灯冰注射液对家兔血小板聚集功能的影响

36 云 南 中 医 中 药 杂 志 2008年第29卷第2期 灯冰注射液对家兔血小板聚集功能的影响 叶宏军，卞慧敏，陆凯磊，姜 淼，仇锦春 (南京中医药大学，江苏 南京 210029) 摘 要：目的：研究灯冰注射液对血小板聚集率的影响。 方法：家兔耳缘静脉注射灯冰注射液及体外给药，用比浊法检 测家兔血小板在不同的诱导剂作 用下的聚集率。结果：灯冰 注射液注射给药能降低二磷酸腺苷(ADP)、血小板活化因子 (PAF)、花生四烯酸(AA)诱导的血小板聚集率；体外给 药能 降低 ADP诱导的血小板聚集率。结论：灯冰注射液具有抑制 血小板聚集的作用。 关键词：灯冰注射液；血小板聚集；二磷酸腺苷；血小板活 化因子；花生四烯酸 中图分类号：R285．5 文献标识码：A 文章编号：1007--2349(2008)02--0036--03 灯冰注射液(DBI)由灯盏花素与冰片组成的新的中药复 方制剂，具有开窍、活血祛瘀、止痛的作用，用于心肌缺血、中 风及其后遗症等疾病的治疗。上述疾病中，血小板的过度活 化是其重要的因素之一，现为血小板聚集、粘附率及血小板 内活性物质释放增加。本试验观察了DBI对血小板聚集功能 的影响。 1 材料与方法 1．1 药物 灯冰注射液 ，100m1．瓶～，批号 20060405，由南 京中医药大学中医药研究院植物药中心提供；阳性对照药：阿 斯匹林，25mg．片～，批号 040506，南京恒生制药厂生产 。 1．2 动物 大耳白家兔，体重 2．0～2．5kg，雄性，由南京江宁 县汤山青龙山动物繁殖场提供，实验动物生产许可证： (苏)2002--0027，实验动物使用许可证：SYXK(苏)2005--0009。 1．3 试剂 血小板活化因子(PAF)：规格 lmg／支，批号 74389 — 68—7，由 sigma公司生产；二磷酸腺苷(ADP)：规格 0．5g． 瓶～，批号：990527，上海伯奥生物科技有限公司；花生四烯酸 (AA)：规格 lOOmg．瓶～，批号：044K1372，由 sign"fit公司生产； 柠檬酸三钠：规格 500g．瓶～，批号030413，AR，上海凌峰化学 试剂有限公司、常熟市永华精细化学品有限公司生产。 1．4 仪器 PAPER--I型血小板聚集及血凝测定仪，北京世帝 科学仪器公司生产；LDZS--2离心机，北京医用离心机厂生产。 1．5 方法 1．5．1 家兔在体血小板聚集实验 家兔 30只，随机分为5组： 正常对照组(耳缘静脉注射等容积生理盐水)；阳性对照组阿斯 匹林(3．5mg．kg- )灌胃给药；DBI高剂量(4mg．kg )、中剂量 (2mg．kg )、低剂量(1mg．kg )耳缘静脉注射给药。每日1 次，连续 3d。血小板聚集率检测：参照文献方法L1]，于第 3d给 药后 20min(阳性对照组于给药后 60rain)颈动脉取血，枸橼酸钠 (3．8 )1：9抗凝，以 lO00n nlin_ 离心 1On min- ，取富血小板 血浆(PRP)，剩余部分以3000nmin- 离心，取贫血小板血浆 (PPP)，聚集诱导剂用 PAF(终浓度 0．38g．g／ml )、ADP(终浓 度 5．54p．g．ml )、AA(终浓度 76．90p．g．ml )。用 P 一I O 'O A A一对照品色谱图； 表 2 新止咳合剂中甘草苷的含量测定 O 'O B 一 供试品色谱图； a一甘草苷 图 1 高效液相色谱图 3 讨论 甘草苷是甘草中主要的活性成分之一，也是新止咳合剂 治疗疾病的重要成分，故选择该物质作为考察指标。 试验 中曾使用过色谱柱 Alltech Apollo Cl8(4．6mm× 250mm，5Ⅱm)和 phenomenex C,8 ODS3 110A (4．6mm × C C一阴性对照色谱图(缺甘草的新止咳合剂) 250mm，5舯 )，均能用于新止咳合剂中甘草苷的含量测定，但 理论板数不得低于 5000。 本法简便、快速、专属性强、重现性好，可作为新止咳合剂 的质量控制方法。 参考文献： [13云南省食品药品监督管理局医疗机构再注册批件( 2006007)． [2]国家药典委员会 ．中华人民共和国药典(一部)[M]．北京：化学工 业出版社 ，2005．59． (收稿 日期 ：2007一O7—25。) ∞ 侣 ∞ 。 。 { 维普资讯 http://www.cqvip.com 2008年第29卷第2期 云 南 中 医 中 药 杂 志 37 型血小板聚集及血凝测定仪测定血小板 lmin、5min、max聚集 率，并按下述公式计算抑制率。 血小板聚集抑制率( )= 塑堡鱼坐筹纛羞盖示蓑蘩羹 ×1oo 1．5．2 家兔体外血小板聚集率测定方法 大耳自家兔 ，雄 性 ，用利多卡因局部麻醉 ，颈动脉插管放血，3．8 的枸橼酸钠 1：9抗 凝，以 1000r．min 离 心 lOmin，取 富 血 小 板 血浆 (PRP)，剩余部分以 3000r．rain 离心，取贫血小板血浆 (PPP)，聚集诱 导剂用 ADP(终 浓度 5．54 g．ml )。每管 250~1 PRP中加入不同浓度 的药物 10 1，对照组 PRP中加入 生理盐水 10ul，37℃温 育 5min，然后 加入 5．54 g．ml_1的 ADP10~I，检测血小板聚集率，并计算药物的半数抑制浓度 (IC5o)。 1．6 统计学方法 实验数据以 ±S表示 ；使用 SPSSI1．5 统计软件 ，进行方差分析(q检验)。 2 结果 2．1 DBI对 AA诱导 的家兔在体血小板 聚集率的影响 与 空白对照组比较，DBI耳缘静脉给药高、中、低 3个剂量均能 显著抑制 从 诱导的家兔血小板的最大聚集率，对 lmin、5min 的聚集率也有不同程度的抑制作用；但较 阳性药阿司匹林组 弱，见表 1。 表 1 DBI注射给药对 AA诱导的家兔血小板聚集的影响( ±s) 空白对照 一 6 27．99~4．52## 28．6~2．86## 63．68_+2．95## 阿司匹林 3．50 6 20．36~3．04 32．00_+8．80 37．44~6．07 41．21 DB1高剂量 4．00 6 26．69~5．62 45．52~5．09 # 48．19~4．31 ##24．32 DB1中剂量 2．00 6 21．82土2 45 45．81_+7．o6 # 49．7613．31 ##21．86 DB1低剂量 1．00 6 24．42~4．59 46．6613．o0## 51．73_+3．38 ##18．77 注：与空白组比较 P<0．05，”P<0．01；与阳性药阿司匹林 比 较 P<0．05， P<0．01 2．2 DBI对 ADP诱导的家兔在体血小板聚集率的影响 与 空白对照组比较，DBI静脉给药高、中、低 3个剂量均能明显 抑制ADP诱导的家兔血小板的lmin及最大聚集率，高、中剂 量对5min聚集率有显著的抑制作用；与阳性药阿司匹林组比 较 ，高、中、低 3个剂量对 lmin时的血小板聚集率无显著性差 异，高剂量组的最大聚集率也无显著性差异，见表 2。 表2 DB[注射给药对ADP诱导的家兔血小板聚集的影响( ±s) 空白对照 阿司匹林 DBI高剂量 ⅨⅪ中剂量 ⅨⅡ低剂量 6 36．38±4．13# 65．70±7．94## 3．50 6 27．87±3．27 35．25±6．O6— 4．00 6 26．58~3．58 22．2I~1I．2O # 2．00 6 28．49~2．61 5O．60±＆34 ## 1．00 6 27．59±2．18 61．o0±5．47## 74．2O±4．74## 41．15±4．71 44．54 37．75±9．45 46．76 54．5o±6．49 ## 26．55 65．55土5．02*料 11．66 注：与空 白组 比较 P<0．05，”P<0．01；与阳性药阿司匹林 比 较 P<0．01 2．3 DBI对 PAF诱导的家兔在体血小板聚集率的影响 与 空白组比较，DBI静脉给药高、中、低 3个剂量均能明显抑制 PAF诱导的家兔血小板的 lmin、5min及最大聚集率；与阿司 匹林组比较，DBI高剂量组对 lmin、5min及最大聚集率与阿 司匹林组均无显著的差异，见表 3。 表 3 DBI注射给药对 PAF诱导的家兔血小板聚集的影响( ±s) 空白对照 6 37．51_+5．83# 69．70i7．15## 78．74d：2．273## 阿司匹林 3．50 6 27．03~1．19 45．10d：4．11 50．44~3．12 35．94 ⅨⅪ高剂量 4．00 6 29．14~2．87 4＆14~5．4o 52．97±4．83 32．73 DBI中剂量 2．00 6 30．69~4．09 51．90_+3．57 # 58．38±&98 ## 25．86 DR低剂量 1．00 6 27．35~5．78 55．O9±6．61 #61．06+_4．81 ## 22．45 注：与空白组 比较 P<0．05， P<0．01；与阳性药阿司匹林 比 较 P<0．05，～P<0．01 2．4 DBI对 ADP诱导的家兔体外血小板聚集率的影响 体 外 给 药 DBI终 浓 度 为 296．3,ug．ml-。、148．15 g．ml-。、 74．07 g．ml 对家兔血小板的最大聚集率均有明显的抑制作 用。且作用与剂量间呈依赖关 系：y一一0．0373x+45．516；r 一0．9699，见表 4、图 1。 表4 DBI对ADP诱导的家兔离体血小板聚集的影响( ±s) 空白对照 4 23．60_+i．04 44．s±3．59 46．33~2．53 599．40 296．30 4 20．O1±1．8o 3O．65±4．12 34．98±3．O8 24．5o 一 14&15 4 23．05±2．52 36．43±1．21 39．65±O．77 14．42 嘲 74．O7 4 22．83±2．90 4o．3O±1．45 4O．98士1．63 11．55 37．o4 4 25．O5±4．O2 41．45±6．54 44．93±2．82 3．O2 、√ 瓣 ， 注：与空白组比较*P<0．05，”P<0．01 50 0 — ’ — 、 、 ● Y= 0．0373x+45．52 R‘= 9406 0 l00 200 300 400 药物终浓度( g／m1) 图 1 DBI对 ADP诱导的家兔体外血小板聚集的影响 3 讨论 血小板是一种多功能细胞，具有粘附、聚集和释放功能 ， 在血栓形成与止血过程中起着重要作用。心肌缺血 、脑梗塞 等心脑血管疾病均具有血小板聚集 释放功能亢进、血小板聚 集率增高等现象。本试验结果表明：DBI注射给药对 ADP、 PAF、从 诱导血小板聚集均具有不同程度的抑制作用，体外 也有抑制 ADP诱导的血小板聚集作用，这可能是其治疗心肌 缺血、脑梗塞及其后遗症等心脑血管疾病的作用途径之一。 ADP、从 、PAF是体内的活性物质。血小板聚集主要存 在 ADP、血栓素 A2(TXA2)与血小板激活因子(PAF)三条途 径。ADP通过和血小板膜表面上的特异性受体的结合，增加 三磷酸肌醇(IP。)量，动员胞内贮存的钙离子(Ca抖)释放到细 胞质中，使胞内 Ca2 浓度升高，而使血小板活化，引起血小板 粘附、聚集l_2 ]。在组织缺血时，受损组织释放出 AA，通过环 氧化酶途径转变为前列腺素环内过氧化物(PGG ，PGH。)，进 维普资讯 http://www.cqvip.com 云 南 中 医 中 药 杂 志 2008年第29卷第2期 虫草参芪口服液质量标准的研究 安景斌 ，王 海 (1．河南省登封市医保中心，河南 登封 452470；2．河南省登封市三康医院，河南 登封 452470) 关键词：虫草参芪口服液；质量标准；含量测定 中图分类号：R927．11 文献标识码：A 文章编号：1007--2349(2008)02--0038--02 虫草参芪口服液由冬虫夏草、黄芪、丹参、人参、麦冬等组 成。具有补气养血 、益 肾助 阳之功效 ，用于气血亏虚、肾阳不 足所致的气短懒言，身倦乏力，头晕眼花等症。为制定本品质 量标准，本实验应用 TLC法对本品中主要药物进行了定性鉴 别 ，并用薄层扫描法测定 了本品中主要有效成分黄芪甲苷的 含量。结果表明该法稳定可行，回收率高，重现性好，适宜作 为虫草参芪口服液的质量控制方法。 1 仪器与试药 I．I 仪器 CS一9301型双波长薄层扫描仪(日本岛津公 司)；CQ一5ooJ型超声波仪(上海超声波仪器厂)；PBQ— I型 薄层铺板仪 (重庆南岸新力实验 电器厂)；定量毛细管 (美国 Drummond公司)。 1．2 试药 薄层层析用硅胶G(德国Merck)；黄芪甲苷、原儿 茶醛及人参皂苷Rgm、Re对照品(中国药品生物制品检验所)； 虫草参芪口服液(青海三普药业股份有限公司)；其他试剂均 为分析纯。 2 定性鉴别 2．1 枸杞的鉴别 取本品 10ml，加醋酸乙酯提取 2次，每次 2OInl，合并提取液，蒸干，残渣用醋酸乙酯 Iml使溶解，作为供 试品溶液；另取枸杞子对照药材 0．5g，加水 35ml，加热煮沸 15min，放冷，滤过，滤液用醋酸乙酯提取 2次，每次 15ml，合并 提取液，蒸干，残渣用醋酸 乙酯 lml使溶解，作为对照药材溶 液；照薄层色谱法(中国药典 2005年版附录ⅥB)试验，吸取供 试品溶液和对照药材溶液各 5ul，分别点于同一硅胶 G薄层板 上，以醋酸乙酯一氯仿 一甲酸(3：2：1)为展开剂，展开，取出， 晾干，置紫外光灯(365nm)下检视，供试品色谱中，在与对照 药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。 2．2 人参的鉴别 取本品 50ml，用水饱和的正丁醇提取 2 次，每次30ml，合并正丁醇液，用 3倍量氨试液提取 2次，弃去 氨液，正丁醇液用正丁醇饱和的水洗 2次，每次 3OInl，蒸干正 丁醇液，残渣加甲醇 lml使溶解，作为供试品溶液；取人参对 照药材粉末 1g，加乙醚40ml，加热回流 1h，弃去乙醚液，药渣 挥干，用水 0．5ml拌润，加水饱 和的正丁醇 10ml，超声提取 30min，吸取上清液，加 3倍量氨试液(4O～100)摇匀，放置分 层，取上层液蒸干，残渣加甲醇 lml使溶解 ，作为对照药材溶 液；另取按处方量及制备工艺制备的虫草参芪 口服液空 白(缺 人参药材)，同法制成阴性对照溶液；另取人参皂苷 Rgl对照 品加 甲醇制成每 lml含 0．5mg的溶液 、人参皂苷 Re对照品 加甲醇制成每 1mL含0．4mg的溶液作为对照品溶液；照薄层 色谱法(中国药典 2005年版一部附录ⅥB)试验 ，吸取供试品 溶液 6ul、阴性对照溶液 1O 1、对照品溶液各 2 1和对照药材 溶液 4／A，分别点于同一硅胶 G薄层板上，以氯仿一醋酸乙酯 一 甲醇一水(15：40：22：10)10℃下放置的下层溶液为展开剂， 展开，取出，晾干，喷以 1O 硫酸乙醇试液，在 105℃加热至斑 点清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显 相同颜色的斑点。在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜 色的一个斑点 。而阴性色谱中无相应斑点出现。 2．3 丹参的鉴别 取本品 10ml，用稀盐酸调 PH值至 2，用 醋酸乙酯提取 3次，每次 10ml，合并醋酸乙酯液，蒸干，残渣加 醋酸乙酯 Iml使溶解 ，作为供试 品溶液 ；另取丹参对照药材 1g，加水适量煮沸 30min，放冷，滤过，滤液加水至 10ml，用稀 盐酸调PH值至2，加醋酸乙酯提取2次，每次15ml，合并醋酸 乙酯液，蒸至 lml，作为对照药材溶液 ；另取按处方量及制备工 艺制备的虫草参芪 口服液空 白(缺丹参药材)，同法制成阴性 对照溶液；另取原儿茶醛对照品加甲醇制成每 lml含 lmg的 溶液作为对照品溶液；照薄层色谱法(中国药典 2005年版一 部附录ⅥB)试验，吸取供试品溶液 1O 1、阴性对照溶液 1O 1、 对照品溶液 1>1和对照药材溶液 4／A，分别点于同一硅胶 G薄 层板上，以氯仿一醋酸乙酯一苯一甲酸(5：6：3：1)为展开剂 ， 展开，取出，晾干，喷以1O FeC1。乙醇试液，吹干。供试品色 而增加血栓素 A2(T )的生成[4]。在脑梗塞、心肌梗死患 者中，PAF的产生是明显增加的_5]。在上述血小板活化途径 中，ADP促进 TX 生成，而 TXAz与 PAF可进一步促进 ADP释放，因此 ADP途径居于重要地位l_6J。本实验观察到 DBI对ADP诱导的血小板聚集抑制作用比AA、PAF诱导的 血小板聚集抑制作用强，且对 ADP诱导体外血小板聚集亦有 抑制作用，并具有明显的量效关系，提示 DBI抑制血小板聚集 作用可能主要通过 ADP途径 ，但究竟是影响血小板膜上 ADP 受体 ，还是影响血小板内颗粒成分的释放，尚待进一步研究。 参考文献 ： [1]翁维良，瘳福龙，吴云鹏 ．血液流变学研究方法及其应用[M]．北 京：科学出版社，1989．224． [2]谭载友，江涛，唐 春萍，等 ．阿魏酸川 芎嗪的抗 血小板聚集作 用[J]．中国新药杂志，2003，12(7)：529~531． [3]陈涛，王歆，瞿永华 ．磷脂酶 C对 ADP诱导的兔血小板 IP3水平 的影响[J]．中国药理学通报，2005，21(10)：l176～1179． [4]蒲传强，郎森阳，吴卫平 ．脑血管病学[M]．北京：人民军医出版 社 ，1999．115． [5]孙洪涛，顾成东，李刚，等 ．血小板活化因子在心肌梗死患者中的 水平变化[J]．中国急救医学，2006，26(2)：1O4～106． [6]李家增，贺石林 ．血栓形成与临床医学[M]．长沙：湖南科学技术 出版社，1991．119． (收稿 日期 ：2007一l0—01。) 维普资讯 http://www.cqvip.com