RNA

null RNA 的 制 备 与 分 析 RNA 的 制 备 与 分 析nullRNA： 天然的RNA并不象DNA那样呈双螺旋结构，而是单链线形分子。只有局部区域为双螺旋结构（约占RNA分子的50%）。 RNA分子中的核苷酸至少75个，多的可达数千个。nullRNA的分类： （1）信使RNA（mRNA） （2）转移RNA（tRNA） （3）核糖体RNA（rRNA） （4）小RNA（snRNA）常用的RNA分析方法：常用的RNA分析方法：（1）RT-PCR（Reverse Transcription PCR）（反） 逆转录聚合酶链反应 （2）原位杂交（In situ hybridization） （3）Northern Blot （4）RNA斑点和狭线杂交一、RNA的提取与纯化：一、RNA的提取与纯化：（一）控制RNA酶的活性： 1、控制污染： （1）专用的RNA操作室、专用器械。 （2）操作时戴手套。 （3）实验用器皿、吸头、离心管应为新的。 （4）所配制的水溶液，尽可能用DEPC（焦碳酸二乙酯）处理。null2、已污染RNA酶的器具的处理 （1）在180℃的高温下干烤8小时或更长时间。 （2）氯仿冲洗。 （3）双氧水（3%）浸泡。 （4）0.1%DEPC水浸泡。 3、常用的RNA抑制剂：3、常用的RNA抑制剂：（1）焦碳酸二乙酯（DEPC）：和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应，抑制酶的活性。 （2）异硫氰酸胍：最有效的RNA酶抑制剂。在裂解组织细胞的同时，也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中分离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用. （3）氧钒糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，与RNA酶结合后几乎能完全抑制RNA酶的活性。 （4）RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：可以和多种RNA酶结合，使其失活。 （5）其它：SDS、尿素、硅藻土等（二）RNA的提取：（二）RNA的提取：常用的RNA提取方法： 异硫氰酸胍法、盐酸胍法、RNAzol (Trizol)法。 RNAzol法的特点：方便、快速、得率高。 但所用试剂价格贵，仅适用于小量提取。Trizol法提取组织中总RNATrizol法提取组织中总RNA1、取新鲜组织约50-100mg，加入1ml Trizol，室温充分匀浆，静置5分钟。 2、加入0.2ml氯仿，振荡15秒，静置2分钟。 3、4℃，12000g×15分钟，取上清。 4、加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10分钟。 5、4℃，12000g×10分钟，弃上清。 6、加入1 ml 75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。 4℃，7500g×5分钟，弃上清。 7、晾干，加入适量的DEPC水溶解（65 ℃促溶15分钟）。 8、定量：在紫外分光光度计上测定OD260和OD280。 RNA电泳：RNA电泳：1、变性胶配制 2、RNA样品处理（变性） 3、电泳 4、紫外灯观察null（三）RNA的纯化：（三）RNA的纯化： 采用Oligo dT-纤维素，从总RNA中分离出mRNA。该法利用mRNA 3‘末端有Poly（A）的特点，在总RNA流经寡聚（dT）-纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下， mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度洗脱时，mRNA被洗脱下来。一般而言，经过二次Oligo dT柱后，可得到较高纯度的mRNA。二、RNA分析：二、RNA分析：（1）RT-PCR（Reverse Transcription PCR）（反） 逆转录聚合酶链反应 （2）Northern Blot （3）原位杂交（In situ hybridization） （一）RT-PCR：（一）RT-PCR：原理：提取组织细胞总RNA，以其中的mRNA为，采用olig-dT或随机引物，在逆转录酶的作用下反转录成cDNA。再以cDNA作为模板，通过特异性引物，PCR扩增目的基因。 应用：分析基因的转录产物；获取目的基因；合成cDNA探针；构建RNA高效转录系统。 方法：方法： 提取组织或细胞总RNA→紫外定量→逆转录合成cDNA→PCR扩增→电泳→摄像→光密度扫描→图像分析nullnull3、注意事项：3、注意事项：（1）RNA的质量 （2）非特异性扩增，设阴性对照 （3）平台期 （4）内参 （看家基因 housekeeping gene） （5）DNA污染 （二）原位杂交：（二）原位杂交：原理：含有互补顺序的标记DNA或RNA片段（探针），在适宜的条件下与细胞内特定的DNA或RNA形成稳定的杂交体。 应用：观察目的基因或mRNA 在细胞中的定位；半定量分析其含量变化。探针（ probe）：探针（ probe）：定义：核酸探针是指能与特定核酸序列发生特异性互补的已知核酸片段。一般而言，核酸探针带有特殊的标记物。 常用的核酸探针： （1）双链cDNA； （2）单链cDNA； （3）合成寡核苷酸；（4）单链cRNA。探针所携带的标记物应具备的条件：探针所携带的标记物应具备的条件：（1）标记后的探针的分子结构要尽可能与原来的分子结构相同，绝不影响其碱基配对特异性，不影响探针分子的主要理化特性，尤其是杂交特性。 （2）标记探针的检测方法简便、省时、准确可靠、重复性好、灵敏度高。 （3）稳定性好、环境污染少、价廉。常用的探针标记物：常用的探针标记物：1、放射性同位素： 3H、32P、35S、125I等。 2、非放射性同位素： 地高辛素、辣根过氧化酶、碱性磷酸酶等。 null直接法：用放射性同位素、荧光素、酶标记的探针与细胞内靶核苷酸形成杂交体，通过放射自显影、荧光显微镜或成色的酶促反应直接显示结果直接法：用放射性同位素、荧光素、酶标记的探针与细胞内靶核苷酸形成杂交体，通过放射自显影、荧光显微镜或成色的酶促反应直接显示结果 间接法：用半抗原标记探针，最后采用免疫组织化学法对半抗原定位，间接显示探针与靶核苷酸形成的杂交体。间接法：用半抗原标记探针，最后采用免疫组织化学法对半抗原定位，间接显示探针与靶核苷酸形成的杂交体。 方法：方法：1、玻片： 洗→酸处理→冲洗→烤→粘附剂 常用的粘附剂：多聚赖氨酸、明胶、3-氨丙基三乙氧硅烷（APES）。 原位杂交专用玻片。 2、取材、固定： （1）保持细胞结构；（2）最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平；（3）使探针易于进入细胞或组织。 null3、组织切片的处理： （1）脱蜡：石蜡影响探针的穿透性。 （2）去污剂处理：增加组织通透性。 （3）蛋白酶消化：使经固定后被遮蔽的靶核苷酸探针的杂交能力。 （4）酸酐和酸处理：防止探针与组织中碱性蛋白之间的静电结合，以降低背景。 （5）杂交缓冲液孵育：阻断载玻片或组织标本中可能与探针产生非特异性结合的位点，以降低背景。 （6）内源性生物素和酶的抑制：防止假阳性。null4、杂交： （1）探针长度：以50-300bp为宜。 （2）探针变性：95℃，5-10分钟。 （3）探针浓度： 放射性同位素: 0.5ng/μl; 非放射性同位素2ng/μl。 （4）杂交温度：应低于杂交体融解温度（melting temperature， Tm）20-30℃。一般以42℃为宜。 （5）杂交时间：18-24小时。 null5、杂交后处理： 去除未参予杂交体形成的过剩的探针，除去探针与组织标本之间的非特异性结合，以降低背景。 6、对照试验 阳性、阴性、组织对照。nullnull null（三）Northern Blot :（三）Northern Blot : 原理：RNA经过变性琼脂糖凝胶电泳分离后，转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上，经过杂交，分析mRNA的大小及含量。 应用：半定量分析mRNA的含量；确定mRNA分子的大小。 方法：提取组织细胞总RNA→RNA定量→变性胶电泳→转膜→干膜→预杂交→杂交→洗膜→压片→洗片→图像分析变性胶的制备：变性胶的制备： 琼脂糖0.2g，加入DEPC水12.4ml，加热熔化，稍冷后加入5×甲醛凝胶电泳缓冲液4.0ml、37%甲醛3.6ml，混匀、制胶。待胶凝固后，置1×甲醛凝胶电泳缓冲液中预电泳5分钟。RNA样品制备：RNA样品制备： 取总RNA 4.5μl（约20-30μg），加入5×甲醛凝胶电泳缓冲液4.0μl、37%甲醛3.6μl、甲酰胺10 μl，65℃温育15分钟、冰浴5分钟。加入EB（1 μg/μl ）、上样缓冲液2μl 。电泳：电泳：1、上样，50V电泳（5V/cm）。 2、电泳结束后将胶块置于紫外灯下观察RNA的完整性，18S、28S条带的位置。 nullnullnullα-32P cDNA探针标记： （1）取模板DNA 25ng在离心管中。变性，冰浴。 （2）dNTPmix制备：dGTP、dATP、dTTP等量混合。 （3）将下列反应成份混合，加入上述离心管中： dNTPmix 2.0μl、 BSA 1.0μl、 5×Buffer 5.0μl、 Klenow 酶1.0μl、 α-32P-dCTP 2.5μl。 加入双蒸水适量，使反应总体积达25μl，轻轻混匀。室温下反应1小时。 null注意事项：注意事项：（1）RNA的完整性。 （2）转膜完全。 （3）探针标记的效率、变性。 （4）防同位素污染。 （5）压片曝光时间。null