未成熟大鼠缺氧缺血性脑白质损伤细胞内游离钙离子含量的变化及意义

http://www.paper.edu.cn - 1 - 中国科技论文在线 未成熟大鼠缺氧缺血性脑白质损伤细胞内 游离钙离子含量的变化及意义# 石晶，姚裕家* 基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金（20070610107） 作者简介：石晶（1975 年出生），女，主治医师，主要研究方向：新生儿缺氧缺血性脑损伤. E-mail: shijing@scu.edu.cn （四川大学华西第二医院儿科，成都 610041） 摘要：目的：了解未成熟大鼠缺氧缺血性脑白质损伤中细胞内钙离子含量的变化。：2 日龄大鼠应用单侧颈总动脉结扎+缺氧方法制备脑白质缺氧动物模型。缺氧缺血后 12h、24h、 48h、72 h 分别制备脑白质细胞悬液，用 Furo2/AM 荧光探针和双波长荧光分光光度计检测 脑白质细胞内游离 Ca2+浓度变化。统计方法采用成组 t检验和单因素方差分析。结果： PVL 组新生 SD 大鼠脑白质细胞内 Ca2+浓度与对照组相比，12 小时开始升高，持续至 72 小时仍高 于正常水平，P均<0.05。结论：新生 2日龄大鼠缺氧缺血后脑白质细胞内 Ca2+浓度显著增高， 随着时间的延长增高趋势越明显。缺氧缺血后脑白质细胞内 Ca2+浓度增高可激活一系列的细 胞损伤途径，损害细胞。 关键词：儿科；脑白质；新生大鼠；缺氧缺血；钙 中图分类号：R33 The change and the significance of the cellular free calcium concentration in the white matter of newborn rats sufferred from hypoxic-ischemic brain damage SHI Jing, YAO yujia (Department of Pediatrics, West China Second University Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041) Abstract: Objective：To detect the cellular free calcium concentration of the PVL groups at various time post-HI and to discuss the significance of calcium-loading.Methods: PVL model was generated in 2 day-old rats by UCL-hypoxia(6% oxygen for 4 hrs) in the experimental groups, and sham surgeries were performed on the control groups without hypoxia.Use spectrophotofluorimetry and Fura 2/AM to detect the cellular free calcium concentration of the PVL groups at 12h, 24h, 48h, 72h post-HI and that of the corresponding control groups. One-way ANOVA and t test were used to analyze the data.Results: The cellular free calcium concentration increased in the PVL 12h group, and continue to increase until PVL 72 h group compared with the control groups, P<0.05.Conclusions: The cellular free calcium concentration increased in the white matter after HI, which suggest that the calcium overloading may activate factors that may cause cell injury and death. Key words: pediatrics; cerebral white matter; newborn rats; hypoxia-ischemia; calcium 0 引言 Ca2+广泛存在于细胞和体液中，它的平衡在细胞多种生理生化反应过程中起重要作用。 细胞内Ca2+浓度的变化是机体生理功能所必需，但是Ca2+超载可以引发细胞损害。Ca2+在细 胞内的超载是引起围产期缺氧缺血性脑损伤的重要途径。细胞内Ca2+的内流可激活一系列蛋 白酶途径，损伤细胞。本实验的目的是测定缺氧缺血后不同时间点细胞内游离Ca2+含量，了 解Ca2+变化情况，为进一步的研究和干预提供实验室理论基础。 http://www.paper.edu.cn - 2 - 中国科技论文在线 1 材料及方法 1.1 材料 1.1.1 动物 2 日龄 SD 大鼠由由四川大学华西医学中心实验动物中心提供。 1.1.2 材料： Fura-2 /AM（日本同仁化学研究所），Pluronic F-127 促溶剂（日本同仁化学研究所）， DMSO（Sigma 公司，美国），TritonX-100（Amerisco，美国）。 1.2 方法 1.2.1 PVL 模型的制备及分组： PVL 动物模型参考我们以前建立的模型方法[1]。2 日龄 SD 大鼠 48 只，清洁级，体重 6-8 克，动物随机分组。PVL 组（n＝24）：缺氧缺血后 12h，24h，48h，72h 组，各组均为 6 只；对照组（n=24）：行假手术，时间段与 PVL 组配对。 1.2.2 大鼠脑细胞悬液制备， 参照 Dildy 等方法[2]，上述各时段大鼠过量乙醚麻醉后断头，分离右侧大脑，以不含钙 镁的冰冷 Hanks 平衡盐溶液(HBSS)(mmol/L, glucose 6, KCl 5， NaCl 137, Na2HPO4 0.3， HEPES 10， pH 7. 4)冲洗，仔细剥离脑膜、血管，去除脑皮质、小脑和脑干；不含钙镁的 HBSS 液冲洗 3 次后剪碎，置于 20mL 含 0. 125%胰蛋白酶的不含钙镁 HBSS 中，于 37℃消 化 8min，以冰冷的含 10%牛血清 HBSS (mmol/L，glucose6，MgSO4 1，KCl 5，NaCl 137， CaCl2 1，Na2HPO4 0. 3，HEPES 10, pH 7. 4)终止反应；组织块以吸管轻轻吹打 20 次后过 200 目筛网，滤液以 1000 rpm /min 离心 5min，再以 HBSS 冲洗一次，最后细胞悬于含 10%小牛 血清的 DMEM 中；台盼蓝排斥试验检查，细胞存活率在 95%以上；将上述细胞悬液分为样 品管和空白管，37℃预温 5min，样品管加入终浓度为 5μmol /L 的 Fura-2 /AM（含 0.02％ Pluronic F-127），对照管加等量的 DMSO，37℃恒温搖床避光振荡孵育 50min；负载后的细 胞以 D-Hanks 液洗一次,最后细胞悬于 HBSS 中调整细胞到 2×106 个/mL 分装数管，每次测 钙浓度前再以 D-Hanks 液离心洗一次，然后于 37℃复温 5min。 1.2.3 细胞内 Ca2+检测 细胞内钙离子浓度测定采用日立F-2000双波长荧光分光光度计。将负载有Fura-2 /AM的 细胞悬液1 ml加入双波长荧光分光光度计的专用石英杯内，测定荧光强度变化.。测定参数为: 结合钙 Fura-2检测参数：激发光波长340nm，发射光波长为510nm；游离Fura-2检测参数：激 发光波长380nm，发射光波长为510nm。激发狭缝为5nm，发射狭缝为10nm。激发波长下的最 大荧光Fmax由加入终浓度为0. 2%的TritonX-100 测得，最小荧光Fmin由加入终浓度为8mmol/L 的EGTA(pH > 8. 5)获得，每次测钙浓度前先测定两激发波下测得的细胞悬液的自发荧光值 （Fb）。根据Grynkiew icz公式[3] [Ca2+]i=Kd[(F-Fmin)/(Fmax-F)]计算细胞内游离Ca2+浓度 http://www.paper.edu.cn - 3 - 中国科技论文在线 （nmol/L）。公式中Kd为Fura-2和Ca2+结合的平衡解离常数，Kd = 224nmol/L； F＝（F340- Fb340） /(F380- Fb380), Fmin=（F340min- Fb340）/(F380min- Fb380)， Fmax=（F340max- Fb340）/(F380max- Fb380)。 1.3 统计 统计方法采用成组 t 检验和单因素方差分析 q 检验。统计分析工具为 SPSS10.0 软件包。 P<0.05 为具有统计学差异。 2 结果 对照组和PVL组细胞内游离Ca2+浓度以 x ±SD示，统计分析结果见表1。 结果显示，各时点对照组间细胞内Ca2+浓度差异无统计学意义（F＝0.413，P=0.746）。 PVL各时点组细胞内钙离子浓度与对照组相比，有显著差异（P<0.05），PVL组各时点之间 Ca2+浓度也有显著差异（F＝256.40，P=0.000）。将PVL组和对照组各时间点均数变化趋势 作4th拟合曲线（图1），可见随着缺氧缺血后时间的延长，细胞内钙离子浓度增加，表明钙 离子内流增加。 表1 各组大鼠脑白质细胞内游离Ca2+浓度 Tab.1 the cellular free Ca2+ concentration in the white matter of rats 对照组 （nmol/L） （ x ±SD） PVL组 （nmol/L） （ x ±SD） t P 12h (n=6) 121.19+0.28 144.31+2.35* -9.30 0.000 24h (n=6) 129.96+2.41 149.22+2.20* -14.5 0.000 48h (n=6) 130.70+3.22 166.65+1.94* -23.43 0.000 72h (n=6) 130.16+2.73 179.39+3.20* -27.26 0.000 图 1 PVL 组和对照组各时间点细胞内游离 Ca2+浓度均数的 4th 拟合曲线 Fig.1 the 4th curve of the cellular free Ca2+ iron concentration means of PVL groups and control groups 3 讨论 神经细胞内Ca2+浓度的增高是通过三种途径来实现的，通过电压依赖型钙离子通道[4]， 受体门控型钙离子通道，以及细胞内线粒体和内质网储存Ca2+的释放。细胞内Ca2+稳定的维 持对于生命活动至关重要，机体依赖于以下机制维持细胞内外Ca2+梯度相对稳定： 细胞膜 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 12h 24h 48h 72h 缺氧缺血后时点 PVL 组 对照组 http://www.paper.edu.cn - 4 - 中国科技论文在线 上Ca2+ 泵的外排作用；细胞膜上Ca2+和Na＋的交换，有赖于Na＋－K＋泵所造成的细胞内高Na ＋梯度；内质网对Ca2+的储存；线粒体对Ca2+的储存。任何可以导致钙离子通道激活或排钙 系统失活的因素都可导致细胞内Ca2+超载。 我们的实验表明，新生大鼠缺氧缺血后脑白质细胞内钙离子浓度显著增高，并随着时间 的延长，这种增高趋势越明显。谷氨酸的释放，钙离子通道的激活，细胞器储存的Ca2＋ 释 放都可导致细胞内Ca2＋浓度的增高。其中，缺氧缺血条件下脑内过量的谷氨酸的堆积是Ca2 ＋内流的主要原因。谷氨酸所致细胞内钙离子增高的机制包括：激活Ca2＋通透性的AMPA受 体亚单位；激活电压敏感性的Ca2＋通道；诱使细胞排Ca2＋和/或避免钙离子内流系统失活[5]。 缺氧缺血后脑白质细胞内Ca2+浓度增高的原因和意义各不相同。星形胶质细胞既表达L 型电压依赖型通道，也表达T型电压依赖型通道[6]。在缺氧缺血时，星形胶质细胞细胞内钙 离子浓度增高早期是通过L型电压依赖型通道，晚期通过T型电压依赖型离子通道来实现， 而谷氨酸门控型通道和钙池释放途径在星形胶质细胞钙离子内流中几乎不起作用。Na＋－ Ca2+交换器对星形胶质细胞具有保护作用，这些特征是新生脑白质星形胶质细胞所特有的。 星形胶质细胞内钙离子浓度增高不但可致星形胶质细胞死亡，而且可导致TNF的释放，损伤 少突胶质细胞。星形胶质细胞也表达功能性AMPA受体，缺氧缺血时也可导致AMPA受体的 激活，但是星型胶质细胞AMPA受体激活与细胞内Ca2＋增高无关，它的意义在于通过破坏离 子调节导致白质损伤[7]。 谷氨酸受体，特别是AMPA受体可能是少突胶质细胞钙离子内流的主要途径。研究显示， 在缺乏细胞外钙离子的情况下，AMPA对体外培养的少突胶质细胞无损害作用，表明AMPA 损害细胞是通过钙离子的内流来实现的，而这种钙离子是来自外来的钙离子而非自身储备的 钙离子[8]。缺氧缺血可导致晚期少突胶质细胞前体细胞内钙离子浓度增高，电压门控型钙离 子通道阻滞剂硝苯地平（nifedipine）、尼莫地平（nimodipine），和Na+-Ca2+交换泵抑制剂 苄普地尔(Bepridil)都对缺氧缺血性晚期少突胶质细胞前体细胞损伤无保护作用[9]。Fern等人 [10]研究发现，表达O4阳性的少突胶质细胞在缺氧缺血1分钟后细胞内钙离子浓度显著增加， 并持续上升5－10分钟至平台期，继而发生细胞膜完整性的丧失，细胞死亡。而这种细胞内 钙离子浓度的增高可以被AMPA受体拮抗剂CQBN所抑制，NMDA受体拮抗剂MK-801对细 胞无保护作用，说明少突胶质细胞内钙离子的内流与AMPA受体相关。当细胞内钙离子为零 或AMPA受体被拮抗剂所阻滞时，没有明显的晚期少突胶质细胞前体细胞死亡。 神经细胞内钙超载的可导致细胞死亡，机制在于：1.通过激活细胞内一系列Ca2+依赖性生 物化学过程导致细胞损伤或死亡，主要机制有以下几个方面 ：①激活水解酶类，如激活磷 脂酶A2引起细胞膜磷脂水解，同时生成花生四烯酸，进一步代谢生成自由基，破坏质膜完整 性。②激活蛋白酶calpain，水解结合在细胞骨架和结构蛋白上的肽类及膜蛋白，如神经元的 微管和神经细丝，破坏细胞骨架。③激活核酸内切酶引起DNA断裂，导致细胞凋亡。④激 活一氧化氮合酶促进NO的生成，NO与O作用生成毒性更大的超氧亚硝基阴离子，加重细胞 损伤。⑤ 激活蛋白激酶，如蛋白激酶C和钙调蛋白激酶类，诱导即刻早期基因(如c-fos, c-jun， c-myc等)和应激基因(如热休克蛋白-70)表达，这些基因和其他多种基因共同参与细胞死亡或 生存的调控。蛋白激酶C激活后可增加谷氨酸释放，进一步促进兴奋毒性。2. 导致线粒体渗 透性改变。Ca2+非常高时，线粒体成为Ca2+主要缓冲系统。当线粒体内膜对小离子和分子渗 透性增加是神经细胞死亡的指征。线粒体渗透性改变造成线粒体内膜对小分子质量的溶质 (<1.5×103)渗透性大大增加。渗透性快速的改变引起膜的去极化，去耦联，线粒体内离子释 放，新陈代谢中间体和大量线粒体肿胀。3.导致线粒体功能障碍。细胞内钙超载可引起线粒 http://www.paper.edu.cn - 5 - 中国科技论文在线 体膜的损害，使线粒体储钙机制受损，ATP分解加速，线粒体膜肿胀，嵴断裂，严重时引起 线粒体钙化，这是不可逆损伤的一个征象。上述改变导致线粒体产生ATP能力的丧失，此时 线粒体释放Ca2+ ，同时释放细胞色素C和自由基 ，细胞色素c是线粒体内呼吸链的重要组成 之一。细胞色素C异位到胞浆后参与caspase-3的激活，导致细胞凋亡。 4 结论 本文给出了以下结论：新生2日龄大鼠缺氧缺血后脑白质细胞内钙离子浓度显著增高， 并随着时间的延长，这种增高趋势越明显。脑白质细胞内钙离子浓度的增高可以激活一系列 的细胞损伤途径，损害细胞。 [参考文献] (References) [1]石晶，姚裕家，李晋辉等.未成熟大鼠实验性脑室周围白质软化动物模型的建立及评价[J]. 实用儿科临床杂志，2006，21（19）：1330-1332 [2]DILDY JE，LESLIE SW. 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