血清白-球分离wang

null实验 血清白蛋白、γ-球蛋白的纯化及鉴定分离实验 血清白蛋白、γ-球蛋白的纯化及鉴定分离实验目的:实验目的:综合应用盐析、离心、色谱、电泳、分光等技术来分离纯化及鉴定特定蛋白质.主要方法主要方法 盐析 凝胶色谱 离子交换色谱 电泳预处理粗分级基本程序细分级鉴定脱盐基本原理:基本原理:1. 首先利用盐析作血清蛋白的初步分离：在半饱和硫酸铵溶液中，球蛋白沉淀，离心后上清中主要含白蛋白。 2. 利用凝胶色谱脱盐： 葡聚糖凝胶G-25柱色谱将蛋白中盐成分（硫酸铵）除去。 3. 采用阴离子交换色谱进一步纯化蛋白： 在DEAE纤维素离子交换色谱上，对经过初步分离并脱盐的血清白蛋白、γ-球蛋白样品分别上柱、洗脱，进行进一步纯化。 4. 纯度鉴定： 利用醋酸纤维薄膜电泳进行鉴定。 1. 盐 析1. 盐 析原理: 当高浓度盐存在时，蛋白质往往凝聚并析出沉淀。该技术为“盐析”。 不同的蛋白质在不同浓度的盐中形成沉淀。在半饱和硫酸铵溶液中，血清球蛋白会沉淀，经离心后，可与白蛋白分离开。 影响因素：PH、温度、蛋白质纯度等。 逐渐改变硫酸铵浓度可分段盐析出不同的蛋白。操作步骤操作步骤 取0.5mL 血清，边摇边缓慢滴入0.5mL饱和硫酸铵,混匀后室温下静置10min,在台式高速离心机上10000r/min离心10min,取上清为白蛋白粗分离样品；沉淀加入0.5mL蒸馏水，振摇溶解，为球蛋白粗分离样品。2. 脱 盐2. 脱 盐 盐析后的粗分离样品中含有硫酸铵离子成分， 样品中含有过高的离子浓度会影响离子交换层析的效果，所以在用离子交换层析进行细分级前需要脱盐。 凝胶色谱法是一个温和而又快速的脱盐方法，同时可将蛋白质转换到用于离子交换层析的低离子强度缓冲液中。 2. 脱 盐2. 脱 盐凝胶色谱是以凝胶为固定相，当混合物随流动相经过凝胶色谱柱时，各组分因分子大小不同而被分离。 null操作步骤操作步骤0.02M NH4AC平衡葡聚糖G-25凝胶柱 调节流速 上样 检测收集分离组分 柱再生平衡:用0.02M NH4AC流洗，用BaCl2检测，无沉淀后继续洗30mL.色谱注意事项色谱注意事项避免样品稀释. 勿使洗脱液面低于色谱床面，避免干燥. 加样轻柔，勿冲散床面. 避免样品丢失（注意加样后随时检测） 色谱柱必须再生、平衡3. 纯 化3. 纯 化离子交换色谱是蛋白质提纯中广泛应用的方法之一。它是以离子交换剂为固定相，利用蛋白带电部分与具有相反电荷的离子交换剂吸附强弱的不同，而将混合物中的不同蛋白进行分离的色谱技术。 null阳离子交换剂具有带负电荷的酸性基团作为离子交换基团，能吸附流动相中的阳离子。 阴离子交换剂具有带正电荷的碱性基团作为离子交换基团，能吸附流动相中的阴离子。 null++++++AC- AC- AC- AC- AC- AC- 0.02M NH4AC++++++蛋白样品---------++++++++AC- AC- AC- AC- AC- AC- NH4+ NH4+0.06-0.3M NH4AC--得到纯化的γ-球蛋白得到纯化的白蛋白（γ-球蛋白带正电）白蛋白,α、β 球蛋白带负电阴离子交换剂操作步骤操作步骤用0.02M NH4AC 缓冲液平衡。 上样（球蛋白粗分级组分） 检测收集γ-球蛋白 (当洗脱体积为10mL时） 收集3管，每管10滴。取其中浓度高的一管用于鉴定操作步骤操作步骤0.02M NH4AC缓冲液平衡 上样（白蛋白粗分级组分） 用0.0６M NH4AC缓冲液洗脱α、β-球蛋白（洗脱体积30mL) 用0.３M NH4AC 缓冲液洗脱白蛋白 检测收集白蛋白分离组分 (当洗脱体积为4mL时） 柱再生平衡：先用20mL 1.5M 的NaCl-0.３M NH4AC洗脱，再用40mL 0.02M NH4AC 洗脱平衡。null20%磺基水杨酸，检查流出液中是否含有蛋白质。 10g／L BaCL2检查收集液中有无S02-4 。 4. 电泳鉴定4. 电泳鉴定醋酸纤维薄膜电泳：以醋酸纤维薄膜为支持物，在pH=8.6的巴比妥缓冲液中，血清蛋白的PI均小于8.6，带负电荷，电泳时向正极移动。由于迁移率不同而被分离。 醋酸纤维薄膜是一种由醋酸纤维加工制成的一种细密且薄的微孔膜。null操作步骤： １．准备与点样 2. 电泳 （点样面朝下，100V 1h） ３．氨基黑10B染色2cm粗糙面