞只能存活3d而后自行死亡。这就是用HAT培养基进行选择的原理。 3．细胞杂交与选择培养 (1)融合：细胞杂交之前，要分别准备好脾脏的B细胞悬液和小鼠骨髓瘤细胞(如SP2／0—Agl4细胞株)。免疫后的小鼠脾脏在无菌条件下破碎，将B细胞悬浮在没有血清的培养液中(通常使用RPMIl640商品配制)，并洗涤3次去掉小鼠的血清。SP2／0细胞是用加有10％胎牛或小牛血清培养的，每天更换新鲜培养液使成为对数分裂期生长旺盛的细胞。细胞用RPMIl640洗涤2—3次，把两种细胞合并在同—试管中，用50％的聚乙二醇(相对分子质量为1000—1500)作为融合剂，在37℃条件下融合l—2min。然后用1640培养液缓慢稀释，然后除去PEG，将细胞分散至HAT选择培养板中。电融合方法也可用于单克隆抗体制备，虽融合率较高，但一次融合的细胞数少，且需专门设备，故限制了其广泛使用。融合时脾细胞和骨髓瘤细胞的比例在5：1—10：1均可获得满意结果，每次融合细胞数量在107—108较为合适。融合后的细胞在40或96孔板上的HAT培养液(RPMIl640含10％—20％胎牛或小牛血清和HAT)中37℃，5％CO2条件下培养。融合后的细胞悬液中只有脾细胞和骨髓瘤细胞形成的杂交瘤细胞能在HAT培养基中生长，其他形式的融合细胞均不能生长．未融合的细胞也不能在HAT培养液中生存(表7—3)。 在融合后的细胞培养过程中，饲养细胞(feeder cell)有助于杂交瘤细胞的生长。饲养细胞可用同种动物的腹腔细胞或胸腹细胞。腹腔细胞中的吞噬细胞能清除死亡细胞碎片。使背景更为清洁“干净”。同时饲养细胞分泌的细胞因子或活性物质有助于杂交瘤细胞的生长。现有商品“杂交瘤细胞生长因子”可用于替代饲养细胞。 (2)阳性杂交瘤细胞的筛选与单克降化：杂交细胞经约10—14d培养后，形成可用的细胞集落(克隆)。经过几次更换培养液(HT培养液)后进行抗体活性检测。常用的筛选枪测方法是ELISA和凝集试验，前者常用于可溶性抗原，后者适用于细胞、细菌等表面抗原。此外，Dot－ELISA、免疫印迹及免疫荧光试验均可用于杂交瘤细胞的筛选。 使许多细胞克隆混合生长的细胞分离为单个的细胞克隆的过程称克隆化(colonization)最常用的单克隆化方法是有限稀释法(limited dilution)，即将混合细胞经稀释后分装于培养板 上，使培养板的大部分孔中只出现一个细胞。为了确保抗体分泌细胞来源于单个细胞，克隆化过程可重复进行，称为亚克隆化(subclonization)。除有限稀释法外，荧光激活细胞分拣法 (FACS)也用于杂交瘤细胞的克隆化过程。 4．单克隆抗体的扩大生产 产生特异性抗体的单克隆杂交瘤细胞株应立即扩大培养，以获得足够的细胞用于保存和生产可供应用的抗体。生产大量单克隆抗体的方法目前常用的有3种：小鼠腹水制备，大瓶培养和中空纤维反应器，前者多用于实验室制备，后二者适应于工厂化生产。 腹水制备：杂交骨髓瘤细胞在腹腔中定植，并产生大量腹水。选用与单克隆抗体制备所用相同的动物品系或者含有相同基因的Fl代杂交品系。杂交F1代品系更适合于腹水制备，如果用异源动物制备腹水时可选用无MHC限制性的裸鼠。用小鼠制备腹水时，先用矿物油或Pristane致敏，以抑制其免疫功能，利于腹水的形成。腹腔注射106—107个杂交瘤细胞，经过7—10 d后形成腹水。每只小鼠可获得3—5mL腹水，每mL含IgG抗体可达5—10mg。腹水中含有较多的杂蛋白和非特异性IgG，并且含有许多蛋白酶，易使抗体失活，因此腹水收集后应尽快纯化，以防止降解。 大瓶培养：采用1000mL或更大的摇瓶培养。大瓶培养上清体积大，但抗体浓度低，给抗体纯化带来很大困难，消耗人力和培养液，增加生产成本。 中空纤维反应器：是比较经济的单克隆抗体生产方法。该装置由具有半透膜性质的成束的微孔纤维组成，杂交瘤细胞位于纤维外部的小量培养液中，培养液在纤维的微孔中循环，供给营养和带走废物，抗体大分子和小分子化合物被隔开。高密度的杂交瘤细胞能在此系统中维持数月，每天可产生数百毫克的抗体，抗体浓度高，体积小易于纯化。 胎(小)牛血清一直是细胞培养所必须的，在单克隆抗体生产过程中培养液中的血清蛋白使抗体的纯化增加了困难，近年开发的无血清培养技术已逐渐用于单克隆抗体的生产中。 5．人单克隆抗体的制备 小鼠的单克隆抗体蛋白应用于人体后，作为抗原能引起人的免疫应答，大大降低其生物活性，并可能导致变态反应。因此人源单克隆抗体在临床治疗上有广泛应用前景，引起人们的普遍兴趣。但是人单克隆抗体制备存在许多技术上和伦理上的障碍，如人杂交瘤细胞系不稳定，有些抗原不能对人进行人工免疫，人B细胞只能从外周血中分离而无法从脾脏取得等。尽管如此，一些人源单克隆抗体已经获得，技术上也在逐步完善起来。 人的瘤细胞株U—266常用来与人外周血B细胞融合以获得人源单克隆抗体。另一些淋巴母细胞抹(LCL)则来源于EB病毒转化的淋巴细胞，如GMl500，W1—L2和ARH77等也用于杂交瘤细胞的制备。这些细胞系表现ED病毒核抗原(EBNA)阳性，且形成的杂交瘤细胞抗体的分泌水平不高。 获得人单克隆抗体的另一方法是用EBV直接转化某些抗体分泌细胞，使之成为“不死”的细胞在体外培养。EBV感染人B细胞后，病毒基因插入人B细胞基因组中，有1％的细胞转化为“不死”的细胞。B细胞转化可通过“病毒驱动”和“细胞驱动”两种方法获得。前者是将B细胞与分泌EBV的B95—8细胞系一同培养，后者则是与EBNA阳性的LCL细胞一同培养。“细胞驱动”转化的B细胞比较稳定，抗体分泌能力也较强。 人淋巴母细胞系和人杂交瘤细胞较难获得，人单克隆抗体也可以通过异源杂文的办法制备，即将EBV转化的B细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，将获得的异源杂交瘤细胞再与免疫后的B细胞融合，得到人单克隆抗体分泌细胞，不产生自身免疫球蛋白，EBVA也是阴性。 三、基因工程抗体的制备 1．抗体的化学修饰 抗体Fc段用双功能连接剂与荧光素，同位素，酶，发光化合物，稀土元素以及药物，毒素等连接后，并不影响其Fab功能区与特异性抗原结合。根据交联物的性质不同，标记的抗体可用作诊断试剂，也可作为药物的定向载体，引导药物或毒素到达抗原存在部位使药物或使毒素发挥更有效的作用，即俗称“生物导弹”。从而减少药物、毒素、同位素、酶在肿瘤治疗过程中引起严重的副作用，大大提高治疗肿瘤的效果。 许多毒素如蓖麻毒素，白喉毒素，天花粉，红豆毒素等均为蛋白质或糖蛋白，可用双功能剂与抗体相连；吗啡，前列腺素，氨甲喋吟，磷酸酯酶C等含有羧基能用碳二亚胺(EDC)，混合酸酐法与抗体的氨基形成酰胺键；同样，含脂肪胺的药物如庆大雷素，阿霉素在水溶性EDC的作用下与抗体的羧基连接；而含芳香胺的药物则先在低温下与亚硝酸作用形成重氮化合物，再与抗体分子上的酪氨酸或组氨酸残基形成偶氮键。总之通过抗体的化学修饰把抗体的特异性用到定向给药和定位检测上。 2．抗体基因文库 抗体基因文库(antibody recombination library)是将不同的重链和轻链基因随机组合，克隆到合适的表达载体中，在原核细胞表达不同的抗体，形成一个抗体库，从这个抗体库中，用抗原可以筛选到相应的抗体基因(图7—3)。抗体基因来源于杂交瘤细胞或动物B细胞(免疫或未免疫)的DNA和mRNA 。 用质粒作为抗体文库的载体，虽然也可能表达有活性的抗体分子或片段，但由线状噬菌体表达更为方便有效。M13、fd、F1等噬菌体的外壳蛋白由5种蛋白组成：pⅢ、pⅥ、pⅦ、pⅧ和pⅨ。每种含量不一，其中pⅧ含量最多，每个噬菌体有2700个pⅧ亚基，其余4种蛋白仅5个拷贝。增加噬菌体外壳蛋白的长度并不影响噬菌体的装配，抗体以融合蛋白的形式表达于噬菌体表面。噬菌体表达质粒常用的有fd－CAT1、fd－tet－DOG1、PHEN1、pComb3和pComb3H等。抗体融合蛋白构建多用pⅢ和pⅧ，pⅧ拷贝数高，低亲和力的抗体蛋白容易筛选出来。 在噬菌体表达抗体时，常常不表达完整的抗体分子，（因为CH2上不能进行糖基化）。根据不同的引物得到重链的VH或VHCH1区，轻链的VL或VLCL区。VL和VH两个片段用一短肽作连接片段，形成单链可变区（single－chain fragment variable，scFv）；VHCH1和VLCL两片段则形成Fab片段。另外，单独的VH和VL也能结合抗原，如果二者形成同源或异源 二聚体(dAb)，则稳定性和亲和性明显提高(图7—4)。此外在抗体片段DNA末端加上一些功能蛋白(如碱性磷酸酶和蛋白毒素)的基因，则表达的抗体就带有一定生物活性功能片段，可用于检测或治疗。如果在抗体基因末端加上终止子(TAG)则表达的抗体片段是可溶性的，而不是结合在噬菌体表面。 用特异性抗原免疫的动物B细胞构建抗体的噬菌体文库，抗体亲和性高，用与免疫抗原不同的抗原筛选得到的抗体亲和性普遍较低。可用模拟天然体细胞突变的方法来提高亲和力。如混杂重组法，即将己获得的轻链或重链的V片段切下，再克隆至随机的文库中的V区构成二级文库，使H链和L链混杂，可以使抗体片段的亲和性提高。利用PCR错配将随机突变引人至抗体的抗原结合区，也能提高对抗原的亲和力。先用低亲和力的载体在噬菌体的PⅧ表达，筛选后、将抗体基因片段PCR扩增转至PⅢ上表达，可获得高亲和力的抗体片段。 抗体基因文库有两个优点，一是从不适合进行人工免疫的物种获得单克隆抗体，如人源单克隆抗体；二是可快速方便获得单克隆抗体。 3．抗体基因的改造 将鼠源抗体的V区基因与人源抗体C区基因重组，获得的嵌合抗体(chimerical antibody)，可保留鼠抗体对抗原的高亲和性，又减弱鼠源抗体对人的免疫原性，提高治疗性抗体的效果。 重组的嵌合抗体基因转化骨髓瘤细胞或中国地鼠卵细胞(CH0)，可在其中表达。为了进一步地消除鼠抗体V区框架区(FW)的异源性，可实行CDR移植(CDR grafting)，以获得与鼠FW类似的人FW结构的嵌合抗体。 噬菌体表达的抗体仅含V区(scFv)或Fab片段，缺乏Fc区，使抗体的稳定性下降，半衰期缩短，与Fc受体结合功能也消失。因此在抗体功能片段的末端连接A蛋白、酶、细胞因子、CD4和毒素等分子，既可增加抗体片段的稳定性，又可发挥某些生物学活性功能。 用抗体基因工程方法获得的抗体与效应分子交联物比用化学交联法具有优点：可以大量生产，不会因修饰作用影响抗体及效应分子的活性，效应分子还可根据需要进行改造。 此外在抗体片段的末端连接一段特异的双亲性螺旋(amphiphilic helixes)结构，如亮氨酸拉链结构(leucine zipper)，可使单价的scFv或Fab片段在体内或体外形成稳定的双分子聚合体，从而提高抗体片段的亲和力。此法也可用于制备双特异性抗体。 4．基因工程抗体在真核细胞中的表达 噬菌体表达的抗体片段常常是在原核细胞(E.coli)中完成。原核系统表达抗体片段产量 高，成本低，快速易于操作。但抗体片段在原核表达系统中不能进行CH2糖基化，从而影响抗体的活性。因此重组抗体基因片段可转移至适合的骨髓瘤细胞系或哺乳动物细胞系(如CHO)，甚至于植物细胞中表达，可以得到与淋巴细胞表达相同的抗体分子。免疫球蛋白IgA 的重链和轻链及分泌片基因可以分别转化不同的植株，将表达这些蛋白的植株进行有性杂交，在杂交后代中可以装配成完整的IgA双分子。以植物作为生物反应器进行抗体的表达已有许多成功的研究报道，与动物细胞相比更为经济，具有广泛的应用前景。 四、催化性抗体的制备 1．抗体催化的原理 1986年，由P．G．schultz和R．A．Lerner分别领导的两个小组同时证明抗体具有催化活性。针对一个四面体带电荷的磷酸酯半抗原产生的抗体，能有选择性地催化相应的碳酸脂和羧酸脂的水解反应。他们将这种有催化活性的抗体称为催化性抗体(catalytic antibody)，又称抗体酶(abozyme)。催化抗体的作用取决于底物分子水解时的转换态(transition state)(图7—5)。转换态的分子结构是分子活化后的一种结构状态，处于转换态的分子具有最高的活化能，分子表现极性。处于这种状态的分子也是最不稳定的，能与这种分子结合的酶或者抗体会使某些化学键发生断裂(如酯键，碳键，胺键等)起到酶解作用。可见抗体酶的作用与天然的蛋白质酶非常相似。抗体酶也表现出对底物的专一性，对立体结构的专一性。在饱和动力学与竞争性抑制方面都与常规酶相似。所以抗体酶的发现打破了只有常规酶才有的分子识别和加速催化反应的传统概念，为酶工程学开创了新的领域。 2．抗体催化的化学反应 由抗体催化的化学反应特异性高于酶，但催化速率低于常规的酶，只有l03—106倍。但有一些未发现催化剂的反应，如Diels—Alder反应也能被抗体催化。常规酶一般不能催化胺键水解，抗体酶能使胺键水解的速度增加25万倍。讫今为止，已发现和证明的由抗体催化的化学反应不下40种。 3．催化性抗体的制备 抗体酶是抗原决定簇处于转换态结构的抗体。因为转换态分子极不稳定无法制备抗体，所以催化性抗体的获得主要是通过设计稳定的转换态的类似物作为半抗原，与载体蛋白交联后，免疫动物，获得针对半抗原的抗体，从中筛选具有催化活性的抗体。筛选催化性单克隆抗体所用的ELISA与筛选一般抗体的方法不完全一样，应根据催化反应的特点而进行适当的修改。经典的方法是先筛选出与底物或半抗原结合的抗体，然后从中再筛选出有催化活力的抗体，这种方法费时费力。利用催化性抗体对底物的催化活性，对底物进行适当修饰，使催化反应的产物可直接表现抗体的催化活性，这样可以简化检测步骤。 转换态类似物半抗原的设计，必须了解催化反应的转换态模型的结构特点。催化抗体的抗原结合位点上与转换态互补的某些催化基团的形成，能稳定转换态分子。此外有人把单克隆抗体分子用化学修饰方法引入一些活性基团，提高催化性抗体的催化与亲和效率。应用噬菌体抗体文库也可以筛选催化性抗体，可省去制备转换态类似物的复杂过程，直接用底物从文库中筛选有催化活性的抗体片段。如用半抗原免疫后制备的文库或文库经过多次混杂重组，则可以得到更高的亲和力的催化性抗体。抗独特型抗体也用于催化性抗体的制备，用酶作为抗原免疫小鼠获得能够封闭酶活性位点的单克隆抗体，将这个抗体用蛋白酶除去Fc片段，用Fab免疫其他品系的小鼠或家兔，得到的抗体具有相应的酶催化活性。 从理论上看，B细胞具有全套免疫球蛋白的多样性的胚系基因，当然也包括有催化作用的自身抗体在内。然而1989年Paul W.首次报道了人体的一种能催化蛋白质水解的免疫球蛋白。它是—种自身抗体，能水解血管活性肠肽(vasoactive intenstinal peptide，VIP)的Glnl6—Met17键。用VIP作为抗原能得到有催化作用的单克隆抗体，也能催化Glnl6—Met17键。大约有17％的人有这种自身抗体酶，但患有气喘的病人中该抗体与VIP的亲和力比健康人高50倍。由于VIP是一种气管松弛剂，因此有人认为这种VIP自身抗体的长期作用可能与气喘的过敏应答有一定关系。由此推测除了人工设计催化抗体以及发现的自身催化抗体外，用筛选单抗的方法，也有可能找到所需要的催化抗体。 第二节 抗原抗体反应原理 抗体能特异性地识别相应的抗原，并与之结合。这种结合在体外也能发生，这种特性就是许多免疫检测方法的基础。抗原与抗体相互作用是非共价的，可逆的，其特性符合许多化学反应的基本原理。但因为抗体分子的结构特点，以及抗原分子结构的多样性，使抗原抗体结合反应表现出复杂性。 一、抗原抗体作用的热力学与动力学 1．溶液中抗原抗体的化学平衡 抗体与抗原的结合是非共价结合，二者在结构互补适应的基础上通过范德华力(van der Waals force)、静电引力、氢键和疏水作用等次级键相互作用。因为结合是可逆的，结合与解离的强度在—定条件下取决于抗原与抗体的亲和力。如果以S代表抗体结合位，即互补位(paratope)；以L代表抗原决定簇；以SL代表抗原与抗体的复合物，则抗原(Ag)与抗体(Ab)在溶液中的反应如下： K+ K+ Ag＋Ab AgAb 即S＋L SL K－ K－ Kα＝[SL]/[S][L]＝K+/ K－ 抗原抗体结合形成的复合物的浓度为[SL]，游离的抗体结合位的浓度为[S]，抗原决定簇的浓度为[L]。在反应早期复合物形成很快，一定时间后逐渐慢下来，直至复合物的形成与解离达到平衡(图7—6)。此时抗原抗体复合物的浓度[SL]与游离抗原表位的浓度[S]和游离抗体结合位的浓度[L]之比Kα是平衡常数，又称为内在结合常数，或称内在亲和力(intrinsic affinity)。K+和K－分别为结合和解离反应速度常数。 在恒定的条件下，如温度、pH、离子强度等一定时，Kα是一个常数。改变抗原或抗 体的浓度，复合物的浓度也相应改变以达到新的平衡，在一定范围内如果[S]与[L]增加2倍，则[SL]应该增加4倍，但实际上会少于4倍，因为Ag—Ab复合物的浓度[SL]是抗原抗体的一部分。如果上述浓度都以摩尔浓度mol／L表示，则是Kα的单位为浓度的倒数(L／mol)。如抗体的Kα在107—1012 L／mol为高亲和力抗体，Kα低于107 L／mol为低亲和力抗体。 如果以解离常数(Kα)描述抗体的亲和力，比Kα更简单方便，Kd为Kα的倒数，即Kd＝1/Kα，单位为mol/L。Kd值越大亲和力越小，Kd越小亲和力越大。 2．抗原抗体反应的自由能变化 抗原抗体反应的自由能改变与Kα相关：ΔF0＝—RTln Kα，Kα＝e－ΔFˊ/RT，这里R＝摩尔气体常数[8.31J／(mol·K)]；T＝绝对温度；ln＝自然对数；e＝自然对数的底数；ΔF0＝标准的自由能变化，规定ΔF0＝1molS与1mol L形成1mol S—L时自由能的变化。负号表示自由能为负的变化。 从上式可以估计：当抗原抗体结合亲和力增加l0倍，则1n10＝2．303，37℃(3l0．15K)时的ΔF0＝5.94KJ／mol，温度低于37℃时ΔF0更小。这种自由能变化还不足单个氢键的能量(约18．81KJ／mol的1／3。即使亲和力非常高，Kα＝1010L／mol，ΔF0只有5．94KJ／mol，仅相当于3个氢键的结合能。当抗原与抗体间形成氢键时，水的氢键被破坏，因此每个氢键的净能接近于4.18KJ／mol。由此可见抗体与抗原结合时，吸力与斥力几乎相等，即使在很高亲和力下，也只有几个千卡的微小差别。因而ΔF的轻微增加会导致抗原抗体结合的亲和力增高，这就不难理解当抗原结构发生某些微小改变(如化学修饰)时，会引起抗原抗体的亲和力的很大变化。 自由能对Kα的影响取决于温度，然而自由能本身也受温度的影响： ΔF 0＝ΔH 0－TΔS 0 ΔH 0 为焓变，ΔS 0为熵变，T为绝对温度。Kα随温度的变化如下: dlnKα /dT=ΔH 0 / RT2 或dlnKα/d(1/T)= ΔH 0 /R 当氢键和极性键形成时，较大的负焓变驱动放热，亲和力会随温度的增加而下降。因此抗原抗体相互作用在4℃比在25℃或37℃有更高的亲和力，可见在给定的浓度下，最大眼度的结合在较低温度下达到的。相反，非极性或者疏水的相互作用受到熵的影响，TΔS 0和ΔH 0接近于零，所以这时温度对亲和力影响较小。 3.抗原抗体反应的动力学 抗原抗体反应达到平衡时的参数测定在实际操作时是困堆的。反应完成90％，只需几分钟或几小时，而从90％至99％则需几倍的时间，而欲达到99．9％完成时所费时则更长，因为此时的[Ag]和[Ab]已减少到极低的水平。测定一些参数在反应的早期或者未到平衡时是可行的，利用动力学可以计算出抗原抗体反应的特征性参数，用以描述抗原抗体反应的规律： K+ Ag（S）＋Ab(L) AgAb （SL） K－ 结合反应速度＝K＋·[S]·[L]·M-1·S-1 解离反应速度=K-·[SL]·S-1 达到平衡时，则K+·[S]·[L]＝K-·[SL] Kα＝K+／K- Kα＝K+／K-表明相同亲和力的抗体，其结合速度常数和解高速率常数并不一致。如果 K+和K-均很大则抗原抗体复合物形成很快，但不稳定；而K+和K-均小时抗原抗体复合物 形成较慢，但很稳定。前者适合于亲和层析，后者适合于标记分析。 抗原抗体结合成复合物后解离的速度常数(K-)取决于结合键的强度。已知抗体的亲和 力和结合速度常数K+，根据动力学基本公式Kα＝K+／K-可以计算解离常速度数K-。 例如抗葡萄球菌核酸酶的抗体对酶蛋白抗原的亲和力是8.3×l08L／mol，结合速度常数K+＝4．1×l05 L／(mol·s)，比对半抗原的结合常数低。由公式Kα＝K+／K-计算得到K-＝4.9×10-4 L／(mol·s)。然后根据公式t1/2＝1n2／K-，计算半解离期(half－time for dissociation)，得到该抗体与抗原复合物的半解离期为23min。了解抗原抗体复合物的半解离期便可知道结合物在多大的时间范围内稀释而不影响结合物的解离，这对在免疫亲和层析等许多其他免疫方法的应用中有重要意义。 抗原抗体反应的速度在很大程度上取决于抗原分子和抗体分子的扩散速率及碰撞的机 率。扩散速度常数用下式表示： Kdl＝4∏αD(6×1020) α为抗原和抗体分子半经之和(单位为cm)；D为反应系统中抗原和抗体分子的扩散常数 之和(单位为cm2／s)；6×1020为转换数，为了把单位转换为L／(mol·s)。例如α＝10-6cm，D＝10—7cm2／s，Kdl=7.5×108L／(mol·s)。通常大的蛋白抗原比半抗原与抗体结合的速率要慢，大部分蛋白质的结合速度在105—106L／(mol·s)，而理论上限为109 L／(mol·s)。 二、抗体与单价抗原的作用 1．抗体亲和力的测定 抗体亲和力的测定的方法常采用作图法。抗原抗体反应最简单的情况是单克隆抗体与单 价抗原的反应，如半抗原与单克隆抗体或单克隆抗体与大分子抗原上单一的非重复的位点(抗原决定簇)的作用。以最简单的单克隆抗体与半抗原反应为例的作图法，首先用平衡透析 (equilibrium dialysis)(图7—7A)来测定—系列游离抗原及结合抗原的浓度。根据不向抗原浓 度进行平衡透析所获得的结合抗原，游离抗原。抗体浓度是已知的。根据这些数据，进行 Scatchard分析，即可计算出Ka的值(图7—7B)。 Scatchart分析方法是将Ka＝[SL]/[S][L]分子和分母都除以抗体的浓度，[SL]/[Ah]=r,r 代表每个抗体分子结合的抗原(单价)分子数[S][L]/[Ab]=[S]/[Ab].[L]＝(n—r)C，[S]/[Ab];表示每个抗体分子上未被抗原占有的游离抗体结合位的浓度。这—浓度实际上是抗体分子上等于全部抗体结合位(n)减去以被抗原占据了的结合位数。因为用的是单价抗原，因此也就是减去结合的抗原分子数r，即(n—r)。这里的n实际上代表抗体的价数。C在这里代表抗原的浓度[L]。由此得到公式： 当固定抗体的浓度用不同浓度的抗原进行一系列的平衡透析实验，得到一系列相应的r数据，然后根据以r/C对r作图。如果所用抗体是均质的（单克隆抗体），r/C与r的关系为线性关系，它的斜率即为亲和力Ka（图7－7B）。从公式可见，当抗原的浓度很大的r/C≈0， 所以Ka（n－r）＝0或Ka·n=Ka·r,由图7－7B可见横坐标r的截距就等于抗体价n。 2．亲和力的异质性 当与单价抗原结合的抗体是多克隆抗体时，其Scatchard图呈非线性关系(图7—7B)。由 于多克隆抗体来源于多个细胞克隆，其内在亲和力不同。内在亲和力的平均值Ko常用于表 示异质的多克隆抗体的亲和力，Ko为抗体结合位点1／2被占据时的游离抗原浓度。 3．抗体结合抗原的特异性——半抗原反应 抗体与单价半抗原反应的特异性极强，半抗原上化学基团的细小差别或位置的改变，则与抗体的反应性会表现明显的差别(图7—8)。抗体与同源抗原(homologous antigen)反应最强，与异源抗原(heterologous antigen)反应相对较弱。有些抗体与异源抗原的反应比同源强，称为变态抗体(heteroclitic antibody)。抗原分子表面或末端的一些突出的基团，具有免疫优势，是抗原决定簇的主要结构，影响决定簇的特异性。抗体的抗原结合部位是疏水的，微溶于水的三硝基苯半抗原与相应抗体形成亲和力很高的复合物，而水溶性很高的糖类、有机离子(如苯甲酸盐)只能与抗体结合形成低亲和力的复合物。 三、抗体与大分子多价抗原的反应 1．多抗原决定簇——大分子抗原的特征 能与一个抗体结合的大分子抗原的特异性部分称为抗原决定簇(antigen determinants)。一个大分子抗原常常有多个抗原决定簇而成为多价抗原。抗原决定簇的序列结构已清楚的称为抗原表位(epitope)。半抗原相当于一个抗原决定簇。大分子抗原上含有多个抗原决定簇能与相应的特异抗体结合。在一些情况下，决定簇之间相距较远的各自与抗体结合而互不影响，这种决定簇是不重叠的决定簇。当一个抗体与某一决定簇结合后，在空间上干扰了其他抗体与相应决定簇的结合，这些靠得较近的决定簇称为重叠决定簇。在少数情况下，前一抗体的结合导致抗原结构的空间变化，影响了另外抗体的结合，称为变构效应(allosteric effect)。 许多大分子如蛋白质、核酸、复合多糖常常形成重复结构，因而每个分子内有多个相同的抗原决定簇。颗粒性抗原细胞、细菌及病毒等还可形成多亚基聚合物，也可产生重复的抗原决定簇，成为多价的(multivalent)抗原。单抗原决定簇的分子即半抗原可吸附在固相载体上，其结构也类似多价抗原，如ELISA中的包被抗原，其结合特性和溶液中单价抗原有所不同。 2．抗原抗体的亲和力和亲合力 单价抗原与抗体反应取决于亲和力(affinity)的大小，而天然多价抗原与小分子半抗原不同，含有1个以上的抗原决定簇，因此能与1个以上的抗体结合。如果没有空间限制，对重复的多价抗原分子，一个IgG或IgE分子有两个结合位点，而—个IgM有10个结合位点。对任何一个位点的亲和力是不变的，总的结合强度包括抗体上所有的结合位的亲和力，抗体对抗原分子总的结合强度，称为亲合力(avidity)。亲合力大大强于每一位点的亲和力，其强度增加不仅仅是亲和力的简单相加，而是呈几何级数上升的。因此，一个低亲和力的IgM分子，或者多个低亲和力的IgG分子对一个多价抗原的结合是相当紧密的。 3．抗体与多价抗原结合的浓度带现象 抗体与单价抗原形成的复合物都是可溶性的，但抗体与多价抗原形成的复合物大多数能形成沉淀。沉淀反应可用于研究抗体与大分子抗原结合的特性。用非蛋白大分子(如多糖)抗原与相应抗体形成的沉淀，其中只有抗体是蛋白质，为抗体的定量测定提供了方便。在一定量的抗体中，逐渐增加抗原浓度，沉淀的形成与抗原抗体的比例密切相关。图7—9是典型的单特异性沉淀曲线。沉淀反应的曲线分为3个区：抗体过量区，抗原与抗体形成小分子复合物，不形成沉淀或沉淀很少，称为前带(pro－zone)现象；抗原过量区，虽然没有游离的抗体，但沉淀仍很少，称为后带(post—zone)现象；在抗原抗体等带区(equi—zone)形成大量沉淀，也没有游离的抗原和抗体存在。如果抗原是多抗原决定簇的多价抗原如细菌、细胞、乳胶颗粒等表面，则形成凝集反应。 抗原抗体相遇时，不管二者比例如何，很快发生特异性结合，一般在几秒钟内完成，称为初级反应阶段。初级反应没有可见的沉淀。从特异性结合到可见沉淀形成称为次级反应阶段。这阶段通常需要更长的时间，从几分钟到几小时甚至几天，才能看见沉淀。次级反应除受抗原抗体浓度比例影响外，pH值、离子强度和补体的存在也影响沉淀的形成。 抗原抗体形成沉淀的机理，用Marrack等人提出的网格理论可得到合理的解释。抗原—抗体的结合包括许多抗原与许多抗体相互连接形成网格。当这些聚合物达到一定大小时，便从溶液中沉淀出来。抗体分子大多为二价(1gG)，而大分子抗原一般是多价的，一个抗体可以与两个抗原上相同的决定簇结合，一个抗原分子也能与多个抗体分子结合，从而形成相互交联的网格发生沉淀。而抗原或抗体过量时，不能形成网格，故不发生沉淀。反应系统中存在多种抗原抗体反应称为多特异性系统，它与单特异性反应不同，在沉淀最多时．悬液中仍有过量的抗原或抗体，这是因为一个独立的反应中，过量抗原会与另—个独立的反应的过量抗体重叠的结果。此外，在一些反应系统中，即使抗原抗体比例合适，也不形成可见的沉淀、这是因为抗体的亲和力很低，或者抗体的双价结合位点只结合一个大分子抗原，称为单配双价结合(monogamous bivalent binding)，或者抗体的双价结合位结合了同一个抗原分子的重复的决定簇。在上述这些情况下无法形成网格结构，这类抗体称为不完全抗体(incomplete antibody)。 4．交叉反应 大分子抗原常常含有多个抗原决定簇，部分抗原决定簇与另一大分子上的抗原决定簇相同，当用此类抗原免疫后所获得的抗体既可以与同源抗原结合，又能与异源抗原结合。 抗体与同源抗原的亲和力通常比异源抗原要高得多，所以反应较强。少数交叉反应用低亲和力的抗体比用高亲和力抗体更能显示出来，如抗多糖抗体一般亲和力较低，易表现交叉反应。低亲和力抗体往往是因为其抗原结合位特异性低，易与结构类似的抗原反应。用免疫沉淀尤其是凝胶双扩散方法能非常容易地鉴定交叉反应，并且根据沉淀线形成的类型判断几种抗原间的交叉反应关系。 第三节 常见免疫分析方法 免疫分析方法是利用抗原与抗体特异性反应的特性对抗原或抗体进行量或质的测定分析。这类分析方法具有特异、灵敏和快速的特点，有的可以表现出一个氨基酸分子的差异，如用单克隆抗体进行检测的方法；测定的量可以达到μg甚至ng的水平，如ELISA法，放射免疫法等；反应在几小时，几分钟甚至更短的时间可以看到测定的结果，如免疫沉淀法等。这类免疫分析的方法可以用于医学，免疫学中抗原抗体的分析(包括病原的诊断，免疫细胞表面分子的检测等)，而且可以广泛的用于生命科学的几乎各个领域，甚至于食品科学，环境科学及分析化学等更为广泛的学科领域。 一、免疫沉淀 1．溶液中的沉淀反应 在体外当抗体与相应抗原二者浓度比例适当时，会发生免疫沉淀(immuno－precipitation)反应，表明两者之间有特异性反应。免疫沉淀反应广泛用于抗原或抗体的定性及定量分析。在液相中形成的沉淀不易观察判断，利用抗原和抗体溶液之间的界面形成的沉淀线便于判断，即环状沉淀试验(ring precipitant test)(图7—l0)。沉淀试验可以在玻璃管中进行，将小试管或毛管的底部加入抗原溶液，在上层轻轻铺上不同稀释倍数的抗体溶液，勿使界面破坏，为了使界面更好地形成，常在下层抗原溶液中加入10％的蔗糖或甘油。抗原抗体溶液置于37℃或4℃孵育后，在界面上形成白色沉淀线。玻片上沉淀的形成必须在显微镜下观察。 2凝胶扩散沉淀 抗原抗体可在半透明的半固相介质中进行沉淀实验。抗原分子和抗体分子在凝胶介质中自由扩散形成浓度梯度，抗原与抗体在比例合适的一定扩散部位相遇形成沉淀线。凝胶沉淀可用于测定抗原或抗体的相对浓度，也可用于比较不同抗原的特异性、纯度及相互关系。最常用的方法为单向免疫扩散(radial immuno diffusion )和双向免疫扩散(double－immuno diffusion)。 单向扩散法又称Mancini法，将适当浓度的抗体混于琼脂(0．8％—1％)中，琼脂凝固后，打成小孔，加入抗原，抗原由小孔开始向周围扩散，并在小孔周围合适的位置形成沉淀环。沉淀环的面积与抗原浓度呈正相关。通过与已知抗原浓度形成的沉淀环面积进行比较，可确定被测抗原的浓度(图7—11)。单扩散常用于测定血清中IgG、IgM、IgA及补体的含量。单扩散法的特点使用抗体浓度大，当抗原浓度低于5—10μg／mL则不适用。 双扩散法又称为Ouchterlony法，在琼脂板中抗原和抗体分别从相邻的孔中向四周扩散，在抗原孔和抗体孔之间二者比例合适的部位形成沉淀线。琼脂双扩散常用于分析抗原间的血清学关系和抗体间差异，相邻孔中不同抗原与同一抗血清反应形成的沉淀线形状的变化显示抗原间是否存在共同的抗原决定簇。当两个抗原完全—致时，两条沉淀线完全融合(图7—12A)；如果两个抗原无共同抗原决定簇而抗血清中有针对两种抗原的抗体时，沉淀线互不干扰，呈交叉状(图7—12B)；当两个抗原只是部分抗原决定簇相同，还有其他不同的抗原决定簇，则沉淀线在后者一方形成突出的小刺(图7—12C)。此外，根据抗体或抗原的不同，可形成其他不同特征的沉淀线。Ouchterlony法灵敏度不高，形成沉淀线需较长时间(18—24h)。但在抗原分析方面很有实用价值。 3．免疫电泳 免疫扩散沉淀形成需较长时间，且灵敏度低。免疫电泳（immuno－electrphoresis）是利用蛋白质在凝胶中电泳迁移率不同能被分离开来的特性与免疫扩散结合一起进行分析的方法。这种方法能提高分辨率和灵敏度。混合的蛋白质抗原在PH 8．6时带负电荷，在电场的作用下，由负极向正极迁移，使混合的抗原组分得以分离，而抗体可以通过自由扩散，也可以通过电泳与分离的抗原形成相应的特异性沉淀线。从而提高免疫沉淀的灵敏度。常见的免疫电泳方法有血清免疫电泳，火箭电泳和对流免疫电泳(又称电渗析)。 传统的免疫电泳即指血清免疫电泳，将抗原混合物(病人血清)在凝胶中用电泳分离后，沿电冰方向挖一平行的小槽，加入抗血清，进行双扩散。沉淀线的特点显示病人血清与正常人血清存在的差异，即血清蛋白组分的缺少或增加(图7—13)。 火箭电泳(rocket electrophoresis)，为单向免疫扩散与电泳结合的一种方法。已混合有抗体的凝胶上，做一小孔，加入抗原，电泳后，沿着电泳方向形成火箭型沉淀线，沉淀线的高度与抗原量成正比(图7—14)。火箭电泳可用于定量测定，例如用于测定人血清中的甲胎蛋白。 此外，将火箭电泳与血清免疫电泳相结合进行双向免疫电泳(two—dimensional immuno—elcctrophoresis)先将血清经电泳分离后，切下转移至另一已加有抗血清的凝胶上，进行第二次电泳，形成的沉淀线呈连续的火箭样。第二次电泳方向与第一次电泳方向互相垂直(图7—15)。 对流免疫电泳(counter immuno—elcctrophoresis)又称电渗析。在电场作用下抗原向正极迁移，而抗体在同样的电场环境中，因电渗作用向负极移动，二者在两孔之间形成抗原抗体沉淀线(团7—16)。对流免疫电泳法有微量快速的特点，常用于医学检验。 二、免疫标记 1．放射免疫分析 放射免疫分析法(radio—immunoassay，RIA)的应用始于60年代末，广泛用于激素、药物等小分子化合物的定量分析，是灵敏、可靠的免疫分析方法之一。常用来标记抗原或抗体的同位素有125I，131I，3H和35S。放射活性的检测液相反应体系用液体闪烁仪计数，而固相体系可用X射线胶片显影。 125I为γ射线(0.035meV)，131I有硬β射线(0.608meV)和γ射线(0.36meV)两种，半衰期为60 d，放射性碘标记常用氯胺T法(chloramines—T)。氯胺T是氯代酰胺类氧化剂，在水中不稳定，产生的氯离子将碘离子(I-)氧化为单质碘(I2)，单质碘与抗原或抗体分子上的苯丙氨酸及酪氨酸残基的苯环或组氨酸的咪唑基共价相连，使之发生碘化反应： 氚(3H)因其放射性损伤小(软β射线、0.0185meV)，物理半衰期长(12—26年)而生物半衰期短，属低毒型放射性同位素，用于标记免疫分子更合适。常用N—琥珀酰亚胺[2，3—3H]丙酸酯标记抗原或抗体分子，其活泼酯基易和蛋白质的游离氨基反应： 标记反应完成后，需除去未反应的放射性试剂和其他产物，一般用电泳，沉淀，离子变换层析，高压液相层析及超速离心等方法将标记物纯化，但最方便的方法是凝胶过滤，透析及超滤。 放射标记的抗原或抗体可直接用于抗原抗体反应，形成的抗原抗体反应复合物，用第—抗体或聚乙二醇沉淀分离后，测定其放射活性．用于定量抗原或抗体。为了提高灵敏度，应用竞争法进行抗原或抗体定量，其放射活性与被测抗原或抗体呈反比(图7—17)。 2．酶联免疫吸附试验 同位素标记的免疫分析方法，虽然有较高的灵敏度，但同位素具有不稳定，需要特殊设备。安全性差，废物处理麻烦等缺点限制了其使用。非放射性标记方法逐步得到发展，其中酶标记免疫试验是广泛使用的方法。因酶促反应使测定的结果被放大，反应的灵敏度接近放射免疫分析法。用于标记的酶的种类也越来越多，较常用的有碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase)、β半乳糖苷酶β—galactosidase)和脲酶(urease)等。 酶免疫试验法(enzyme immunoassay，EIA)有两类方法，一类为均相法，即抗原与抗体反应后，不必将结合的与游离的抗原或抗体分离，就可测定被测分子的含量。如酶放大免疫分折技术(enzyme multiplied immunoassay，EMIT)，将小分子抗原连接在酶分子的活性位点附近，当抗体与这些抗原结合后，封闭了酶催化位点，使酶失去活性。如果被测溶液中元相应抗体，则酶能催化底物形成产物。同一标记物也可以竞争方式检测抗原的含量，另一类为固相法，即将抗原或抗体吸附在固相表面，如聚苯乙烯微量板，磁珠等表面，抗原与抗体反应后，将固相与液相分离除去游离的抗原或抗体，而结合的抗原或抗体上被标记的酶仍保持活性，催化底物形成有色产物，即酶联免疫吸附试验(enzyme—linked immunosorbent assay，ELISA)。 ELISA有直接法、间接法及夹心法等不同反应方式。