原位分子杂交流程

原位分子杂交流程 材料：脑片、标记好检测好的探针 仪器：恒温烤箱、摇床、切片杂交盒（20ml）、染缸、湿盒、水浴恒温培养箱、恒温摇床 试剂配方： 1、​ DEPC水（1000ml，RNAse-free，121℃60min，4℃贮存）: 蒸馏水:1000ml /DEPC:1ml/搅拌过夜或者37℃2小时。 2、​ 1 M Tris-HCl（pH7.5，500ml，RNAse-free，121℃30min，4℃贮存）: Tris Base: 60.55g/DEPC水: 400ml/烧杯中搅拌/11.6N HCl (37%):35ml/调PH/DEPC水定容。 3、​ 1 M Tris-HCl（pH8.0，500ml，RNAse-free，121℃30min，4℃贮存）: Tris Base: 60.55g/DEPC水: 400ml/烧杯中搅拌/11.6N HCl (37%):21ml/调PH/DEPC水定容。 4、​ 1 M Tris-HCl（pH9.5，500ml，RNAse-free，121℃30min，4℃贮存）: Tris Base: 60.55g/DEPC水: 400ml/烧杯中搅拌/11.6N HCl (37%):10ml/调PH/DEPC水定容。 5、​ 10% SDS（1000ml，RNAse-free）: SDS:100g/DEPC水900ml/烧杯中68℃搅拌助溶/ DEPC水定容。 6、​ 0.1M DP-PBS（1000ml，RNAse-free，121℃60min，4℃贮存）: 0.2M PB（PH:7.4）:500ml/蒸馏水:300ml/NaCl:8.5g/蒸馏水定容/DEPC:1ml/搅拌过夜。 7、​ 20×SSC（pH4.5，1000ml，RNAse free，121℃30min，4℃贮存）: NaCl: 175.3g/柠檬酸钠:88.2g/水:800ml/柠檬酸调PH:1水/无水柠檬酸约14.6/10g/水定容后，加入0.1%DEPC处理过夜，高压灭菌。 8、​ 2N HCl/DEPC水（100ml，10×，4℃贮存，临用前用DEPC水稀释）: 浓盐酸（11.6N）:17.2ml/DEPC水定容。 9、​ 蛋白酶K（1ml，1000×，2mg/ml，-20℃贮存）: 蛋白酶K（Merck）:2mg/DEPC水:1ml。 10、0.1M TEA（100ml，新鲜配制或配制不含乙酸酐的溶液，临用前加入，4℃贮存）: DEPC水:90ml/1M三乙醇胺:1.49ml/浓盐酸:0.21ml/DEPC水定容/乙酸酐:0.25ml。 11、10×TBST（500ml，1×TBST临用前用蒸馏水稀释，4℃贮存）: 无菌水:300ml/1M Tris-HCl(pH7.5):125ml/NaCl:40g/KCl:0.1g/Tween-20:50ml/搅拌/定容。 12、Denhardt’s液（50ml，100×，RNAse free，-20℃贮存）: 聚蔗糖:1g/聚乙烯吡咯烷酮:1g/牛血清白蛋白:1g/DEPC水:500ml 13、杂交液（10ml，RNAse free，-20℃贮存）: 去离子甲酰胺:5ml/20XSSC:2.5ml/加热到50℃/硫酸葡聚糖:1g/50℃混合溶解/100×Denhardt’s液:500ul/10%SDS:500ul/10mg/ml变性过的鲑精DNA:100ul/DEPC水定容。 14、Solution X（200ml，4℃贮存）: 无菌水:50ml/20×SSC:20ml/甲酰胺:100ml/10% SDS:20ml/搅拌加热助溶/无菌水定容。 15、1.5%BBR（100ml，4℃贮存）: 灭菌水:60ml/1 M Tris-HCl（pH7.5）:10ml/NaCl:0.876g/胎牛血清:4ml/灭菌水定容。 16、4% PFA/DP-PBS（100ml，RNAse free，提前一天配制，4℃暂存）: 多聚甲醛:4g/0.1M DP-PBS:80ml/70℃搅拌过夜/过滤/0.1M DP-PBS定容。 17、NTMT（150ml，4℃贮存）: 灭菌水:100ml/NaCl:0.8775g/1 M Tris-HCl（pH9.5）:15ml/MgCl2:1.525g/Tween-20:1.5ml/搅拌混匀/左旋咪唑:79.2mg/灭菌水定容。 18、显色液（1ml，现用现配，4℃避光暂存）: NTMT:1ml/NBT（50mg/ml）:5ul/BCIP（50mg/ml）:3.75ul/吹打混匀。 19、anti-DIG（1ml，1:1000，现用现配）: 1.5%BBR:1ml/ Anti-Digoxigenin-AP，Fab fragments（0.75U/ul，Roche）:1ul/吹打混匀。 剥离硅烷处理过RNAse-free的盖玻片： 重铬酸钾-浓硫酸过夜，自来水冲洗，蒸馏水漂洗，180℃干烤4hr，过剥离硅烷（乙醇稀释50%）。 步骤： 第一天：（RNase-free） 检查各溶液充裕、仪器空闲后开始实验。打开37℃水浴锅，调好杂交箱温度，预热杂交液。 a、-70度中取出脑片50℃×15 min；（记录编号） b、4% PFA/DP-PBS×15 min，室温静置； c、0.1M DP-PBS×5 min×3，室温摇动； d、0.2N HCl/DP-H2O×10 min，室温静置； e、0.1M DP-PBS×5min×3，室温摇动；（配制蛋白酶K，用DP-PBS将原液1000倍稀释） f、蛋白酶K（2ug/ml）37℃×15 min，恒温水浴静置； g、4% PFA/DP-PBS×15 min，室温静置；（不是PBS洗！） h、0.1M DP-PBS×5 min×3，室温摇动； i、0.1M TEA×10 min，室温摇动； j、0.1M DP-PBS×5 min×3，室温摇动； k、DEPC水×10 min，室温摇动；（至此步共约需160分钟） l、预杂交×37-60℃×1 hr，80ul/片，盖片盖住，放入杂交箱内预热的湿盒中；（不要有气泡） m、用预热的杂交液稀释探针（1:100-200），65℃×5min（PCR仪或水浴锅中）； n、杂交×37-60℃×12-16 hr，80ul/片，盖片盖住，放杂交箱内的湿盒中；（不要有气泡） 最好半个小时或一个小时后检查片子平不平稳，稍作调整。 第二天：（不必RNase-free） a、Solution X ×37-60℃×5min (加热至所需温度后再将去掉盖片的片子放入)； b、Solution X ×37-60℃×45min×3，空气浴恒温摇床中摇动（80-100rpm）； c、1×TBST×15min×3，室温摇动； d、BBR×1hr，室温静置； e、anti-DIG(1:1000)×2hr，80ul/片，放入湿盒中室温静置； f、1×TBST×15min×3，室温摇动； g、NTMT×10min，室温摇动； h、显色液室温显色12-48小时，每小时检查显色情况，如显色液变成浅紫红色，则需要换液，换液前需要用NTMT×15min×2，室温摇动； i、显色充分的片子NTMT×15min×2； j、蒸馏水×5min×2； k、4% PFA/DP-PBS×30min或过夜； l、蒸馏水×5min×2；（若空气中晾干则可以直接放入95%乙醇） m、75%乙醇涮洗1min； n、95%乙醇涮洗1min×2； o、​ 100%乙醇涮洗1min×3； p、二甲苯5 min×2； q、树脂封片； r、50度烘烤2小时以上； s、室温干燥阴凉储存。