肝靶向丹参酮ⅡA纳米注射剂的制备及其治疗肝癌的研究

nullnull肝靶向丹参酮ⅡA纳米的制备及其 治疗肝癌的研究普陀区中心医院 上海中医药大学附属普陀医院李 琦汇报内容汇报内容 研究背景 研究内容 研究结论 　项目基本情况本项目来源： 国家自然科学基金资助项目 上海市中医药科研基金项目　　　项目基本情况研究背景研究背景肝癌起病隐匿，进展迅速，生存质量差，生存期短。 中医药治疗肝癌的优势 提高生活质量 延长生存期 [1] Hashimoto K,Ikeda Y,Korenaga D,et al.Ten-year survival of patients with hepatocellular carcinoma after hepatectomy. Hepatogastroenterology,2007,54(73):163-6. [2]王 徽 ,金 刚 ,闫晓岩,等.原发性肝癌介入治疗的临床研究.实用肿瘤学杂志 2006,20(3)193-195 null丹参酮ⅡA是中药丹参的有效成分， 近年来发现具有较强的抗肝癌作用。 但其不溶于水，难以静脉给药。 口服半衰期3.63h，生物利用率低。 限制了其在肿瘤治疗中的应用。null通过制备丹参酮ⅡA纳米冻干注射剂，静脉给药： 纳米药物靶向分布在局部，缓释药物，作用时间延长，局部药物浓度提高，抗癌效果提高。 并可能解决长期以来中药及有效成分口服或静脉给药，难以在局部达到有效抗癌浓度的难题　研究内容　研究内容1.丹参酮IIA纳米粒冻干针剂制备工艺的建立 2.丹参酮IIA纳米粒药代动力学及靶向性研究 3.丹参酮IIA纳米粒体外抗肿瘤实验 4.丹参酮IIA纳米粒对小鼠肝癌的治疗作用 5.丹参酮IIA纳米粒对肝癌增殖和凋亡相关基因达的影响 6.丹参酮IIA纳米粒诱导肝癌细胞凋亡的信号转导研究药剂学研究药代动力学研究药效学研究药理学研究null 第一部分 第一部分丹参酮IIA纳米粒 冻干针剂制备工艺的建立nullA:乳化溶剂挥发法 B:界面沉淀法 C:二元溶剂分散法 D:乳化扩散法 E:界面聚合法　制备工艺：　制备工艺： 丹参酮ⅡA纳米冻干针剂注入PVA水溶液室温磁力搅拌挥发有机溶剂 丹参酮ⅡA纳米混悬液过0.8μm微孔滤膜冰浴下探头超声5min 二氯甲烷：丙酮（9：1）丹参酮ⅡA、PLA 丹参酮ⅡA纳米胶体溶液加入甘露醇 ，-40℃预冻24h冷冻干燥24h星点设计-效应面优化工艺星点设计-效应面优化工艺Add Your Text用Statistic软件包进行多元回归和非线性估计三因素五水平星点设计投药量null三因素五水平的星点设计：因素水平安排表 三因素五水平评价表三因素五水平评价表丹参酮IIA纳米粒形态丹参酮IIA纳米粒形态丹参酮IIA纳米粒圆整，分散均匀 null平均Zeta 电位 -26.67mv X-射线衍射实验：X-射线衍射实验：Tan IIA PLA TNP 证实丹参酮ⅡA纳米粒不是PLA和丹参酮ⅡA的简单物理混合， 而是形成了一种新的物相。 稳定性试验 稳定性试验 null 无突释效应，8天药物释放91.37%丹参酮ⅡA纳米药物释放曲线nullnull第二部分 体内药代动力学研究 给药后各脏器药物浓度分布（靶向性研究） 丹参酮ⅡA纳米的药动学研究null（注：两种制剂药动学参数经t检验，a P<0.05,b P>0.05）丹参酮ⅡA纳米粒药代动力学参数表药物动力学过程符合三室模型null丹参酮ⅡA纳米粒静脉给药后血浆药物浓度图丹参酮ⅡA纳米血浆药物浓度降低，体内停留时间延长丹参酮IIA纳米兔静脉给药后药物分布（靶向性研究）丹参酮IIA纳米兔静脉给药后药物分布（靶向性研究）与丹参酮ⅡA相比，丹参酮ⅡA纳米静脉给药后在肝脏和肝癌中的药物 浓度显著提高，血浆、心、肾、脾、肺等组织中药物分布明显减少nullnull 丹参酮ⅡA纳米体外抗肿瘤实验 丹参酮ⅡA纳米对小鼠肝癌的治疗作用 第三部分第三部分丹参酮ⅡA纳米 体外抗肝癌实验 null 细胞培养：人肝癌Smmc-7721细胞常规培养 生长抑制率: 采用MTT法测定 考察纳米粒中释放 的药物抗癌活性研究丹参酮ⅡA纳米对人肝癌细胞生长抑制作用丹参酮ⅡA纳米对人肝癌细胞生长抑制作用72小时IC50:6.8ug/ml丹参酮ⅡA纳米对小鼠肝癌的 治疗作用丹参酮ⅡA纳米对小鼠肝癌的 治疗作用第四部分1.小鼠肝癌模型的建立 1.小鼠肝癌模型的建立 造模七 天后2.丹参酮ⅡA纳米粒对小鼠肝癌生长抑制作用2.丹参酮ⅡA纳米粒对小鼠肝癌生长抑制作用3.生存期影响3.生存期影响各组小鼠治疗后生存天数*P >0.05 vs B-NP group; △P <0.05 vs NS group,B-NP group； △P>0.05 vs TSⅡA group; ** P <0.01 vs other groups 4.治疗后各组瘤体坏死程度比较4.治疗后各组瘤体坏死程度比较aP ＜0.05 vs TanⅡA group ; bP <0.01 vs other groups cP >0.05 vs NS groupnull生理盐水组 （×200）空白纳米组 （×200）丹参酮ⅡA组 （×200）丹参酮ⅡA纳米低剂量组 （×200）丹参酮ⅡA纳米中剂量组 （×200）丹参酮ⅡA纳米高剂量组 （×200）nullnull 丹参酮IIA纳米粒对肝癌细胞增殖和凋亡相关 基因表达的影响 丹参酮IIA纳米粒调控p38MAPK信号通路诱导肝 癌细胞凋亡的研究 null第五部分丹参酮IIA纳米粒对肝癌细胞增殖 和凋亡相关蛋白表达的影响1. 对小鼠肝癌细胞凋亡的影响1. 对小鼠肝癌细胞凋亡的影响 小鼠原位肝癌治疗后7天 采用TUNEL 标记技术细胞凋亡指数null 治疗后各组凋亡指数*P >0.05 vs B-NP group; △△P <0.01 vs TSⅡA group，TS-NP L group ; △P >0.05 vs TSⅡA group ; **P <0.01 vs other groupsnull治疗后肝癌组织p38MAPK信号蛋白表达 *P >0.05 vs B-NP group; ** P <0.01 vs other groups 治疗后肝癌组织p38MAPK信号蛋白表达 治疗后肝癌组织TGF-β1蛋白表达 治疗后肝癌组织TGF-β1蛋白表达 *P >0.05 vs NS group; ** P <0.01 vs other groups治疗后肝癌组织CyclinE蛋白表达 治疗后肝癌组织CyclinE蛋白表达 与生理盐水组和空白纳米组比较，** P <0.01； 与丹参酮ⅡA组组比较，△△P <0.01。null第六部分丹参酮IIA纳米调控p38MAPK 信号转导诱导肝癌细胞凋亡的研究null丹参酮IIA纳米粒诱导肝癌细胞凋亡的作用 丹参酮IIA纳米粒对肝癌细胞周期的影响null生理盐水组空白纳米组丹参酮ⅡA组丹参酮ⅡA纳米低剂量组 丹参酮ⅡA纳米中剂量组 丹参酮ⅡA纳米高剂量组 null丹参酮IIA纳米对肝癌细胞p38MAPK信号通路激活作用 null丹参酮IIA纳米对人肝癌细胞p38MAPK信号通路激活作用 null阻断p38信号通路对凋亡的影响 阻断p38信号通路对细胞周期的影响p38MAPK信号通路对肝癌细胞凋亡的影响提示:丹参酮ⅡA纳米通过肝癌细胞内p38MAPK信号转导途径诱导细胞凋亡调控细胞周期nullp38MAPK对人肝癌细胞Fas、caspase-3表达的影响 Fas、caspase-3 扩增曲线结 论结 论建立了丹参酮ⅡA纳米粒冻干针剂的制备方法和质量评价方法。 与丹参酮ⅡA相比，丹参酮ⅡA纳米静脉给药后在肝脏和肿瘤中的药物 浓度显著提高，血浆、心、肾、脾、肺等组织中药物浓度明显降低；纳 米中的药物持续释放长达8天以上；药物动力学过程符合三室模型，具有 肝靶向和缓释特性。 丹参酮ⅡA以纳米剂型给药，抗癌效果明显增强。 丹参酮ⅡA纳米通过调控 p38MAPK信号转导诱导肝癌细胞凋亡、阻滞肝 癌细胞于G0/G1期, 并降低TGFβ1、Cyclin E的表达抑制细胞增殖。 通过激活p38MAPK信号通路上调Fas、caspase-3 mRNA表达是丹参酮 ⅡA 纳米粒诱导肝癌细胞凋亡的重要机制之一。本项目主要产出本项目主要产出发表9篇（国内期刊7篇，SCI 2篇） 申请国家发明专利 1项 获上海市科技成果 1项 获上海医学科技奖二等奖 1项 培养研究生3名一、发表论文一、发表论文Novel polymeric microspheres containing norcantharidin for chemoembolization. Journal of Controlled Release, 2006，116(1):35-41. SCI (4.756) 9. Novel Polymeric Nanoparticles Containing TanshioneⅡA for The Treatment of hepatoma.Journal of Drug Targeting, 2008. SCI (2.03) 丹参酮ⅡA及其纳米粒诱导肝癌细胞凋亡及对p38MAPK、 TGFβ1信号蛋白表达的影响. 肿瘤,2008,28(1) 丹参酮ⅡA纳米粒治疗小鼠肝癌及其对Cyclin E表达影响. 上海中医药杂志，2007，41(9):74-77. 纳米中药治疗肿瘤的研究. 中西医结合学报，2007,4(4):378-383. 丹参酮ⅡA纳米粒治疗肝癌的实验研究. 全国肝胆胰肿瘤学术会论文集,2007,12 南宁 大鼠移植性肝癌模型的制作. 第二军医大学学报，2002,23(10):1074 载药纳米粒在肝癌治疗的应用. 中成药，2008.475-478 丹参酮ⅡA调控p38MAPK信号通路诱导人肝癌细胞凋亡及其相关基因的作用.世界华人消化杂志,2008,10.525-527二、专利二、专利国家发明专利 　丹参酮ⅡA聚乳酸纳米及其制备方法　　　　　申请号200710041027.5三、成果鉴定三、成果鉴定2007年12月24日通过上海市科技成果鉴定 国内领先，部分国际先进水平四、获奖情况四、获奖情况2007年第六届上海医学科技奖（二等奖） null