猪细小病毒检测方法的研究进展

猪细小病毒检测方法的研究进展 猪细小病毒病以其危害大而备受业界的关注。目前，国内外已建立许多检测猪细小病毒的方法，主要有血凝和血凝抑制试验、荧光抗体技术、放射免疫测定、免疫微球试验、酶联免疫吸附试验、银加强胶体金技术、单克隆抗体技术、核酸探针检测技术以及多聚酶链式反应等。本文就该病检测方法的研究进展做一综述。 猪细小病毒(PPV)是以引起胚胎和胎儿感染及死亡而母体本身不显症状的一种猪繁殖障碍性传染病。临床主要现为胎儿感染死亡，产出死胎、畸形胎、木乃伊胎及不孕等症状，还可致皮炎和腹泻。PPV与2型圆环病毒(Porcinecircovirustype2，PCV2)协同感染是导致断奶子猪多系统衰竭综合征（PMWS)的主要原因之一。近年来，随着我国规模化养猪业的发展和品种的引进，PPV感染呈扩大上升的趋势，给养猪业带来了巨大的经济损失。经初步调查，我国猪群中PPV血清阳性率高达92％左右。因此，为了保障我国养猪业的健康发展，加强对本病的检测具有十分重大的实际意义。 一般情况下，如果一个猪场在同一时间内仅妊娠母猪发生流产、死胎、木乃伊胎，其他猪无明显症状，同时有证据证明是一种传染病时，应该怀疑是PPV感染，并做进一步检测。 病毒学检查 病毒的分离与鉴定 1.病料的采集和分离 70日龄以内流产胎儿、死胎、木乃伊胎及弱子的脑、肾、睾丸、肠系膜淋巴结或母猪的胎盘和阴道分泌物均可作为分离病毒的材料，以肠系膜淋巴结和肝脏分离率最高。病料加双抗处理，研磨至乳状，4℃冰箱过夜，每分钟3000转离心10分钟，取上清液-20℃保存备用。准备猪肾原代或继代细胞，待细胞生长铺满至细胞瓶的1／3时，倾倒瓶内营养液，加入已处理好的病料上清1毫升，37℃吸附1小时，期间每隔15分钟摇一次，加入无血清的维持液，继续培养3天～6天，每天观察，直至细胞出现病变。未出现病变者，盲传3代，仍没有病变弃之。若有PPV存在，培养16小时~36小时的细胞核内可观察到包涵体，3天~6天出现特征性细胞病变。病毒分离成功的关键在于是否同步接种，这是因为病毒主要在有丝分裂的S期细胞内复制，即同步接种后16小时～48小时。也有人强调在种植细胞的4小时内必须将含病毒的样品加入到培养瓶中，否则病毒增殖不理想。 2.病毒鉴定 ①电镜观察 将出现明显病变的细胞经胰酶消化后，经离心、洗涤处理，包埋成小块用锇酸固定，经脱水、浸透及醋酸铀和柠檬酸铅正性染色后电镜检查。在细胞核内可见大量的病毒粒子，呈圆形，无囊膜，大小约20nm。 ②血凝及血凝抑制试验 血凝试验：将出现病变的细胞培养物反复冻融3次，每分钟2000转离心10分钟，除去细胞碎片，在96微孔板上按1∶22、1∶23、…1∶2n倍比稀释，每孔加入50μL，再加入50μL的0．5％豚鼠红细胞混匀，4℃作用1小时~2小时判定结果，以50％的红细胞能发生凝集判为终点，样品出现凝集终点的最高稀释度定为HA滴度。血凝抑制试验：将血清在96微孔板上按1∶22、1∶23、…1∶2n的比例倍比稀释，每孔加入50μL，再加入50μL4单位的抗原混匀作用，30分钟后加入50μL的0．5％豚鼠红细胞，4℃作用1小时～2小时判定结果，以能完全抑制红细胞凝集的血清最高稀释度定为HI效价。该试验较为简单，易操作，是基层兽医检测PPV较为经典的方法。 ③间接免疫荧光法 病毒分离不适合作常规的诊断方法，因为PPV的感染性在胎儿死后会缓慢地丧失，而且分离病毒耗时很长，甚至有时培养的细胞本来就已经污染。病毒分离和鉴定是PPV感染最为确切的诊断方法，但是费时费力，并且需要一定的技术条件和设备。另外，其感染力会随着胎儿死亡时间而降低，从而限制了临床应用。 血清学方法 血凝和血凝抑制试验 1.血凝(HA)试验：该试验即使在死亡时间较长、病毒无污染性的木乃伊胎中也可检出抗原。 2.血凝抑制(HI)试验：是检测PPV抗体最常用的方法，一般采用试管法和微量法。利用HI检测人工感染PPV的猪，发现感染后5天即可以检测到相应抗体。12天～14天抗体滴度高达1024~4096，并能持续多年检出抗体。待检血清进行HI试验时需要首先进行灭活处理，然后再用红细胞吸附，以除去血清中的非特异性血凝素，再用高岭土吸附以除去或减少血清中非特异性抑制因子。该方法虽能快速、大量地诊断，但灵敏度低、特异性不强，在低滴度感染时难以检出，只能作为辅助诊断方法。 血清中和试验(SN) 血清中和试验是最经典、传统的血清学方法，它特异、敏感。其原理是利用被检血清的抗体中和PPV，然后根据培养细胞的病变情况来计算血清抗体的滴度。JOO等HI通过试验发现，SN比HI更敏感，但操作复杂。首先要进行病毒感染力的测定，才能进行中和试验，而且低剂量不能引起细胞病变，因此完成一次中和试验常需一周或更长的时间，用于临床诊断时效性太差。中和试验需要细胞培养技术和病变结果的判断，需要较高专业技术，不适于一般实验室和临床推广应用。 间接免疫荧光技术 早在1970年Cartwright等就用荧光显微镜检测细胞培养物中是否分离到了PPV。Morey等用HPVBl9囊膜蛋白单克隆抗体P92F5，以APAAP法进行免疫荧光染色，在石蜡包埋切片中检测到病毒抗原存在于胞核和胞浆中。这种方法可从长期保存的样品中检测到病毒。PPV的间接免疫荧光检测敏感、可靠，检测时间也短，一般几个小时就可完成检测。董齐等报道，将猪细小病毒高免血清和猪胎儿组织中的PPV抗原形成特异性的反应，再加兔抗猪IgG荧光抗体，建立了间接免疫荧光诊断技术，该技术应用于临床具有特异、敏感、快速的特点。 琼脂扩散试验 此法是一种操作简便、特异性较强的血清学诊断方法。可检查PPV抗原，也可检测PPV抗体。刘译等用此法取妊娠期延长，产死胎、木乃伊胎的初产母猪血清与抗原做常规琼脂扩散试验，结果均出现明显沉淀线。但GDP敏感性差，不能用于检测PPV抗原量少的样品。 酶联免疫吸附试验 1989年WesternbrinkF等建立了酶联免疫吸附试验(ELISA)，经比较证明与HI的试验结果一致，并适用于大规模的样品检查。ShiraishiT等成功地建立用滤纸采取血样、用ELISA方法检测PPV抗体的方法，此法便于样品的采集和送检。Jenkins等应用酶联免疫吸附试验检测流产胎儿组织中的分布情况。张晓根等建立了间接Dot—ELISA．PPV抗原对纯化PPV抗体的最低检出量为2．5ng／点。阳性猪血清的特异性阻断试验及交叉反应试验证明．该方法对抗原的检测具有特异性。 乳胶凝集试验(LAT) 何启盖等(1999年)将灭活的PPV经硫酸铵沉淀、透析浓缩后的病毒液致敏乳胶建立了检测PPV抗体的乳胶凝集试验诊断方法。致敏的乳胶抗原与细小病毒阳性血清反应出现凝集颗粒。乳胶凝集试验可用于对临床大量血样进行血凝抑制试验前的初选，具有简便、准确的优点。该方法的不足之处在于它所检测的抗体主要是IgM，因此只能用于疾病的定性诊断，不能进行血清抗体滴度的监测。 ELISA双抗夹心法 是一种操作简便、敏感、特异，可用于快速诊断PPV的研究。姜永厚等报道，建立了从胎猪脏器中检测抗原的ELISA双抗体夹心法，并摸索了最佳试验条件，结果认为选择胎猪病料时非常重要，以肝脏中含毒量最高。 免疫电镜试验 此法通过制备标本、负染，可在电镜下直接看到抗原抗体的复合物，从亚细胞水平上定位Ag和Ab。侯喜林等(1997年)用此法，用免疫电镜在50000倍下可清晰见到聚集成团的、大小不一的病毒颗粒，近似六角形，无囊膜，直径大小约20纳米～22纳米，与血凝、琼扩、免疫电镜试验等检查结果相符。 分子生物学诊断技术 单克隆抗体(McAb)技术 单克隆抗体具有特异性强、效价高并可在体外大量制备等特点，已成功地用于许多疾病的诊断和治疗。1984年国外研制出了PPV的McAb并用于临床诊断。国内俞太尉等成功地制备了PPVNADL-2和PPV7909株的单克隆抗体，并与ELISA结合，将其初步应用于检测猪血清中的PPV抗体，同时与HI对70份血清进行检测对比，阳性符合率为97．5％，具有很高的特异性。聚合酶链式反应(PCR) 聚合酶链式反应(PCR)诊断技术可以直接从病料中检测病原，不需病毒分离，是一种快捷敏感的诊断法。Molitor等最早在1991年报道采用聚合酶链式反应(PCR)方法诊断PPV，鉴于目前临床上常见几种疾病混合感染的情况。KimJ等报道，针对病毒基因组保守序列几对引物，应用多重PCR检测公猪精液，可同时诊断猪圆环病毒Ⅰ型和Ⅱ型以及PPV感染，该方法灵敏度高，诊断迅速，可同时检测几种病毒。李文刚、王汉中分别依照VPl、VP2序列设计引物建立了常规PCR和套式PCR检测猪细小病毒，提高了检测的特异性和敏感性，但结构蛋白基因VP1、VP2保守性不如非结构蛋白基因NSl。Soarex根据NSl序列建立nest-PCR方法检测PPV，结果表明该方法敏感性比HA高106倍。赵俊龙建立PRV和PPV复合PCR检测方法，能用于临床上两种疾病的鉴别诊断和混合感染的检测。刘业兵等针对非结构蛋白基因NSl序列建立的PCR方法，具有很强的敏感性。虽然PCR可在体外快速特异地将仅含1个拷贝的靶序列扩增106倍，但PCR扩增在引物设计及实验条件各方面要求都较高，专业性较强，且只能扩增出与引物核苷酸序列一致的部分毒株，另外，由于PPV的广泛存在以及猪体感染病毒后长期带毒的现象，很难通过PCR检测区别自然感染和疫苗株。 核酸探针技术 Krell等1988年率先将核酸探针技术用于PPV的诊断，结果最低可检出0．1pg的DNA。Koromysla报道用DNA探针能检测出实验感染母猪的木乃伊胎儿内脏悬液中的PPV。侯喜林等1997年研制出地高辛标记猪细小病毒核酸探针，运用该探针检测了多株PPV病毒及其他对照病毒，可以检出PPV最小量为40pg的DNA。核酸探针技术具有快速、敏感、特异性强等特点，特别适用于疾病的早期诊断和类症鉴别诊断，是近二十年来应用较多的一项诊断技术。它与32P标记探针具有相同的敏感性，并且克服了生物素标记探针敏感性差、背景深等缺点。核酸探针技术适于实验室进行PPV感染的诊断，但该方法的技术含量高，只能在专业实验室应用，不适合大面积临床诊断和现场应用。 银加强胶体金技术(SEC-GA) 银加强胶体金技术是近年来发展起来的一种新技术，是对三大标记(荧光素、放射性同位素和酶)的一个补充。黄瑜等首次建立了检测PPV抗原的银加胶体金染色法(SECGA)，并确定该方法操作的最佳实验条件。银加强胶体金技术(SECGA)与三大标记相比，除了其本身具有的特定大小和形状、高电子密度、颜色反应等特点外，还有以下优点：①试剂和样本用量少，每个样本只需1μL~2μL；②不需荧光显微镜、酶标仪等贵重仪器，可用光镜或肉眼观察结果，更适于临床应用；③避免了同位素的放射性污染和酶底物的致癌性作用，对人体无害；④试剂稳定，试验结果可长期保存；⑤由于省去了底物反应这一步，故与Dot—ELISA相比反应时间更短，加快了检测速度；⑥在金标过程中无共价键形成，是一定离子浓度下的物理吸附，因此几乎所有的大分子物质都能被胶体金标记，且标记后的大分子物质生物活性不发生改变；⑦胶体金再结合银染色，检测的敏感性可大大提高。当然，此技术也存在不足之处，如点样不准确会影响结果的准确性，试验所用的试剂需用去离子水配置及试验结果受主观因素影响等。 结语 由于猪细小病毒病的广泛传播给世界养猪业带来了严重危害，本病已引起各国的高度重视，相关研究也在不断展开。本病的诊断方法与技术的研究与探索也取得了显著的成绩。综上所述，用于PPV感染的诊断方法很多，各种方法具有不同的优缺点，相对而言，目前应用较多的是HA和HI试验，这两种方法基本能满足常规的病原检测和血清流行病学调查等需要。要得到病原学的确诊，则最好利用病毒分离鉴定方法，这时免疫荧光技术经常成为首选。随着对PPV基因组结构和分子生物学的进一步认识，对本病研究的进一步深入，以及国内外学者不断致力于PPV新型疫苗的研究及更为先进的诊断方法的开发。相信一些特异性强、灵敏性高、简便易行的新型检测(诊断)方法终将问世并得以推广应用。