猪蓝耳病免疫抗体监测问题探讨

猪蓝耳病免疫抗体监测问题探讨 金颜辉*1 黄盛兴2 黄雁1 洪英1 林芬1 杨得胜1 吴波平1 魏良宇1 （1 福建省动物疫病预防控制中心 350003；2 建瓯市小松镇畜牧兽医站 353111）   摘要：一组实验猪场应用PRRS灭活疫苗免疫猪场生猪，采集同一份猪血清ELISA试剂盒，测不出免疫抗体（0∕14），金标检出阳性率（9∕14）64.28％；另一组用进口减毒活苗免疫的同一份猪血清ELISA检出阳性数百分百（16∕16），金标检不出（0∕16）。另一实验猪场灭活苗两次免疫，金标检出阳性率（16∕21）76.19％，ELISA检不出；活疫苗两次免疫， ELISA检出阳性率（16∕21）76.19％，金标检不出。结论不同疫苗免疫效果，用不同检测，结果差异很大。   关键词：猪蓝耳病，抗体，监测   猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由PRRSV引起的一种高度接触性的传染病，以引起母猪繁殖障碍、仔猪和育成猪呼吸道症状及高死亡率为主要特征。该病于1987年首次在北美发现[1]，之后在世界范围内迅速传播，我国于1996年首次分离到该病毒[2]，最近几年PRRSV也已成为我国重要的猪传染病病原之一。特别是2006年出现变异毒株后，对我国养猪业造成了更加严重的危害和经济损失[3]。 　　针对目前我国猪蓝耳病疫苗免疫后抗体水平监测中存在的一些问题，我们应用猪蓝耳病金标试纸条及进口ELISA试剂盒，对经猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗（NVDC-JXA1株）和进口减毒活疫苗免疫后采集的猪血清进行比对实验。 　　免疫程序为： 18日龄分两组免疫，灭活疫苗组免疫20天后采血清样检测，同一份血清检测结果：灭活苗免疫组ELISA检测血清抗体滴度检不出（0∕14），金标检出阳性率（9∕14）64.28％；进口减毒活疫苗用同样免疫程序，采血清样检测ELISA检出阳性率百分百（16∕16），金标检不出。另一猪场实验结果：免疫程序为 疫苗两次免疫间隔两周，二免后28天采血样检测，灭活疫苗免疫的ELISA检不出（0∕21），金标检出阳性率（16∕21）76.19％，活苗免疫的ELISA检出阳性率（16∕21）76.19％，金标检不出；金标检测中的3份阴性ELISA检测是阳性， ELISA检测中的3份阴性金标检测是阳性。 1 与方法 1.1 材料   选取两处健康猪场，经猪蓝耳病弱毒疫苗及灭活疫苗免疫后，采血，按常规方法分离血清，备检。 1.2 试剂盒   猪蓝耳病抗体检测试剂盒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Antibody Test Kit）购自IDEXX公司；猪蓝耳病金标试纸条来自本中心福建省科技厅（2007）重大科技项目专题二“福建省畜禽重大疫病诊断及防治技术研究”课题组提供。 1.3 操作步骤 1.3.1 ELISA试剂盒：按试剂盒#说明#，应用猪蓝耳病抗体检测试剂盒对采集的猪血清进行抗体检测，步骤如下：血清用样品稀释液进行40倍稀释，浓缩洗液恢复到室温后混匀并用去离子水做10倍稀释。在试剂盒自带96孔板的C1、D1、C2、D2中加入100ul未稀释的阴性对照样品，在A1、B1、A2、B2孔中加入100ul未稀释的阳性对照样品，被检样品各加两孔，每孔100ul。室温孵育30min，甩去液体，每孔用洗液300ul清洗3-5次。每孔加入100ul酶标抗体，室温孵育30min。甩去液体，每孔用洗液300ul清洗3-5次。每孔加入100ul TMB底物溶液，室温孵育15min。加入100ul终止液并读取OD650nm。按试剂盒给定计算公式进行判定。 1.3.2 猪蓝耳病金标试纸检测   按说明书要求，于金标试纸条的加样孔中加入血清80-100ul，将试纸条平放于桌面上，在室温下静置15分钟后判定结果。 2 结果 2.1 两个试验猪场免疫程序为： 18日龄免疫灭活疫苗和死苗，20天后采血清样检测； 灭活疫苗和死苗两次免疫间隔两周，二免后28天采血样检测。 2.2 检测结果 3分析讨论 3.1 由于高致病性猪蓝耳病的细胞免疫及体液免疫机理不十分明朗；疫苗免疫后中和抗体、干扰素和细胞免疫之间的相关关系复杂。猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫后抗体监测使用的方法不同，得出的结论不同，甚至得出完全不同的结论， 导致对免疫保护效果的评估产生误判。从猪场疫苗使用临床效果上观察，用高致病猪蓝耳病NVDC-JXA1株试制的疫苗和弱毒疫苗都有较好的免疫保护作用。 3.2 猪繁殖与呼吸综合征的编码病毒ORF2—ORF7是病毒基因组的结构基因，是主要编码病毒的功能性蛋白。IDEXX ELISA试剂盒包被的是重组N蛋白。有实验表明，感染PRRSV后机体首先产生的是针对N蛋白的抗体，表达量达20-40%以上，且可持续半年以上[4-5]。灭活疫苗（NVDC-JXA1株）免疫后，重组N蛋白包被ELISA试剂盒对免疫抗体检出率之所以低，可能在于灭活疫苗中N蛋白激发的机体抗体不够。相反，弱毒疫苗免疫后，病毒复制过程中持续产生了大量的N蛋白，抗N蛋白抗体滴度高，所以上述ELISA的检出率很高。 参考文献：   [1] Keffaber K. Reproductive failure of unknown etiology. Am Assoc Swine Pract Newsl, 1989. 2:1-10.   [2] 郭宝清，陈章水，刘文兴.从疑似PRRS流产胎儿分离PRRSV的研究.中国畜禽传染病，1996a. (87)2:1-4.   [3] Tian K, Yu X, Zhao T, Feng Y, Cao Z, et al. (2007) Emergence of Fatal PRRSV Variants: Unparalleled Outbreaks of Atypical PRRS in China and Molecular Dissection of the Unique Hallmark. PLoS ONE 2(6): e526. doi:10.1371/journal.pone.0000526.   [4] Nelson EA, Christopher-Hennings JT and Benfield DA. Serum immune responses to the proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus. J Vet Diagn Invest, 1994, 6:410-415.   [5] Nelson EA, Chritopher-Hennings J, Drew T, Wensvoort G, Collins JE and Benfield DA. Differentiation of U.S and European isolates of porcine reproductive and respiratory syndrome virus by monoclonal antibodies. J Clin Microbol, 1993, 31:3184-3189.